Combinaison d'imagerie Raman et analyse multivariée pour visualiser la lignine, la cellulose et l'hémicellulose dans le mur de cellules végétales

Résumé

Ce protocole vise à présenter une méthode générale pour visualiser la lignine, la cellulose et l'hémicellulose dans les parois des cellules végétales en utilisant l'imagerie Raman et l'analyse multivariée.

Résumé

L'application de l'imagerie Raman à la biomasse végétale augmente car elle peut offrir des informations spatiales et de composition sur des solutions aqueuses. L'analyse ne nécessite généralement pas une préparation approfondie des échantillons; Des informations structurelles et chimiques peuvent être obtenues sans étiquetage. Cependant, chaque image Raman contient des milliers de spectres; Cela soulève des difficultés lors de l'extraction d'informations cachées, en particulier pour les composants ayant des structures chimiques similaires. Ce travail présente une analyse multivariée pour résoudre ce problème. Le protocole établit une méthode générale pour visualiser les principaux composants, y compris la lignine, la cellulose et l'hémicellulose dans la paroi cellulaire de la plante. Dans ce protocole, des procédures pour la préparation des échantillons, l'acquisition spectrale et le traitement des données sont décrites. Il dépend fortement des compétences de l'opérateur lors de la préparation des échantillons et de l'analyse des données. En utilisant cette approche, une enquête Raman peut être effectuée par un utilisateur non spécialisé pour acquérirDonnées de qualité h et résultats significatifs pour l'analyse de la paroi cellulaire végétale.

Introduction

Plant biomass is the most abundant renewable resource on Earth; is mainly composed of lignin, cellulose, and hemicellulose; and is considered an attractive source of bioenergy and bio-based chemicals¹. Unfortunately, it can resist degradation and confer hydrolytic stability or structural robustness to the plant cell wall. Such resistance is attributable to the accessible surface area, biomass particle size, degree of polymerization, cellulose crystallinity, and protective lignin². A comprehensive understanding of the structural and chemical nature of the plant cell wall is thus significant from the viewpoint of plant biology and chemistry, as well as from that of commercial utilization. Commonly used wet chemistry analyses, such as chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy, only provide average compositional data of the measured sample. Furthermore, these methods are invasive and destroy the original structure of the plant tissue³.

The Raman imaging technique is a powerful tool for the nondestructive visualization of spatially resolved chemical information⁴. It uses a laser light to cause inelastic scattering with a photon and relies on changes in polarizability arising from the molecular vibrations. In this case, water causes weak Raman scattering, which makes this approach suitable for in situ investigations of biological samples⁵. The application of the Raman imaging technique to the plant cell wall can elucidate the structure and composition of plant cell walls in their native state, with the resolution on the scale of the single cell and even of the cell wall layers⁶. A typical Raman imaging analysis of a plant cell wall generally consists of three steps: 1) sample preparation, 2) spectral acquisition, and 3) data processing.

Although one of the major advantages of Raman imaging is the ability to achieve label-free and non-destructive spectra with minimal sample preparation, physical sample sectioning is still necessary to expose the surface of interest. This process should be performed carefully to obtain a flat surface, since the technique depends on maintaining optical focus⁷. Spectral acquisition requires a balance between image quality and extensive acquisition times⁸. Data processing aims to effectively extract the chemical information from the image data, especially for the components with similar chemical structures, such as cellulose and hemicellulose. Due to the strong spectral overlap, the exact spectra are difficult to discern. In this case, multivariate analysis is a straightforward approach to effectively uncover the hiding structural and chemical information⁹. This work presents a general protocol describing the use of Raman imaging to visualize the main components in plant cell walls, including lignin, cellulose, and hemicellulose.

Protocole

1. Préparation de l'échantillon

1. Couper un petit bloc de tissu (environ 3 mm x 3 mm x 5 mm) de l'échantillon de la plante ( p. Ex. Une tige de peuplier).
2. Immerger le tissu dans de l'eau désionisée bouillante pendant 30 min. Immédiatement, transférez-le à de l'eau désionisée à température ambiante (RT) pendant 30 minutes. Répétez cette étape jusqu'à ce que le tissu s'enfonce au fond du conteneur, ce qui indique que l'air dans le tissu a été enlevé et que le tissu a été ramolli.
   Remarque: Pour les échantillons qui tombent au bas avant cette étape, répétez généralement ce cycle de 3 à 5 fois.
3. Préparez des portions aliquotes de 20, 50, 70, 90% (v / v) de polyéthylène glycol (PEG) dans de l'eau désionisée, ainsi que du PEG pur, et conservez les solutions à 65 ° C.
4. Incuber le tissu dans une série de bains PEG gradués pour déplacer l'eau et permettre au PEG de s'infiltrer.
   Remarque: Généralement, le PEG avec un poids moléculaire 2 000 (PEG2000) est utilisé pour l'encastrement.
   1. Traiter le tissu avec gPEG radié dans un four à sécher comme suit: (a) 20% de PEG pendant 1 h, (b) 50% de PEG pendant 1,5 h, (c) 70% de PEG pendant 2 h, (d) 90% de PEG pendant 2 h et (E) 100% de PEG pendant 10 h.
5. Préchauffer une cassette à 65 ° C dans un four. Versez le PEG contenant le bloc dans la cassette, puis placez le bloc de tissu dans une position désirée en utilisant des pinces ou des aiguilles préchauffées.
6. Ralentir lentement la cassette et ranger le tissu à la température ambiante jusqu'à ce qu'il soit utilisé.
7. Dissectionnez le bloc PEG contenant le tissu cible dans un petit bloc (environ 1 cm x 1 cm x 2 cm) à l'aide d'une lame de rasoir pointue et montez-le sur le microtome.
8. Couper les sections minces du bloc PEG (généralement 3-10 μm).
9. Rincez la section avec de l'eau désionisée dans un verre de montre 10 fois pour enlever le PEG du tissu.
10. Immergez les sections avec du toluène / éthanol (2: 1, v / v) pendant 6 h pour éliminer les extraits. Préparer le liquide de réaction en mélangeant 65 ml d'eau désionisée, 0,5 ml d'acide acétique et 0,6 g de sodium chloRite dans un bécher. Ajouter une section et 3 mL de liquide de réaction dans un flacon de 5 mL. Vissez le dessus du flacon.
11. Chauffer le flacon dans un bain d'eau à 75 ° C pendant 2 h pour éliminer la lignine du tissu. Rincer la section avec de l'eau désionisée dans un verre de montre 10 fois.
12. Transférez la section non traitée / délignifiée vers une lame de microscope en verre. Déployez la section avec soin à l'aide de brosses ou d'aiguilles. Enlevez l'eau désionisée supplémentaire avec du papier de soie.
13. Immergez la section dans D ₂ O. Couvrez l'échantillon avec un couvercle de verre. Sceller le capot avec un vernis à ongles pour éviter l'évaporation du D ₂ O.

