Объединение рамановских изображений и многофакторного анализа для визуализации лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в стенке клетки растения

Резюме

Этот протокол призван представить общий метод визуализации лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в растительных клеточных стенках с использованием рамановского изображения и многомерного анализа.

Аннотация

Применение изображений Raman для выращивания биомассы возрастает, поскольку оно может предлагать пространственную и композиционную информацию о водных растворах. Анализ обычно не требует обширной подготовки проб; Структурная и химическая информация может быть получена без маркировки. Однако каждый рамановский образ содержит тысячи спектров; Это создает трудности при извлечении скрытой информации, особенно для компонентов с аналогичными химическими структурами. В этой работе представлен многомерный анализ для решения этой проблемы. Протокол устанавливает общий метод визуализации основных компонентов, включая лигнин, целлюлозу и гемицеллюлозу в стенке растительной клетки. В этом протоколе описаны процедуры подготовки образцов, спектрального сбора и обработки данных. Он сильно зависит от навыков оператора при подготовке проб и анализе данных. Используя этот подход, рамановское расследование может быть выполнено неспециалистским пользователем для полученияH-качества и значимых результатов для анализа клеточной стенки растений.

Введение

Plant biomass is the most abundant renewable resource on Earth; is mainly composed of lignin, cellulose, and hemicellulose; and is considered an attractive source of bioenergy and bio-based chemicals¹. Unfortunately, it can resist degradation and confer hydrolytic stability or structural robustness to the plant cell wall. Such resistance is attributable to the accessible surface area, biomass particle size, degree of polymerization, cellulose crystallinity, and protective lignin². A comprehensive understanding of the structural and chemical nature of the plant cell wall is thus significant from the viewpoint of plant biology and chemistry, as well as from that of commercial utilization. Commonly used wet chemistry analyses, such as chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy, only provide average compositional data of the measured sample. Furthermore, these methods are invasive and destroy the original structure of the plant tissue³.

The Raman imaging technique is a powerful tool for the nondestructive visualization of spatially resolved chemical information⁴. It uses a laser light to cause inelastic scattering with a photon and relies on changes in polarizability arising from the molecular vibrations. In this case, water causes weak Raman scattering, which makes this approach suitable for in situ investigations of biological samples⁵. The application of the Raman imaging technique to the plant cell wall can elucidate the structure and composition of plant cell walls in their native state, with the resolution on the scale of the single cell and even of the cell wall layers⁶. A typical Raman imaging analysis of a plant cell wall generally consists of three steps: 1) sample preparation, 2) spectral acquisition, and 3) data processing.

Although one of the major advantages of Raman imaging is the ability to achieve label-free and non-destructive spectra with minimal sample preparation, physical sample sectioning is still necessary to expose the surface of interest. This process should be performed carefully to obtain a flat surface, since the technique depends on maintaining optical focus⁷. Spectral acquisition requires a balance between image quality and extensive acquisition times⁸. Data processing aims to effectively extract the chemical information from the image data, especially for the components with similar chemical structures, such as cellulose and hemicellulose. Due to the strong spectral overlap, the exact spectra are difficult to discern. In this case, multivariate analysis is a straightforward approach to effectively uncover the hiding structural and chemical information⁹. This work presents a general protocol describing the use of Raman imaging to visualize the main components in plant cell walls, including lignin, cellulose, and hemicellulose.

протокол

1. Подготовка образца

1. Вырежьте небольшой образец ткани (около 3 мм х 3 мм х 5 мм) из образца растения ( например, стебель тополя).
2. Погрузите ткань в кипящую деионизированную воду в течение 30 мин. Немедленно переносите его в деионизированную воду при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут. Повторите этот шаг, пока ткань не опустится до нижней части контейнера, что указывает на то, что воздух в ткани был удален и что ткань смягчилась.
   Примечание. Для образцов, которые опускаются на дно до этого шага, обычно повторяйте этот цикл 3-5 раз.
3. Подготовьте 20, 50, 70, 90% (об. / Об.) Аликвоты полиэтиленгликоля (ПЭГ) в деионизированной воде, а также чистый ПЭГ и поддерживайте растворы при 65 ° С.
4. Инкубируйте ткань в серии градуированных ванн PEG, чтобы вытеснить воду и позволить ПЭГ проникать.
   Примечание. Обычно для встраивания используется ПЭГ с молекулярной массой 2000 (PEG2000).
   1. Обработать ткань с помощью g(А) 20% ПЭГ в течение 1 ч, (б) 50% ПЭГ в течение 1,5 ч, (с) 70% ПЭГ в течение 2 ч, (г) 90% ПЭГ в течение 2 ч и (E) 100% ПЭГ в течение 10 ч.
5. Предварительно нагрейте кассету при 65 ° C в духовке. Налейте ПЭГ, содержащий блок, в кассету, а затем поместите блок ткани в нужное положение, используя предварительно разогретые пинцеты или иглы.
6. Медленно остывайте кассету и храните ткань при комнатной температуре до использования.
7. Раскройте блок ПЭГ, содержащий ткань-мишень, в небольшой блок (около 1 см х 1 см х 2 см), используя острый лезвие бритвы и установите его на микротом.
8. Вырезать тонкие секции из блока ПЭГ (обычно 3-10 мкм).
9. Промойте секцию деионизированной водой в часовом стекле 10 раз, чтобы удалить ПЭГ из ткани.
10. Погрузите секции толуолом / этанолом (2: 1, об. / Об.) В течение 6 часов, чтобы удалить экстракторы. Подготовьте реакционную жидкость, смешав 65 мл деионизированной воды, 0,5 мл уксусной кислоты и 0,6 г хлорида натрияОбряд в стакане. Добавьте один участок и 3 мл реакционной жидкости в 5 мл флакон. Вверните верхнюю часть флакона.
11. Нагреть флакон в водяной бане при 75 ° C в течение 2 часов для удаления лигнина ткани. Промойте секцию деионизированной водой в часовом стекле 10 раз.
12. Перенесите необработанную / делигнифицированную секцию на слайд стеклянного микроскопа. Разверните секцию осторожно, используя кисти или иглы. Удалите лишнюю деионизированную воду с помощью бумажной салфетки.
13. Погрузите секцию в D ₂ O. Накройте образец прокладкой из стеклянной крышки. Уплотните крышку с помощью лака для ног, чтобы предотвратить испарение D ₂ O.

