والرزن ثقافة المشارك خاتم الابهري: أداة ملائمة تقييم إمكانات الأوعية الوسيطة Stromal الخلايا في المختبر

Summary

هنا، نقدم تطبيق رواية للمقايسة حلقة الابهر التي تكون فيها الخلايا الوسيطة بريلابيليد مثقف يشترك مع شبكات غشائي المستمدة من الشريان الاورطي الفئران. يسمح هذا الأسلوب رواية التصور صاروخ موجه الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) والتكامل مع الشبكات بطانية، التحديد الكمي لخصائص الشبكة، وتقييم التعبير لجنة السلامة البحرية إيمونوفينوتيبيس والجينات.

Abstract

تولد الأوعية عملية معقدة وعالية التنظيم مسؤولاً عن توفير وصيانة نضح الأنسجة مناسبة. صيانة المفرج غير كافية والتشوهات المرضية يمكن أن ينتج الأمراض الدماغية الحادة، بينما يرتبط تطور الأوعية الدموية مفرط وفيرة مع السرطان وأمراض التهابات. نموذج واعدة برو-الأوعية العلاج هو استخدام الأوعية خلية المصادر، التي يمكن أن توفر العوامل التنظيمية، فضلا عن الدعم المادي لتطوير المفرج حديثا.

الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) مرشحتان التحقيق على نطاق واسع لتجديد الأوعية الدموية بسبب آثارها باراكريني وقدرتهم على كشف وموطنا للأنسجة الدماغية أو ملتهبة. على وجه الخصوص، في الفصل الأول الحبل السري البشري ارتشاح الخلايا (FTM هوكبفكس) مرشح واعدة جداً نظراً لخصائص مثل بيريسيتي، وإمكانات عالية التكاثري ومولتيلينيجي، وخصائص المناعي المميز، و paracrine قوية الشخصية. لتقييم فعالية يحتمل أن تكون الأوعية خلايا التجدد، شرط مسبق لاختبار لهم في موثوقية وفحوصات ما قبل السريرية "قابل للنقل". والرزن حلقة الابهر هو نموذج الأوعية السابقين فيفو يسمح لسهل التحديد الكمي لهياكل غشائي أنبوبي، يوفر خلايا داعمة التبعي والمصفوفة خارج الخلية (ECM) من البلد المضيف، ويستبعد مكونات التحريضية، وهو سريعة وغير مكلفة لإعداد. وهذا مفيد عند مقارنتها بنماذج في فيفو (مثلاً، فحص القرنية، مقايسة توصيل ماتريجيل)؛ يمكن تعقب الخلايا التي تدار المقايسة حلقة الابهر ومراقبة التفاعلات بين الخلايا مع تجنب الرفض المناعي كرة.

نقدم بروتوكول لتطبيق رواية للمقايسة حلقة الابهر، الذي يشمل البشرية MSCs في الثقافات المشتركة مع النامية شبكات غشائي الابهري من الفئران. يسمح هذا الفحص لتحليل مساهمة لجنة السلامة البحرية أنبوب تشكيل والتنمية من خلال التفاعلات مثل بيريسيتي المادية وقوتها لنشاط الترحيل إلى مواقع للأوعية، وتقييم قدرتها على أداء والتوسط تجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة. يوفر هذا البروتوكول مزيدا من المعلومات عن التغيرات في التعبير النمط الظاهري والجيني ماجستير أثر الثقافة المشارك.

Introduction

يحسن عملية معقدة من الأوعية ويحافظ نضح الأنسجة من خلال تعزيز التنمية السفينة دماء جديدة من القائمة من قبل المفرج¹. أنها عملية محكم التنظيم، ومتوازنة بعوامل برو-الأوعية والأوعية المضادة. قد يؤدي أي نقص في هذا النظام لصيانة السفينة غير كافية أو النمو، مما تسبب في الأمراض الدماغية الحادة بما في ذلك مرض احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية، واضطرابات الأعصاب. تطوير الأوعية الدموية مبالغ فيها غير مميزة للشروط بما في ذلك السرطان وأمراض التهابات².