2. Acquisition spectrale

1. Ouvrez le logiciel d'exploitation des instruments du microscope Raman confocal. Allumez le laser (longueur d'onde = 532 nm), concentrez-vous sur la surface du silicium cristallin avec un objectif de microscope 100X et cliquez sur le bouton d'étalonnage pour étalonner l'instrument.
2. Basculer l'instrumentAu mode microscope optique et allumez la lampe au microscope. Montez la glissière du microscope sur la scène, avec le patin de recouvrement face à l'objectif.
3. Voir l'échantillon avec un objectif de microscope 20X et localiser la zone d'intérêt. Appliquer de l'huile d'immersion sur la lamelle et passer à l'objectif microscope immersion (60X, ouverture numérique NA = 1,35). Concentrez-vous sur la surface de l'échantillon.
4. Passez l'instrument au mode de test Raman et éteignez la lampe du microscope.
5. Choisissez une zone de mappage en utilisant un outil rectangulaire. Modifiez la taille des étapes pour déterminer le nombre de spectres obtenus.
   Remarque: soyez conscient de la taille des étapes (généralement plus grand que le diamètre de la tache calculé par l'ouverture numérique de l'objectif, théoriquement 1,22λ / NA). Les tailles ci-dessous entraîneront un suréchantillonnage.
6. Définissez les paramètres spectral optimum pour obtenir le meilleur rapport signal / bruit (SNR) et la qualité spectrale dans un temps d'acquisition approprié (généralement <8 h), depeEn fonction de l'adéquation de l'échantillon. En général, entrez les paramètres d'imagerie dans le logiciel de l'instrument comme suit: laser (532 nm), filtre (100%), trou (300), fente (100), spectromètre (1,840 cm ^-1 ), rainures (1200t), objectif ( Huile 60X) et le temps d'acquisition (2 s).
7. Enregistrez les données spectrales avant le traitement des données et convertissez-les dans un format universel ( p. Ex. Fichiers TXT).

3. Analyse des données

1. Chargez les données spectrales (fichiers TXT) dans le logiciel d'analyse de données ( par exemple, Matlab). Appliquer une technique de réduction du bruit sur l'ensemble de données pour améliorer le SNR ( par exemple, l'algorithme Savitzsky-Golay ou l'algorithme wavelet)
2. Utilisez des échantillons non traités pour produire les images de lignine et de polysaccharides. Pour l'imagerie lignine, considérez le pic spectral autour de 1 600 cm ^-1 en raison de la vibration d'étirage symétrique du cycle aromatique. Pour l'imagerie polysaccharidique (y compris la cellulose et l'hémicellulose), utiliser le pic spectral aRond de 2.889 cm ^{-1 à} cause des tronçons CH et CH ₂ .
3. Utiliser des échantillons délimités pour générer les images de cellulose et d'hémicellulose. Effectuez une résolution de courbe auto-modélisante (SMCR) sur les spectres acquis pour discriminer les spectres de cellulose et d'hémicellulose et d'image de leurs distributions.
4. Effectuer l'analyse des composants principaux (PCA) et l'analyse de clustering sur les données acquises pour distinguer les spectres Raman des différentes couches de paroi cellulaire.

Résultats

La figure 1 présente un aperçu d'un système typique de micro-Raman pour l'imagerie Raman d'une paroi cellulaire végétale. À titre d'exemple, les spectres Raman originaux du peuplier ( Populus nigra L.) ont des dérives et des pointes de base significatives ( Figure 2a ). Après avoir effectué la méthode de prétraitement automatique pour le jeu de données d'imagerie Raman (APRI), ces deux co...

Discussion

La paroi de la cellule végétale est composée en plusieurs couches, y compris le coin cellulaire (CC), la paroi secondaire (SW, avec les couches S1, S2 et S3) et les lamelles intermédiaires composées (LML, la lamelle intermédiaire plus la primaire adjacente Mur), ce qui rend difficile l'obtention d'une surface plane lors de la préparation de l'échantillon. Ainsi, les échantillons de plantes, en particulier l'herbe, qui ont une structure plus compliquée que le bois, doivent souvent être solidifi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM430
Confocal Raman microscope	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040