Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

Özet

Bu protokol, bitki hücre duvarlarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozun Raman görüntüleme ve çok değişkenli analizi kullanılarak görselleştirilmesi için genel bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.

Özet

Raman görüntüsünün bitki biyokütle uygulamasına uygulanması, sulu çözeltiler üzerinde mekansal ve kompozisyonsal bilgi sunabileceği için artmaktadır. Analiz, genellikle kapsamlı numune hazırlığı gerektirmez; Yapısal ve kimyasal bilgiler etiketsiz olarak elde edilebilir. Bununla birlikte, her Raman görüntüsü binlerce spektrum içermektedir; Gizli bilgileri ayıklarken, özellikle de benzer kimyasal yapıya sahip bileşenler için güçlükler doğar. Bu çalışma, bu sorunu çözmek için çok değişkenli bir analizi ortaya koymaktadır. Protokol, bitki hücre duvarı içerisindeki lignin, selüloz ve hemiselüloz dahil olmak üzere ana bileşenleri görselleştirmek için genel bir yöntem oluşturmaktadır. Bu protokolde, numune hazırlama, spektral edinme ve veri işleme prosedürleri anlatılmıştır. Numune hazırlama ve veri analizinde operatör becerisine oldukça bağımlıdır. Bu yaklaşımı kullanarak, uzman olmayan bir kullanıcı tarafından bir Raman araştırması yapılabilir.H kalite verisi ve bitki hücre duvar analizi için anlamlı sonuçlar.

Giriş

Plant biomass is the most abundant renewable resource on Earth; is mainly composed of lignin, cellulose, and hemicellulose; and is considered an attractive source of bioenergy and bio-based chemicals¹. Unfortunately, it can resist degradation and confer hydrolytic stability or structural robustness to the plant cell wall. Such resistance is attributable to the accessible surface area, biomass particle size, degree of polymerization, cellulose crystallinity, and protective lignin². A comprehensive understanding of the structural and chemical nature of the plant cell wall is thus significant from the viewpoint of plant biology and chemistry, as well as from that of commercial utilization. Commonly used wet chemistry analyses, such as chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy, only provide average compositional data of the measured sample. Furthermore, these methods are invasive and destroy the original structure of the plant tissue³.

The Raman imaging technique is a powerful tool for the nondestructive visualization of spatially resolved chemical information⁴. It uses a laser light to cause inelastic scattering with a photon and relies on changes in polarizability arising from the molecular vibrations. In this case, water causes weak Raman scattering, which makes this approach suitable for in situ investigations of biological samples⁵. The application of the Raman imaging technique to the plant cell wall can elucidate the structure and composition of plant cell walls in their native state, with the resolution on the scale of the single cell and even of the cell wall layers⁶. A typical Raman imaging analysis of a plant cell wall generally consists of three steps: 1) sample preparation, 2) spectral acquisition, and 3) data processing.

Although one of the major advantages of Raman imaging is the ability to achieve label-free and non-destructive spectra with minimal sample preparation, physical sample sectioning is still necessary to expose the surface of interest. This process should be performed carefully to obtain a flat surface, since the technique depends on maintaining optical focus⁷. Spectral acquisition requires a balance between image quality and extensive acquisition times⁸. Data processing aims to effectively extract the chemical information from the image data, especially for the components with similar chemical structures, such as cellulose and hemicellulose. Due to the strong spectral overlap, the exact spectra are difficult to discern. In this case, multivariate analysis is a straightforward approach to effectively uncover the hiding structural and chemical information⁹. This work presents a general protocol describing the use of Raman imaging to visualize the main components in plant cell walls, including lignin, cellulose, and hemicellulose.

Protokol

1. Numune Hazırlama

1. Bitki örneğinden küçük bir doku bloğu (yaklaşık 3 mm x 3 mm x 5 mm) kesin ( örn. Kavak kökü).
2. Dokuyu 30 dakika kaynar deiyonize suya daldırın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca hemen deiyonize suya aktarın. Doku, kabın altına sızana kadar bu adımı tekrarlayın; dokudaki havanın alınmış olduğunu ve dokunun yumuşadığını belirtin.
   Not: Bu adımdan önce altına batan numuneler için, genellikle bu döngüyü 3-5 kez tekrarlayın.
3. Deiyonize suyun içindeki 20, 50, 70, 90% (h / h) miktarlardaki polietilen glikol (PEG) ve saf PEG'yi hazırlayın ve solüsyonları 65 ° C'de tutun.
4. Suyu, yerinden çıkartmak ve PEG'nin sızmasına izin vermek için, dokuyu bir dizi dereceli PEG banyosunda inkübe edin.
   Not: Genellikle, molekül ağırlığı 2,000 olan (PEG2000) PEG, gömme için kullanılır.
   1. Doku g ile işleyin(A) 1 saat boyunca% 20 PEG, (b) 1.5 saat boyunca% 50 PEG, (c) 2 saat boyunca% 70 PEG, (d) 2 saat boyunca% 90 PEG, ve (E)% 10 PEG ile 10 saat.
5. Kaseti 65 ° C'de fırında önceden ısıtın. Bloğu içeren PEG'yi kasete dökün ve daha sonra önceden ısıtılmış cımbız veya iğne kullanarak doku bloğunu istenen bir yere yerleştirin.
6. Kaseti yavaşça soğutun ve doku kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.
7. Keskin bir tıraş bıçağı kullanarak küçük bir blok (yaklaşık 1 cm x 1 cm x 2 cm) içine hedef doku içeren PEG bloğu parçalayın ve mikrotom üzerine monte edin.
8. PEG bloğundan ince kesitleri kesin (tipik olarak 3-10 μm).
9. PEG'yi dokudan çıkartmak için, bölmeyi deiyonize su ile bir saat camında 10 kez durulayın.
10. Ekstraktları çıkarmak için bölümleri toluen / etanol (2: 1, v / v) ile 6 saat bekletin. 65 mL deiyonize su, 0.5 mL asetik asit ve 0.6 g sodyum klorür karıştırılarak reaksiyon sıvısı hazırlanır.Bir kapta ritüel edin. 5 mL şişeye bir bölüm ve 3 mL reaksiyon sıvısı ekleyin. Şişenin üst kısmını vidalayın.
11. Dokunun lignini çıkarmak için şişeyi 75 ° C'de 2 saat boyunca su banyosunda ısıtın. Parçayı deiyonize su ile 10 kez saat camında yıkayın.
12. İşlenmemiş / tasfiye edilmemiş bölümü cam mikroskop lamı üzerine aktarın. Fırçaları veya iğneleri kullanarak bölümü dikkatle açın. Ekstra deiyonize suyu kağıttan kağıtla çıkarın.
13. Kesiti D ₂ O içine sokun. Numuneyi bir cam kapak folyosuyla örtün. D2O'nun buharlaşmasını önlemek için kapak kağıdını oje ile mühürle.