تطوير العلاجات التي تهدف إلى التحكم في الأوعية لتحقيق تجديد الأنسجة مواتية له أهمية رئيسية. على الرغم من التحقيقات السريرية والسريرية واسعة النطاق، فشلت محاولات لتنشيط الأوعية باستخدام عوامل برو-الأوعية وميكرورناس لتحقيق النتائج المرغوبة^3،،من⁴⁵. تتضمن الأسباب المحتملة لآثار عابرة: طول العمر المحدود للأوعية البروتينات والأحماض النووية، وعدد محدود من استهداف عوامل النمو^6،7. على الرغم من أن الأوعية القابلة للذوبان عوامل ضرورية لبدء عملية تولد الأوعية، على الصيانة ووظائف من المفرج تعتمد على دعم أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء وبيريسيتيس⁸. مجال العلاجات برو-الأوعية الآن هو استكشاف مصادر خلية المحتملة الخلايا الجذعية، والسلف قد توفر عوامل الأوعية محلياً، بينما فعلياً دعم حديثا وضعه المفرج، تجديد ذاتية أو حتى التفريق في خلايا بطانية مثل^9،10. إيجاد الأوعية الأمثل أنواع الخلايا مع القدرة على الوفاء بهذه المتطلبات الوظيفية يحمل وعدا كبيرا لتجديد الأنسجة الدماغية.

من أجل ترجمة العلاجات المحتملة يستند إلى الخلية بنجاح في التجارب السريرية، تحتاج الدراسات ما قبل السريرية إثبات فعاليتها وتسليط الضوء على الآليات الأوعية الكامنة. على الرغم من العدد الكبير من فحوصات الأوعية الثابتة، يفتقر المجال "المعيار الذهبي" في المختبر مقايسة التي موثوق يمكن تقييم الفعالية من المحتمل المرشح الخلية أنواع^{11،12، 13}-معظم في المختبر الأوعية فحوصات (بما في ذلك فحوصات تشكيل الانتشار والهجرة وأنبوب غشائي) عادة تقييم آثار الخلايا أو مركبات على التغييرات الشكلية أو التمايز إلى خلايا بطانية أنبوبية وهياكل الشبكة^14،15. بينما هذه الميزات حاسمة بالنسبة للأوعية، ينبغي أيضا تقييم مقايسة "قابل للنقل": 1) تكبير أو استبدال أنواع الخلايا الداعمة بما في ذلك بيريسيتيس أو خلايا العضلات الملساء، 2) تجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة و/أو الغشاء، و 3). كفاءة لتشجيع تشكيل ميكروفاسكولاتوري الوظيفية. في فيفو الأوعية النماذج، بما في ذلك فحص القرنية ومقايسة توصيل ماتريجيل، الخص المكروية فريدة من نوعها في فيفو ولكن تحدي عن الصعوبة في خلايا تتبع إدارة لمراقبة التفاعلات الفيزيائية. وعلاوة على ذلك، في فيفو النماذج، يمكن أن تحدث الرفض المناعي كرة بينما تقوم باختبار المرشحين العلاج خلية متمكنة المحتملة¹⁶. السابقين فيفو نماذج الأوعية، لا سيما مقايسة حلقة الابهر يمكن أن توفر: 1) السهل والمراقبة والتحديد الكمي لهياكل أنبوبية، وخلايا داعمة 2) التبعي، 3) ECM من المضيف واللوازم الصناعية، 4) الاستبعاد من الالتهابات المكونات، و 5) سريعة وغير مكلفة إعداد^17،18. عادة، يمكنك اختبار الإنزيم حلقة الابهر إمكانات الأوعية الصغيرة البروتينات الافرازية، ووكلاء الدوائية، ونماذج القوارض المعدلة وراثيا^19،،من²⁰²¹.

MSCs هم المرشحين الواعدين لتجديد الأوعية الدموية أساسا من خلال^23،22،paracrine بوساطة تأثيرات على²⁴. MSCs قد ثبت أن تفرز عوامل الأوعية الرئيسية بما في ذلك الأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF)، تتمثل عامل النمو (هجف)، مثل الأنسولين عامل النمو-1 (منتدى إدارة الإنترنت-1)، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (بفجف) الأساسية، وأنجيوبويتين-1 (إنج-1)^{25 ،26}. ويمكن أيضا الكشف عن MSCs وموطن الدماغية أو التهاب الأنسجة، ولكن الآليات الدقيقة ما زالت قيد التحقيق. متزايدة، والأدب تدعم الفرضية القائلة بأن MSCs معظم تنشأ من ارتشاح الخلايا، وشارك عن علامات بيريسيتي، ويمكن أن تتصرف مثل بيريسيتيس²⁷. هوكبفكس مصدر شباب من MSCs المستمدة من منطقة ارتشاح في الحبل السري البشري. أنها تمثل أن MSCs مع خصائص مثل بيريسيتي واتسمت من الحبال السري FTM والأجل. هوكبفكس FTM إثبات تعبير عالية من علامات بيريسيتي بما في ذلك خصائص المناعي المميز CD146 وفي NG2، إمكانات عالية التكاثري ومولتيلينيجي، وعرض paracrine قوية الشخصية²⁸. هوكبفكس FTM نوع خلية مرشح مثالي لتعزيز التجديد للنسيج المصاب من خلال تعزيز المفرج الجديدة عن طريق خصائصها مثل بيريسيتي.