2. Спектральное приобретение

1. Откройте программное обеспечение для работы с прибором конфокального рамановского микроскопа. Включите лазер (длина волны = 532 нм), сосредоточьтесь на поверхности кристаллического кремния с объективом 100X микроскопа и нажмите кнопку калибровки для калибровки прибора.
2. Переключить инструментВ режим оптического микроскопа и включите лампу микроскопа. Установите скобу микроскопа на сцене, при этом обложка крышки обращена к объективу.
3. Просмотрите образец с объективом микроскопа 20X и найдите интересующую область. Нанесите погружное масло на покровное стекло и переключитесь на объектив погружного микроскопа (60X, числовая апертура NA = 1,35). Сосредоточьтесь на поверхности образца.
4. Переключите прибор в режим проверки комбинационного рассеяния и выключите лампу микроскопа.
5. Выберите область отображения с помощью прямоугольного инструмента. Измените размер шага, чтобы определить количество полученных спектров.
   Примечание. Помните о размере шага (обычно большем, чем диаметр пятна, рассчитанный с помощью числовой апертуры объекта, теоретически 1,22λ / NA). Размеры ниже этого приведут к передискретизации.
6. Установите оптимальные спектральные параметры для получения наилучшего отношения сигнал / шум (SNR) и спектрального качества в соответствующее время сбора (обычно <8 ч), depeНа пригодность образца. Как правило, вводятся параметры изображения в программном обеспечении следующим образом: лазер (532 нм), фильтр (100%), отверстие (300), щель (100), спектрометр (1840 см ^-1 ), канавки (1200 т), объектив ( 60X) и время сбора (2 с).
7. Сохраните спектральные данные перед обработкой данных и преобразуйте их в универсальный формат ( например, файлы TXT).

3. Анализ данных

1. Загрузите спектральные данные (файлы TXT) в программное обеспечение для анализа данных ( например, Matlab). Примените метод шумоподавления в наборе данных для улучшения SNR ( например, алгоритм Савицкого-Голея или алгоритм вейвлета)
2. Используйте необработанные образцы для получения изображений лигнина и полисахаридов. Для визуализации лигнина рассмотрим спектральный пик около 1600 см ^-1 из-за симметричного колебания растяжения ароматического кольца. Для получения полисахаридов (включая целлюлозу и гемицеллюлозу) используйте спектральный пик aВокруг 2889 см ^-1 из-за растяжения CH и CH ₂ .
3. Используйте делигнифицированные образцы для получения изображений целлюлозы и гемицеллюлозы. Выполните разрешение самомодельной кривой (SMCR) на полученных спектрах для выделения спектров целлюлозы и гемицеллюлозы и изображения их распределений.
4. Выполните анализ основных компонентов (PCA) и анализ кластеризации по полученным данным, чтобы отличить спектры комбинационного рассеяния от разных слоев клеточных стенок.

Результаты

На рисунке 1 представлен обзор типичной системы микрораманов для рамановской визуализации стенки клетки растения. В качестве примера, исходные спектры комбинационного рассеяния тополя ( Populus nigra L.) имеют значительные базовые дрейфы и всплески (

Обсуждение

Растительная клеточная стенка представляет собой композит, который состоит из нескольких слоев, включая угол ячейки (CC), вторичную стенку (SW, с слоями S1, S2 и S3) и составную среднюю пластинку (CML, средняя ламелла плюс смежная первичная Стенки), что затрудняет получение плоской поверхности ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM430
Confocal Raman microscope	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040