2. Spektral Edinme

1. Konfokal Raman mikroskopunun cihaz çalıştırma yazılımını açın. Lazeri açın (dalga boyu = 532 nm), 100X mikroskop objektifli kristal silisyumun yüzeyine odaklayın ve cihazı kalibre etmek için kalibrasyon düğmesine tıklayın.
2. Aleti değiştirOptik mikroskop moduna geçirin ve mikroskop lambasını açın. Mikroskop lamı, objektife bakacak şekilde kapak kaymasıyla birlikte sahneye monte edin.
3. 20X mikroskop objektifle örneği inceleyin ve ilgi alanını bulun. Lamel içine daldırma yağı uygulayın ve daldırmalı mikroskop objektif (60X, sayısal diyafram NA = 1.35) geçiş yapın. Numunenin yüzeyine odaklanın.
4. Cihazı, Raman test moduna getirin ve mikroskop lambasını kapatın.
5. Dikdörtgen bir araç kullanarak bir haritalama alanı seçin. Elde edilen spektrumların sayısını belirlemek için adım boyutunu değiştirin.
   Not: Adım boyutunun farkında olun (genellikle objektifin sayısal diyaframı ile hesaplanan spot çapından daha büyük, teorik olarak 1.22λ / NA). Bunun altındaki boyutlar aşırı örneklemeye neden olur.
6. Uygun bir edinim zamanında (genellikle <8 saat) en iyi sinyal-gürültü oranı (SNR) ve spektral kaliteyi elde etmek için optimum spektral parametreleri ayarlayın, depeNumunenin uygunluğuna değinerek. Genellikle, görüntüleme parametrelerini cihaz yazılımında aşağıdaki gibi girin: lazer (532 nm), filtre (100%), delik (300), yarık (100), spektrometre (1,840 cm ^-1 ), oluklar (1200 t), objektif 60X yağ) ve edinme süresi (2 s).
7. Veri işleme öncesinde spektral verileri saklayın ve evrensel bir biçime ( ör. TXT dosyaları) dönüştürün.

3. Veri Analizi

1. Spektral verileri (TXT dosyaları) veri analizi yazılımına yükleyin ( örn., Matlab). SNR'yi iyileştirmek için veri kümesindeki bir gürültü azaltma tekniği uygulayın ( örneğin, Savitzsky-Golay algoritması veya dalgacık algoritması)
2. Lignin ve polisakarit görüntüleri üretmek için işlem görmemiş numuneler kullanın. Lignin görüntülemede, aromatik halka simetrik gerilme titreşiminden dolayı 1,600 cm ^-1 civarında spektral zirveyi göz önünde bulundurun. Polisakkarit görüntüleme (selüloz ve hemiselüloz dahil) için, spektral zirveyi aCH ve CH ₂ gerilmelerinden dolayı 2,889 cm ^-1 yuvarlaktır.
3. Selüloz ve hemiselüloz görüntüleri oluşturmak için lekeleyici örnekleri kullanın. Elde edilen spektrumlarda selüloz ve hemiselülozun spektrumlarını ayırt etmek ve dağılımlarını görüntülemek için kendinden modelleme eğrisi çözünürlüğü (SMCR) uygulayın.
4. Farklı hücre duvarı katmanlarından Raman spektrumlarını ayırt etmek için elde edilen verilere temel bileşen analizi (PCA) ve kümeleme analizi uygulayın.

Sonuçlar

Şekil 1 , bir bitki hücre duvarının Raman görüntüsü için tipik bir mikro-Raman sistemine genel bir bakış sunmaktadır. Örnek olarak, kavak ( Populus nigra L.) orijinal Raman spektrumlarında belirgin taban çizgileri ve sivri uçlar bulunur ( Şekil 2a ). Raman görüntüleme veri seti (APRI) için otomatik ön işleme yöntemini yaptıktan sonra, bu iki spektral kirletici başarıyla kaldırılır (

Tartışmalar

Bitki hücre duvarı, hücre köşesi (CC), ikincil duvar (SW, S1, S2 ve S3 katmanları) ve bileşik orta lamel (CML, orta lamel artı birincil birincil Duvar), bu da numunenin hazırlanması sırasında düz bir yüzey elde edilmesini zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, ahşaptan daha karmaşık bir yapıya sahip bitki örnekleri, özellikle çim, çoğunlukla ince kesit vermeye izin vermek için katılaştırılmaya ihtiyaç duyar. PEG, suda çözünür olduğu için kesme ve Raman araştırması için ideal bir sert ma...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM430
Confocal Raman microscope	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040