لاختبار إمكانيات الأوعية وخصائص مثل بيريسيتي من MSCs البشرية، هي عدد محدود جداً من فحوصات الأوعية الهجرة المتاحة حيث الإيجابية أنجيوتروبيك (يشار إليه فيما يلي "صاروخ موجه") وتجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة والتنمية البدنية يمكن أن يحقق التفاعلات بين أنواع الخلايا، في حين الحصول على بيانات كمية في التنمية ميكروفاسكولاتوري.

هنا نقدم بروتوكول يصف تطبيق رواية للمقايسة حلقة الابهر. وكانت MSCs البشرية مثقف يشترك مع النامية المستمدة من الفئران الابهري غشائي شبكات تقييم إسهامها في أنبوب تشكيل والنضج والتوازن. هذا الإصدار من مقايسة حلقة الابهر يقيم قدرة وفاعلية الخلية العلاج المرشحين الصفحة الرئيسية لمواقع الأوعية، نفذ والتوسط من أجل تجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة، والإسهام في التنمية أنبوبي غشائي من خلال إنشاء البدنية مثل بيريسيتي التفاعلات. بالإضافة إلى التحديد الكمي للأثر الصافي من MSCs على تشكيل شبكة غشائي في المختبر ومراقبة التفاعلات بين الخلايا، ونحن أيضا الأمثل بروتوكولا لعزل MSCs من الثقافات المشتركة. عن طريق إجراء التدفق الخلوي وقبكر، فمن الممكن لوصف التغييرات في تعبير النمط الظاهري والجيني ماجستير أثر الثقافة المشتركة. كنموذج أنواع الخلايا، قارنا أونتوجينيتيكالي المبكر (قبل الولادة) وأواخر المصادر (الكبار) من MSCs البشرية: FTM هوكبفكس والبشرية المشتقة من نخاع العظم MSCs (بمسك)، على التوالي، في مقايسة حلقة الابهر. ونحن نقترح أن المقايسة خاتم الابهري يمكن استخدامها لدراسة إمكانات الأوعية من أي نوع الخلية الداعمة ماديا عند قيد التحقيق للتطبيقات التجدد الأوعية.

Protocol

أجريت جميع الدراسات التي تنطوي على الحيوانات وسجلت وفقا للمبادئ التوجيهية سيصلون ²⁹. وأجريت جميع الدراسات بموافقة مجلس أخلاقيات البحوث المؤسسية (ريب عدد 4276). جميع الحيوانات إجراءات أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان بالشبكة الصحية جامعة" (تورنتو، كندا)، وجميع الحيوانات تلقي الرعاية الإنسانية امتثالا دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، (الطبعة ^ال 8 المعاهد الوطنية للصحة 2011)-

1-"إعداد المقايسة خاتم الابهري"

1. عزل الشريان الاورطي الفئران.
   1. يوثانيزي 8-الفئران سبراغ داولي عمرها 10 الأسبوع استخدام الخنق ₂ CO: غاز CO مجموعة الدوائر ₂ إلى 20% استبدال (معدل التدفق = 0.2 × حجم الدائرة في الدقيقة). تأكيد عدم وجود قرصه العاكسة والقلب يدق بواسطة بالباتينج الصدر.
   2. الرطب الفراء في منطقة الصدر باستخدام شاش معقم مع الإيثانول 70%. استخدام الملقط المعقم ومقص لجعل شق في خط الوسط الصدر وتخترق طبقات الجلد والعضلات.
   3. حالما يتم كشفها القفص الصدري، قص القفص الصدري على كل جانب، وإضعاف صعودا نحو 5 مم من القص على كل جانب. بعض النزيف المتوقع من الشرايين ربية في الجثث الطازجة.
   4. دفع بأنسجة الرئة والقلب إلى الجانب الأيمن التشريحية لفضح الشريان الاورطي. الشريان الاورطي هو الأبيض الملون السفينة يقع المجاورة للعمود الفقري-
   5. استخدام الملقط قرصه الشريان الاورطي (بعد القوس الاورطي) واستخدام مقص الجراحية جعل الشق الأول أثناء الضغط الشريان الاورطي بالملقط. عند قطع الشريان الاورطي، سيتم ملء تجويف الصدر بسرعة مع الدم، ولذلك من الأهمية بمكان أن تعمل بسرعة للحصول على الشريان الاورطي قبل تخثر الدم.
   6. استخدام الملقط لعقد الشريان الاورطي ولطف قشر الابهر نازلا، بعيداً عن العمود الفقري. سيتم السحب قطع الشرايين ربية دون مزيد من شقوق. الحصول على حوالي 10 سم من الأنسجة و/أو قبل أن يقسم إلى فرعين في تجويف البطن الشريان الاورطي وقطع الشريان الاورطي من الذبيحة. دفع الحجاب الحاجز إذا لزم الأمر في اتجاه والذيلية للوصول إلى تخفيض أجزاء من الشريان الاورطي.
      ملاحظة: قشر الشريان الاورطي برفق لأنه شديد القوة يمكن أن يؤدي إلى تمزق. إذا دموع الشريان الاورطي، السماح تخثر الدم لبضع ثوان، واستخدم منشفة ورقية لإزالة الدم متخثر، مما يتيح رؤية الشريان الاورطي المتبقية.
   7. مكان الشريان الاورطي في أنبوب 15 مل مع 10 مل من المثلج هانك ' s حل متوازن الملح (هبس) وتستكمل مع 1% البنسلين/ستربتوميسين (P/S). تبقى هذه الأنابيب على مدت
      ملاحظة: يمكن أن تستمر الأنسجة الابهري ح 1-2 على الجليد، لكن من الأفضل معالجته بأسرع ما يمكن.
2. تحضير الوسائط الثقافة المقايسة حلقة الابهر في مجلس الوزراء السلامة عقيمة (BSC).
   1. تحضير متوسط نمو غشائي (EGM) باستخدام وحدة ترشيح لتصفية 500 مل متوسطة القاعدية غشائي (EBM) تستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS)، جنتاميسين 1% وعوامل النمو (انظر الجدول للمواد). ضع 50 مل من وسائل الإعلام التي تمت تصفيتها في حمام المياه أو حبة في 37 درجة مئوية.
   2. استخدام وحدة أخرى في الترشيح لتصفية 100 مل EBM تستكمل مع 2% FBS و 1% P/S إلى أعد في EBM 2% FBS (EBM-FBS) وتخزينها في 4 ° C.
3. معطف لوحات زراعة الأنسجة 12-جيدا مع القاعدية غشاء استخراج (BME) أثناء العمل على الجليد.
   1. مكان لوحة 12-جيدا على سطح بارد (حزمة الجليد كبيرة أو علبة). إضافة 200 ميليلتر/جيدا من استخدام BME المذابة الطازجة المبردة نصائح ماصة ودوامه BME ضمان طلاء حتى. العمل بسرعة لتفادي البلمرة متفاوتاً من BME.
      ملاحظة: ختان الشريان الاورطي نموذجي غلة خواتم الابهري 20. لحساب التباين بين فحوصات حلقة الابهر، إعداد ثلاثة على الأقل حلقة الابهر فحوصات كل مجموعة العلاج وتضمين عنصر تحكم. إذا سمح المصدر، ينصح بخواتم 6 كل مجموعة العلاج.
   2. وضع لوحات المغلفة في حاضنات هوميديفيد (95% رطوبة نسبية، 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO ₂؛ وهذه الشروط تنطبق على جميع الخطوات حاضنة هوميديفيد الآخرة) عن 30 دقيقة 1,000 مكان ميليلتر ماصة نصائح العودة إلى-20 درجة مئوية للخطوة 1.5.3.
      ملاحظة: بينما يتم استخدام استخراج الغشاء القاعدي في تركيز المخزون، الاتساق وصلابة مراقبة صارمة في الوقت البلمرة. تأكد من الاحتفاظ بنفس الأوقات البلمرة الدقيق لجميع أوجه الشبه والتجارب المستقلة-
4. قسم الشريان الاورطي إلى عصابات موحدة.
   1. تأخذ الشريان الاورطي من أنبوبة 15 مل ووضعه في طبق 10 سم مع 10 مل حبس جديدة تستكمل مع 1% ف/س.
   2. استخدام مجموعتين من الملقط بعناية فصل الزائد من النسيج الضام والأنسجة الدهنية، واستخدام مشرط للفروع المتبقية من الشرايين ربية متصلاً بالشريان الاورطي. وهذا يقلل التباين بين وحدات خاتم استناداً إلى مستويات مختلفة من الأنسجة المتبقية. إزالة أي بقايا تخثره الدم من داخل الشريان الاورطي.
   3. وضع المسطرة أو الشبكة تحت الطبق 10 سم قص التحديد 1-2 مم أبواب واسعة من الشريان الاورطي باستخدام مشرط معقم والملقط. قص الأجزاء الدقيقة قدر الإمكان للتقليل من التباين بين وحدات-
5. تضمين الخواتم الابهر إلى BME.
   ملاحظة: إذا لم تكتمل تمزيقها خواتم الابهر قبل BME البلمرة الحضانة، إزالة لوحات المغلفة من حاضنات هوميديفيد وإضافة 100 ميليلتر من المراعية لكل بئر بإنهاء البلمرة. التوقيت الدقيق أمر بالغ الأهمية قد تتداخل البلمرة المفرط من BME مع الهجرة التنمية وخلية الشبكة البطانية. بمجرد إعداد الحلقات الابهري، إزالة في EBM من الآبار والمتابعة من الخطوة 1.5.2.
   1. إزالة الآبار BME المغلفة من حاضنات هوميديفيد والعودة إلى بكالوريوس العلوم-
   2. تلتقط حلقات الابهري الفردية مع الملقط ومكان واحد في منتصف كل بئر BME المغلفة بعناية. تكرار للحلقات المتبقية الابهري.
      ملاحظة: وسائط نقل جنبا إلى جنب مع الحلبة الابهري ينبغي أن يظل الحد الأدنى لتفادي مخالفات البلمرة.
   3. استخدام تبريد (-20 درجة مئوية) 1,000 ميليلتر ماصة نصائح لإضافة 300 ميليلتر من BME على رأس كل حلقة الابهر وتوزيعها بالتساوي BME حول البئر.
   4. العودة الخواتم الابهري المضمنة لحاضنات هوميديفيد عن 30 دقيقة
   إزالة اللوحات مع عصابة الابهري جزءا لا يتجزأ من حاضنات هوميديفيد
   5. وإضافة ببطء ميليلتر 1,000 لاجتماع فريق الخبراء (الخطوة المعدة وحرارة في 1.2.1) عن طريق وضع ماصة تلميح ضد الجدار للثقافة أيضا.
      ملاحظة: بيبيتينج مباشرة في وسائل الإعلام على BME يمكن تعطيل BME مبلمرة وتعيق التنمية شبكة غشائي المستمر. استخدام ماصة متعددة القنوات مناسبة إذا كانت متوفرة.
   6. وبعد 24 ساعة، إزالة ميليلتر 1,000 لاجتماع فريق الخبراء واستبدالها مع 1,000 ميليلتر من EBM-FBS أعد الخطوة 1.2.2، مرة أخرى ببطء بيبيتينج ضد الجانب للثقافة أيضا.
6. الحفاظ على مقايسة حلقة الابهر بالاستعاضة عن 500 ميليلتر من EBM FBS مع 500 ميليلتر من جديد EBM-FBS (37 درجة مئوية) كل حاء 48
   ملاحظة: انظر ثانيةم 2 لبدء توسيع ثقافة ماجستير في نفس اليوم كحلقة الابهر مقايسة إنشاء. وهذا سيضمن أن MSCs مستعدون للثقافة المشتركة عندما تكون الشبكات بطانية استعداد.
7. استخدام مجهر الحقل مشرق لمتابعة حلقة الابهر المقايسة غشائي شبكة التنمية (انظر الشكل 1 كمرجع لتطوير شبكة الأمثل). مرة واحدة الجانب المتعلق بشبكات غشائي كما هو مبين في الشكل 2، المضي قدما في إعداد حلقة الابهر المقايسة-ماجستير ثقافات المشارك (الفرع 3). الرجوع إلى الخطوة 4، 1 لمزيد من التفاصيل للتصوير بالشبكات غشائي.

2. زراعة الأنسجة

1. تحضير حلول الأسهم وسائط زراعة الأنسجة.
   1. "هوكبفكس FTM الثقافة" (المحددة سابقا، ن ≥ 3 خطوط مستقلة لكل) ³⁰ وبمسكس المتاحة تجارياً في ألفا-الفنزويلية وتستكمل مع 10% FBS و 1% P/س.
   2. تعقيم وسائل الإعلام استخدام 0.2 ميكرومتر المسامية حجم تصفية الزجاجات.
   3. تخزين الحلول وسائل الإعلام مستعدة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
2. الثقافات بمسك والحفاظ على هوكبفك FTM في حاضنات هوميديفيد والمرور في كونفلوينسي 70-80% يحددها الطوري. استخدام وحدات التخزين المناسبة لوسائل الإعلام لحجم طبق استنبات الأنسجة المستخدمة (أي 10 مل في صحن 10 سم). استخدام هذه الشروط الثقافة للحفاظ على وباساجينج MSCs-
ننأى
3. مونولاييرس لجنة السلامة البحرية باساجينج أو حلقة الابهر المقايسة-ماجستير اشتركت الثقافات استخدام حل إنزيم الانفصال (طبق مل 4/10 سم) واحتضانها في الحاضنات هوميديفيد للحد الأدنى 3 ضمان المفرزة من الخلايا باستخدام مجهر الحقل مشرق؛ واحتضان لمدة 1-2 إضافية دقيقة إذا لزم الأمر-
4. نقل الخلايا معزولة إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 غرام x للحد الأدنى 5
5. نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلايا وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من وسائط الإعلام الثقافة المناسبة (ألفا-الفنزويلية الإعلامية الكاملة باساجينج الخلايا أو FBS المراعية للثقافات المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم الابهر) لعد استخدام عداد خلية.

3. إعداد "الابهري الثقافات" المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم

المضمنة

1. 10 البذور ⁴ MSCs في كل حلقة الابهر (9,000 الخلايا/سم ²/12-جيدا لوحة). استناداً إلى العدد فحوصات حلقة الابهر، وصمة عار قبل MSCs بصبغة الفلورسنت قابلة للحياة، نونترانسفيرابل. صيانة الآبار ثلاثة على الأقل من حلقات الابهر دون MSCs لمجموعة مراقبة.
   1. بوصمة عار 10 ⁵ MSCs/mL EBM-FBS الإعلامية، إضافة 2.5 ميليلتر لصالحه، مزيج وسائط صبغة الفلورسنت غير قابلة للتحويل/مليلتر (5 ميكرون) إلى الأنبوبة 15 مل ومكان في الحاضنة هوميديفيد عن 30 دقيقة بلطف الأنبوب في منتصف الطريق من خلال الاحتضان.
   2. التالية 30 دقيقة بالحضانة، إضافة إلى حجم 1 من FBS EBM الطازجة إلى الخلايا الملون وتدور في ز 400 x للحد الأدنى 5
   إعادة وقف بيليه الخلية في 1 مل الإعلام EBM FBS
   3. وإزالة المادة طافية. تأكيد تلطيخ ناجحة من MSCs استخدام مجهر الأسفار.
2. إزالة اللوحات المحتوية على حلقة الابهر من الحاضنة هوميديفيد وإزالة 500 ميليلتر من EBM FBS من كل بئر.
3. البذور بعناية 10 ⁴ MSCs في 500 ميليلتر من EBM FBS في كل حلقة الابهر جزءا لا يتجزأ من بيبيتينج بالتساوي حول شبكات بطانية. ضمان التوزيع حتى بالهز برفق لوحة الثقافة.
   1. إضافة FBS EBM إضافية لضمان أن الحجم الإجمالي لوسائط الإعلام بشأن ثقافات المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم الابهري ميليلتر 1,000-
4. استخدام مجهر الأسفار لتصور MSCs المسمى فلوريسسينتلي في مقايسة خاتم الابهري.

4-الفحص المجهري

1. مجهرية مشرق الحقل استخدام الصورة في شبكات غشائي الفئران قبل حلقة الابهر المقايسة/الماجستير اشتركت الثقافات لقياسات أساسية (يوم 0) من خصائص الشبكة غشائي (مثلاً، شبكة طول شبكة الحلقات). الصورة 4 أرباع الدائرة الواحدة جيدا من الطوق الابهر إلى الجزء الأبعد من الشبكة البطانية داخل هذا رباعي. شبكات خاتم
   1. الصورة الابهري عقب حلقة الابهر المقايسة/ماجستير الثقافات شاركت في أيام 3 و 5 و 7. استخدم هذه الصور لقياس تأثير لجنة السلامة البحرية على تطوير شبكة غشائي.
2. استخدام مجهر الأسفار للصورة MSCs المسمى مسبقاً في مقايسة حلقة الابهر. الثقافات
   1. ح من حلقة الابهر المقايسة/ماجستير التالية 24 المشارك، واستخدام مجهر الأسفار تصور صاروخ موجه لجنة السلامة البحرية، واستطالة والتكامل مع الشبكات بطانية. تتداخل الصور الفلورية من MSCs مع الصور الميدانية مشرق من خلايا بطانية لمراقبة كولوكاليزيشن من كل أنواع الخلايا.
   2. صورة MSCs المترجمة داخل شبكات غشائي المتقدمة الدانية للنسيج الدائري الابهر، و MSCs المترجمة داخل حديثا تطوير الشبكات البعيدة للنسيج الدائري الابهري ( الشكل 2).

5. التدفق الخلوي وقبكر

1. يوم واحد قبل الناي بشبكات غشائي حلقة الابهر، ذوبان الجليد ديسباسي المجمدة في 4 درجات مئوية س/أ. القسم 5.3 مطابق للتدفق الخلوي و qPCR.
2. دافئ 50 مل من ديسباسي و 50 مل من التربسين 0.5% في حمام المياه أو حبة 37 درجة مئوية.
استرداد
3. الخلايا للتحليل من ثقافات المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم الابهري.
   1. بعد 1 أسبوع حلقة الابهر المقايسة/ماجستير ثقافة المشارك، قم بإزالة وسائط الثقافة وإضافة 1 مل من فوسفاتيبوفيريد المالحة (PBS) ببطء كل جيدا لمدة 3 دقائق وإزالة. كرر هذا يغسل مرتين أكثر.
   2. إضافة 800 ميليلتر من قبل استعد ديسباسي لكل بئر واحتضانها في الحاضنات هوميديفيد عن 15 دقيقة
   3. إزالة اللوحات من حاضنات هوميديفيد وتعليق ديسباسي من بيبيتينج (5-10 x) لتفريق BME نقل محتويات كل بئر في أنابيب منفصلة 15 مل.
   4. كرر الخطوة 5.3.3 مرة أخرى مع ديسباسي قبل حرارة جديدة حتى لا تبقى BME الملاحظ في الثقافة أيضا. إضافة إلى حجم 1 من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% FBS إلى تعليق خلية ديسباسي لإلغاء تنشيط في ديسباسي. إزالة الخواتم الابهري العائمة في تعليق خلية باستخدام تلميحات ماصة.
   5. تدور تعليق خلية في 400 x ز لإزالة الحد الأدنى 5 المادة طافية بعناية، تاركاً 3 مل تعليق خلية في أنبوب 15 مل.
      ملاحظة: بيليه واضح ومتين قد لا تكون مرئية ولكن BME وخلايا موجودة.
   التربسين
   6. أضف 3 مل من بريوارميد 0.5% إلى تعليق خلية ونشاط الخلايا ريسوسبيند (5-10 x من بيبيتينج). تبني الحلول الخلية تريبسينيزيد في حاضنات هوميديفيد للحد الأدنى 10
   إزالة تعليق خلية تريبسينيزيد من حاضنات هوميديفيد
   7. وإضافة 6 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% FBS وريسوسبيند تيم قليلةوفاق. تدور تعليق خلية في 400 غرام x للحد الأدنى 5
   8. بعناية إزالة جميع المادة طافية، تاركاً بيليه الخلية في الأنبوب وريسوسبيند الخلايا في 1 مل برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% FBS في كل أنبوبة.
   تصفية
   9. تعليق خلية 1 مل باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة الخلايا المجمعة و BME المتبقية من تعليق خلية. عد الخلايا الموجودة في 1 مل تعليق خلية باستخدام عداد خلية.
4. إعداد الخلايا للتدفق الخلوي. تعليق
   1. إينكوباتي الخلية (10 ⁵ خلايا في 200 ميليلتر PBS تستكمل مع 3% FBS) مع الأجسام الأولية (فيتك أو APC) مترافق fluorophore (هيئة تنظيم الاتصالات-1-85-، CD146، CD31) تركيز = 01:40) عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، محمية من الضوء.
      ملاحظة: كان الأمثل التدفق الخلوي ل MSCs قبل هونغ et al., 2013 ²⁸. الحد ني خلايا 10,000 مطلوب لقراءات دقيقة.
   2. بعد في الحضانة و 30 دقيقة، ريسوسبيند الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% FBS وأجهزة الطرد المركزي (400 x ز، 5 دقيقة)-
   3. الخلايا تبقى في 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى تحليل بالتدفق الخلوي (الأحداث على الأقل 1 × 10 ⁴) ضمن ح 1. الاستراتيجية النابضة، انظر التكميلية الرقم 1. فرز البشرية MSCs استخدام مكافحة-هيئة تنظيم الاتصالات-1-85 (APC) (تركيز: 01:40 وفي 0.5% FBS/برنامج تلفزيوني) وفرز الخلايا إلى 350 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية لتحليل qPCR.
      ملاحظة: يمكن تخزين تفكيك خلايا في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر لتحليل قبكر المستقبل-
5. إعداد الخلايا لتحليل قبكر.
   1. عزل الحمض النووي الريبي من تفكيك الخلايا باستخدام مجموعات عزل الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي والجودة-
   2. كدنا تحضير من يصل إلى 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي للواحد 100 ميليلتر المنتسخة العكسية رد فعل. القيام بخطوة ما قبل تضخيم إذا كانت منخفضة الغلة الحمض النووي الريبي (< 10 نانوغرام/ميليلتر). استخدام أقل من 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي سيؤدي إلى ارتفاع معدل السلبيات الكاذبة.
      ملاحظة: يمكن تخزين القوالب كدنا في-20 درجة مئوية لمزيد من التحليل لمدة تصل إلى 4 أشهر.
   أداء
   3. قبكر استخدام الأوعية التعبير صفائف منشئ ملفات التعريف للكشف عن التغييرات في التعبير الجيني. استخدام 5 نانوغرام من كدنا كل رد فعل (دورات 40، 60 درجة مئوية الصلب/توسيع نطاق درجة الحرارة). التعبير عن تغير إضعاف التعبير مقارنة بعينات كدنا MSC المشتقة غير متمايزة. تشغيل عناصر التحكم المناسبة السلبية (حلقة الابهر دون MSCs البشرية)-

6. شبكة القياس الكمي التالية الابهري حلقة الإنزيم/ماجستير المشارك "الثقافات"

1. تحميل برامج التصوير مثل ImageJ جنبا إلى جنب مع "محلل الأوعية" المساعد ³¹-
2. استيراد الصور الشبكة البطانية التي اتخذت وفتح باستخدام البرمجيات-
3. تحويل مقاييس الصورة استناداً إلى مواصفات المجهر المستخدمة.
4. استخدام أداة الخط مستقيم لقياس نمو شبكة شعاعي.
5. عد الحلقات غشائي شبكة باستخدام أداة العداد الخلية (ينبغي أن يكون كمياً الحلقات مع الجانبين على الأقل 4)-
6. للقياس الكمي إضافية من خصائص شبكة الاتصال، استخدام البرنامج المساعد "محلل الأوعية" أو الإضافات الأخرى المماثلة لتحليل قطاعات رئيسية، إجمالي طول الجزء، مجالات الشبكة الكلية، وعدد من الوصلات. استخدم أداة قناع غير واضحة لطمس الأنسجة حلقة الابهر والمساحات الفارغة لتجنب عمليات حسابية إيجابية زائفة.
7. نقل القيم إلى إحصاءات البرنامج والرسم البياني غشائي خصائص شبكة اتصال بعد ثقافات المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم الابهري.

النتائج

تدفق العمل التخطيطي لإنشاء المقايسة ثقافة المشارك الابهري خاتم/ماجستير يتجلى في الشكل 1. وتشمل الخطوات الرئيسية: الفئران الشريان الاورطي العزلة وتمزيقها وتضمين الخواتم الابهري، رصد تنتشر بطانية وتطوير الشبكة، وأخيراً وضع العلامات والقائمة MSCs. الجدول ا?...

Discussion

هناك عدة مراحل حاسمة في إعداد مقايسة حلقة الابهر ناجحة ماجستير ثقافة المشارك التجربة. أولاً، أهم الخطوات عند عزل وتقطيع الشريان الاورطي: 1) الحصول على حصرا في الجزء الصدري من الشريان الاورطي؛ 2) بعناية إزالة الأوعية الدموية المتفرعة والضامة والأنسجة الدهنية و؛ 3) قطع المقاطع حتى من الشريان ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alpha-MEM	Gibco	12571071	For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85	R&D Systems	FAB3195A	Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel)	Corning	354234	For aorta embedding
Bullet-kit	Lonza	CC-3162	Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo-fisher	C2925	For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope	Olympus		For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase	StemCell technologies	7923	For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels	VWR	21909-654	For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM)	Lonza	CC-3156	Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade	VWR	97064-768	To sterilize surfaces
EVOS	Life Technologies		In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)	GE Healthcare	SH3039603	Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody	BD	558068	Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody	BD	560846	Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps	Almedic	7727-A10-704	For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-094	1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	51026410	For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array	Qiagen	PAHS-024Z	Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ			Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II	BD		UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit	Qiagen	330421	For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit	Qiagen	330451	Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors	Fine Science Tools	14059-11	For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze	VWR	3084	To dampen and sterilize chest fur
TrypleE	Thermo Fisher Scientific	12605036	MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit	Thermo Fisher Scientific	566-0020	To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco	25200056	For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes	Corning	25382-428	For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates	Corning-Sigma Aldrich	CLS3513	For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube	BD Falcon	352096	For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer	Fisherbrand	22363548	To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting