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要約

ここでは、prelabelled の間葉系細胞がラット大動脈由来血管内皮ネットワークとの共培養して大動脈リング測定の新たな応用を提示します。この手法では、間葉系間質細胞 (MSCs) ホーミングと内皮細胞ネットワークとの統合の可視化、ネットワークのプロパティの定量化と MSC immunophenotypes と遺伝子発現の評価をことができます。

要約

血管新生は複雑で規制の厳しいプロセスを提供し、適切な組織灌流を維持する役割を担います。十分な血管のメンテナンスおよび病理学的奇形は、過度に豊富な血管新生は癌や炎症性疾患に関連付けられている重篤な虚血性疾患の起因できます。プロ血管新生療法の有望なフォームは、血管を新しく開発するため規制の要因だけでなく、物理的なサポートを提供することができます血管新生細胞源の使用です。

間葉系間質細胞 (MSCs) は、虚血や炎症を起こしている組織に家を検出してそのパラクライン効果と自分の能力のための血管再生のため広範囲調査候補です。特に、最初の学期はひと臍帯血管周囲細胞 (FTM HUCPVCs) の周皮細胞のような性質、高い増殖能とポテンシャル、免疫特権プロパティ、および堅牢なパラクリンのための非常に有望な候補者プロファイル。潜在的血管新生細胞を効果的に評価、信頼性の高いにそれらと「翻訳」の前臨床アッセイをテストする前提条件です。大動脈リング アッセイは管状の内皮構造の簡単な定量化を可能、ホストからアクセサリー支持細胞と細胞外マトリックス (ECM) を提供します、炎症性成分を除外、 ex vivo血管新生モデル高速かつ安価で設定します。これは生体内でモデル (例えば、角膜の試金、マトリゲル プラグ法) と比較されたとき有利です。大動脈リング アッセイは、投与細胞を追跡し、異種免疫拒絶反応を回避しながら細胞間の相互作用を観察できます。

応用発展途上ラット大動脈内皮細胞ネットワークとの共培養でヒト MSCs を含む大動脈リングの試金のためのプロトコルを提案します。この試金は、チューブの形成と物理的周皮細胞のような相互作用を開発する MSC の貢献とその効力積極的に血管新生のサイトに移行するため、実行して仲介する能力を評価するための分析ECM の処理。このプロトコルは、次の共培養 MSC の表現型と遺伝子発現の変化に関するさらに詳しい情報を提供します。

概要

血管新生の複雑なプロセスを向上させるし、既存の血管1から新しい血容器開発を促進することによって組織の灌流を維持します。それプロ血管新生と血管新生因子によって厳しく規制された、バランスの取れたプロセスです。このシステムの不備不足容器メンテナンスや成長、心筋疾患、脳卒中、神経変性疾患など重篤な虚血性疾患を引き起こす可能性があります。しかし、誇張された血管の開発は、がんや炎症性疾患2などの条件のための特徴です。

有利な組織の再生を達成するために血管新生を制御することを目指す治療法の開発は、重要です。広汎な前臨床および臨床調査にもかかわらずプロ血管新生因子とマイクロ Rna を用いた血管新生を刺激する試みは、望ましい結果3,4,5を達成するために失敗しました。一時的な効果のある可能性があります: 血管新生タンパク質と核酸、有限数の限られた寿命は成長因子6,7を対象とします。可溶性血管新生因子が血管新生を開始するために不可欠であるメンテナンスや血管の機能サポートするペリサイトおよび平滑筋細胞8を含むセルの種類に依存します。プロ血管新生療法の分野は、血管、さらに差別化の自己更新または物理的に新しくサポート開発中血管新生因子、ローカルを提供可能性があります潜在的な幹細胞と前駆細胞源を模索しています。血管内皮細胞 -9,10。これらの機能の要件を満たすために機能を備えた携帯型最適な血管新生を見つける虚血組織再生のための大きい約束を保持します。

潜在的な細胞ベースの治療法を臨床試験に正常に訳し、前臨床試験の有効性を実証し、血管新生機構の解明を強調表示する必要があります。確立された血管新生アッセイの数が多いにもかかわらず、フィールドは確実に潜在的な候補のセル型11,12,の有効性を評価できる「ゴールド スタンダード」の in vitroアッセイを欠いている13. ほとんどの in vitro血管新生アッセイ (内皮細胞の増殖, 移行および管の形成アッセイを含む) 通常内皮細胞表現型変化や分化細胞や化合物の効果の評価鋼管およびネットワーク構造14,15。これらの機能は血管新生に重要な「翻訳」アッセイも評価: 1) 豊胸術や血管や平滑筋細胞、2) ECM や基底膜の処理を含むサポートのセル型の交換と 3)。機能的な血管の形成を促進する効率。角膜アッセイ、マトリゲル プラグ アッセイを含む血管新生モデル生体内でユニークな生体内の微小環境を再現が追跡管理セルの難易度物理的な相互作用の観察に挑戦しています。さらに、生体内でモデル、潜在的な同種細胞療法の候補者16のテスト中 xeno 免疫拒絶反応が行われます。特に大動脈リング分析を提供できる血管新生モデル前のヴィヴォ: 1) 簡単に観察、3) ECM ホストや人工の電源で 4) 炎症性の排除 2) アクセサリー支持細胞管状構造の定量化コンポーネント、および 5) 迅速かつ安価なセットアップ17,18。通常、大動脈リング アッセイは、小さな分泌蛋白質、薬理学的エージェント、およびトランスジェニック齧歯類モデル19,20,21の血管新生可能性をテストできます。

MSCs は、その傍分泌を介する効果22,23,24を通じて主に血管再生医療の有望な候補です。MSCs は、血管内皮増殖因子 (VEGF)、肝細胞増殖因子 (HGF) を含む主要血管新生因子を分泌する示されているインスリン様成長因子 1 (IGF-1)、基本的な線維芽細胞成長因子 (bFGF) と angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26。また、MSCs を検出することができ、虚血性または炎症に家組織、ただし、厳密なメカニズムはまだ調査中では。ますます、文献はほとんど MSCs 血管周囲細胞から生じるし、共同周皮細胞マーカーを表現し、ペリサイト27のように振る舞うことができる仮説をサポートします。HUCPVCs は、若いひと臍帯の血管領域から派生した MSCs の源です。彼らは、周皮細胞のような性質を持つ MSCs の人口を表し、FTM と用語のへその緒から特徴づけられています。FTM の HUCPVCs は CD146 と NG2、高い増殖能とポテンシャルの免疫特権プロパティを含む周皮細胞マーカーの高発現を示す、堅牢なパラクリン プロファイル28を表示します。FTM の HUCPVCs は、新しい血管周皮細胞のようなプロパティを介しての推進により負傷した組織の再生を促進するための理想的な候補者セル型です。

血管新生の可能性と人間の MSCs の周皮細胞のような性質をテストするのには血管新生アッセイの非常に限られた数が肯定的な利用可能な angiotropic 移行 (以下「ホーミング」という)、ECM 処理、および物理的な開発細胞のタイプ間の相互作用は、血管の開発に関する定量的データを取得しながら調べることができます。

ここ大動脈リング試金の新規アプリケーションを記述するプロトコルを提案する.人間の MSCs は発展途上ラット由来大動脈内皮細胞ネットワークとチューブの形成、成熟および恒常性への貢献を評価するために共培養.このバージョン大動脈リング アッセイの評価能力とホーム新生のサイトに実行し ECM 処理を仲介し、周皮細胞のような物理の確立を通じて内皮の管状の発展に貢献する細胞療法候補者の効能相互作用。培養内皮細胞ネットワーク形成の MSCs の純効果の定量化、細胞間の相互作用を観察することに加え、我々 はまた MSCs を共培養から分離するためのプロトコルを最適化されています。フローサイトメトリーと qPCR を実行、次の共培養 MSC の表現型と遺伝子発現の変化を特徴づけることが可能です。モデル セル型として発生初期と比較した (胎児期) と人間の MSCs の後半 (大人) ソース: FTM HUCPVCs とひと骨髄由来 MSCs (ボーマン)、大動脈リング アッセイで、それぞれ。とき血管再生への応用の検討の下で任意の物理的にサポートのセル型の血管新生の可能性を研究する大動脈リング試金を使用することができることを提案します。

プロトコル

動物を含むすべての研究が行われ、到着のガイドライン 29 によると報告します。制度上の研究倫理委員会の承認 (南軍兵数 4276) とすべての研究を行った。プロシージャは大学健康ネットワーク (トロント、カナダ)、動物の世話委員会によって承認されたすべての動物、すべての動物を受け取った ケアおよび実験動物の使用のためのガイド、8 th 版 (に準拠して人道的なケア国立衛生研究所健康 2011年).

1。 大動脈リング アッセイ セットアップ

  1. 分離ラット大動脈。
    1. 安楽死 8 - 10 週齢ラット CO 2 窒息を使用して: 20% にセット CO 2 室ガス交換 (流量商工会議所ボリューム/分 × 0.2 =)。胸の触診でピンチの反射と心ビートの有無によって確認します
      2. 。
    2. には、70% エタノールで滅菌ガーゼを使用して胸の部分の毛が濡れています。胸部正中に切開を行いますし、皮膚や筋肉層を切って滅菌ピンセットとハサミを使用します
      3. 。
    3. 胸郭を公開すると、一度は両側に胸郭をカット、それぞれの側に胸骨から上方約 5 mm を折る。新鮮な死体の肋間動脈からいくつかの出血が予想される
      4. 。
    4. は、大動脈を公開する解剖学的右サイドに肺と心臓をプッシュします。大動脈は、ホワイト色に位置する容器の脊柱に隣接して
      5. 。
    5. (後に大動脈アーチ) 大動脈をピンチし、大動脈を鉗子で保持しながら最初の切開する外科はさみを使用する鉗子を使用します。大動脈を切断時に胸腔内がすぐに血でいっぱい、その血液凝固する前に大動脈を取得するすぐに動作するが重要です
      6. 。
    6. 大動脈を保持し、脊柱から大動脈から下を優しく皮使用鉗子。プルはさらに切開することがなく肋間動脈を断ちます。大動脈腹腔内に 2 つの枝に分かれるし、死体から大動脈を切断する前に、および/または組織の約 10 cm を取得します。尾側方向に下大動脈のセクションへのアクセスを得るために必要な場合は、ダイヤフラムをプッシュします
      。 注: は、強烈な力を引き裂くことを引き起こすので、大動脈を優しくはがします。大動脈涙が、数秒間の血液凝固を許可する、ペーパー タオルを使用して凝固血液を削除する残りの大動脈の可視性を許可します
      7. 。
    7. 大動脈が冷たいハンクの 10 mL と 15 mL チューブ、' s 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) を添加したバランスの取れた塩ソリューション (HBSS)。氷のチューブを維持
      注: 大動脈組織が氷の上の 1-2 時間続くことができますが、それをできるだけ早く処理することをお勧めします
      8. 。
  2. 滅菌バイオ キャビネット (BSC) の大動脈リング アッセイ培地を準備します。
    1. 血管内皮成長培地 (EGM) 2% 胎仔ウシ血清 (FBS) があり、1% ゲンタマイシンと成長要因 (材料の表 を参照) を添加した内皮細胞基本培地 (EBM) の 500 mL をフィルターろ過装置を使用しての準備。37 でビードまたは水浴にフィルター選択されたメディアの 50 mL を配置 ° C
    2. 100 mL をフィルター処理する別のろ過装置を使用して 2 %fbs と 1% を添加した EBM の P/S を準備、EBM 2 %fbs (EBM FBS) し、4 で保存 ° C
  3. コート 12 ウェル培養プレート底面の膜抽出 (BME) との氷の上の作業中。
    1. (大きな氷のパックやトレイ) 冷たい表面上 12 ウェル プレートの場所。200 μ L/ウェルたて解凍 BME を使用してのピペット チップを冷蔵し、均一なコーティングをように BME を渦を追加します。すぐに、BME の不均一な重合を避けるため作業
      。 注: 一般的な大動脈切除 20 大動脈リングが得られます。大動脈リング アッセイ間の可変性を考慮するには、治療グループごとの少なくとも 3 つの大動脈リング アッセイをセットアップし、コントロールが含まれます。治療グループごと 6 リングお勧めソースを許可する場合
      2. 。
    2. 加湿インキュベーター (95% 相対湿度、37 ° C、5% CO 2; 以下加湿インキュベーターのすべてのステップに適用されますこれらの条件) にコーティング プレートを配置 30 分場所 1,000 μ L ピペット チップは-20 ° C、1.5.3 のステップにします
      。 注意: 基底膜抽出ストック濃度で使用されますが、その一貫性と剛性厳密にによって制御されます重合時間。すべての緯線と独立した実験の正確な同じ重合時間を維持することを確認します
      3. 。
  4. 均一リングに大動脈をセクションします。
    1. 15 mL チューブから大動脈を取るし、10 ml の 1% を添加した新鮮な HBSS の 10 cm 皿に配置 P/s.
    2. は、慎重に別の余分な結合組織、脂肪組織、肋間動脈の残りの枝のメスが大動脈に接続して使用するのに鉗子の 2 つのセットを使用します。これは、残存組織の異なるレベルに基づくリング ユニット間の可変性を軽減されます。任意の残留凝固中に大動脈から血液削除します
      3. 。
    3. は、正確に 1-2 mm 滅菌メスや鉗子を用いた大動脈の広いセクションをカット 10 cm 皿 [ルーラーまたはグリッドを配置します。ユニット間の可変性を減らすためにできるだけ正確なセクションをカットします
      4. 。
  5. BME に大動脈リングを埋め込む
    。 注: BME 重合孵化前に大動脈リングの断面を完了していない場合、加湿インキュベーターからコーティング プレートを削除し、重合を終了する各ウェルに 100 μ L の EBM を追加します。正確なタイミングは、BME の過剰の重合が内皮細胞ネットワークの開発と細胞の移行を妨げる可能性がある重要です。大動脈リングの準備が、井戸から EBM を削除し、1.5.2 のステップから続行します。
    1. 加湿インキュベーターからコーティング BME 井戸を外し、BSC に戻ります
      2. 。
    2. は慎重に鉗子で大動脈の個々 のリングをピックアップし、各 BME コーティングも真ん中に 1 つを置きます。残り大動脈リングの繰り返し
      。 注意: 大動脈リングと共に転送メディア保管すべき重合の不規則性を避けるために最小限
      3. 。
    3. 使用冷却 (-20 ° C) 1,000 μ L ピペット チップ各大動脈リング上に BME の 300 μ L を追加し、よく周りの BME を均等に分散します
      4. 。
    4. 30 分の加湿のインキュベーターに埋め込まれた大動脈リングを返す
    5. 加湿インキュベーターから埋め込まれた大動脈リング プレートを削除し、徐々 にピペットを配置することによって EGM (準備で暖められたステップ 1.2.1) の 1,000 μ L はよく文化の壁にヒントを追加します
      。 注: BME にメディアを直接ピペッティング重合 BME を中断でき連続内皮細胞ネットワークの開発を妨げます。可能な場合は、適切なマルチ チャンネル ピペットを使用します
      6. 。
    6. 次の 24 h、EGM の 1,000 μ L を削除し、EBM FBS も文化の側に対してゆっくりとピペッティングで再度 1.2.2 の手順で準備の 1,000 μ L で置き換えます
      7. 。
  6. 500 μ L 新鮮な EBM FBS (37 ° C) のすべての 48 h. EBM FBS の 500 μ L を置き換えることによって大動脈リング アッセイを維持
    注: 参照秒ション 2 大動脈リング アッセイ確立として同じ日に MSC 文化の展開を開始します。これが準備を整える MSCs 培養内皮細胞のネットワークが準備ができているとき
    7. 。
  7. 大動脈リング アッセイ内皮細胞ネットワークの開発を追跡する明視野顕微鏡を使用して (ネットワークの最適な開発のための参照として 図 1 を参照)。内皮細胞ネットワークの側面は 図 2 に示すように、大動脈リング アッセイ MSC 共培養 (セクション 3) の設定に進みます。手順 4.1 内皮細胞ネットワークをイメージングの詳細についてを参照してください
    8. 。

2。組織培養

  1. 組織培養メディアの貯蔵液を準備します。
    1. 文化 FTM HUCPVCs (以前に確立された、n ≥ 各 3 系統独立) 30 と 10 %fbs と 1% を添加したアルファ MEM で市販 BMSCs P/s.
    2. 0.2 μ m 孔サイズ フィルター ボトルを使用してメディアを滅菌します
      3. 。
    3. までの 3 週間の 4 ° C で準備されたメディア ソリューションを格納します
      4. 。
  2. 加湿インキュベーターと位相差顕微鏡による決定 70-80% の confluency に通路で FTM HUCPVC の維持とボーマンの文化。細胞培養用ディッシュのサイズのためのメディアの使用適切なボリュームを (すなわち 10 cm 皿に 10 mL) 使用。これらの培養条件を維持すると、MSCs を継を使用します
    3. 。
  3. 分離継の MSC 単分子膜または大動脈リング アッセイ MSC 解離酵素液 (4 mL/10 cm 皿) を使用して共培養し 3 分明視野顕微鏡を用いた細胞の確認剥離加湿インキュベーターで孵化させなさい; インキュベートさらに 1-2 分必要な場合に
    4. 。
  4. 15 mL チューブと 400 x g で 5 分間遠心分離に解離細胞を転送
  5. 細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引し、細胞カウンターを使用してカウントするため適切な培養基 (アルファ MEM 大動脈リング分析/MSC 共培養の細胞または EBM FBS を継の完全なメディア) の 1 mL の細胞を再懸濁します
    6. 。

3。大動脈リング分析/MSC 共培養の準備

  1. シード 10 4 MSCs それぞれに埋め込まれた大動脈リング (9,000 のセル/cm 2/12 ウェル プレート)。実行可能で、譲渡の蛍光色素を MSCs を染色前大動脈リング試金の数に基づいて。コントロール グループの MSCs なし大動脈リングの少なくとも 3 つの井戸の維持管理します。
    1. 10 5/mL の MSCs EBM FBS メディアの汚れは、実行可能な 2.5 μ L を追加、非譲渡蛍光染料/mL メディア (5 μ M) 15 mL チューブと 30 分の加湿器の中の場所には優しく孵化の途中の管をミックスします
      2. 。
    2. 次の 30 分培養陽性細胞に新鮮な EBM FBS の 1 ボリュームを追加し、400 x g で 5 分間で回転
    3. は、上澄みを除去し、再 EBM FBS メディアの 1 mL の細胞ペレットを中断します。蛍光顕微鏡を用いた MSCs の成功した染色確認します
      4. 。
  2. 加湿インキュベーターから大動脈リング含むプレートを外し、各ウェルから EBM FBS の 500 μ L を削除します
    3. 。
  3. は、内皮細胞のネットワークの周りに均等にピペッティングして 500 μ L EBM FBS の各埋め込み大動脈リングの上の 10 の 4 MSCs を慎重にシードします。培養プレートを優しく揺することによって均一な配分を確認します。
    1. 大動脈リング分析/MSC 共培養上のメディアの容量が 1,000 μ L であることを確認する追加 EBM FBS を追加します
      2. 。
  4. 大動脈リング試金の蛍光標識 MSCs を可視化する蛍光顕微鏡を使用します
。

4 顕微鏡

  1. 大動脈リング分析/MSC 前にラットの血管内皮ネットワークのイメージを使用して明視野顕微鏡共同培養内皮細胞ネットワークのプロパティ (たとえば、ネットワークのベースライン (0 日) 測定。ネットワーク ループ長さ)。4 象限領域内の内皮細胞ネットワークの最も遠いセクションに大動脈リングからウェルあたりをイメージします。 次の大動脈リング
    1. イメージ、大動脈リング ネットワーク分析/MSC は 3、5、7 日間で共培養します。内皮細胞ネットワークにおける MSC の効果を定量化するこれらのイメージを使用します
      2. 。
  2. 大動脈リング分析済みラベル MSCs をイメージさせる蛍光顕微鏡を使用します。
    1. 次 24 h 大動脈リング分析/MSC の共培養では、蛍光顕微鏡を使用して、MSC ホーミング, 伸び, 内皮細胞のネットワークとの統合を視覚化します。両方の細胞の種類の共局在を観察する内皮細胞の明視野画像で MSCs の蛍光画像を重複します
      2. 。
    2. 画像近位大動脈リング組織開発の内皮ネットワーク内でローカライズ MSCs と遠位大動脈リング組織 ( 図 2) のネットワークを新しく開発内でローカライズ MSCs
      3. 。

5。流れの Cytometry と qPCR

  1. リング大動脈内皮細胞ネットワークを分離する前に 1 日解凍冷凍当期 4 ° c O/N. セクション 5.3 はフローサイトメトリーと qPCR のどちらでも同じです
    2. 。
  2. 50 mL 37 ° C のビーズや水のお風呂で 0.5% トリプシンの当期の 50 mL をウォームします
    3. 。
  3. は、大動脈リング分析/MSC 共培養から解析のためのセルを取得します。
    1. 後 1 週、大動脈リング分析/MSC の共同文化の文化メディアを削除し、1 mL の Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) を外し、3 分もそれぞれにゆっくりとを追加。この洗浄をさらに 2 回繰り返します
      2. 。
    2. 追加 800 μ L の各ウェルに当期で加温し、15 分の加湿のインキュベーターで孵化させなさい
    3. 加湿インキュベーターからプレートを削除し BME で分割する (5-10 x) をピペッティングによる当期を中断し、別の 15 mL の管に各ウェルの内容を転送します
      4. 。 ない残留まで新鮮に予め温めておいた当期で再び
    4. 繰り返しステップ 5.3.3 BME も文化で観察されます。3% を添加した PBS の 1 ボリュームを追加残高当期細胞懸濁液、当期を不活化します。ピペット チップを用いた細胞懸濁液に浮かぶ大動脈リングを削除します
      5. 。
    5. (400 g) x 細胞懸濁液をスピンは、5 分削除上清、慎重に 15 mL チューブに細胞懸濁液 3 mL を残しています
      。 注: 明らかに、固体ペレットが表示されないが、セルと BME がある
      6. 。
    6. は、細胞懸濁液と積極的に (5-10 x ピペッティングで) を再停止しなさい細胞に prewarmed 0.5% トリプシンの 3 mL を追加します。10 分間の加湿のインキュベーターでトリプシンの携帯ソリューションを孵化させなさい
    7. 加湿インキュベーターからトリプシン細胞懸濁液を削除し、3 %fbs と再懸濁します補われる PBS の 6 mL を追加いくつかのティムes。400 x g で 5 分間で細胞懸濁液をスピン
    8. 慎重にチューブに細胞ペレットを残してすべての上澄みを除去し、1 ml の PBS の 3% を添加した細胞を再懸濁します各管内 FBS
      9. 。
    9. は、70 μ m の細胞のストレーナーを使用して細胞懸濁液から集計されたセルと残留 BME を削除する 1 mL 細胞の懸濁液をフィルター処理します。細胞カウンターを使用して細胞懸濁液の 1 mL のセルをカウントします
      10. 。
  4. フローサイトメトリー用セルを準備します。
    1. 加温、細胞懸濁液 (3% を添加した 200 μ L の PBS で 10 の 5 セル FBS) fluorophore 共役 (FITC または APC) 一次抗体と (TRA-1 - 85 - CD146、CD31) 濃度 = 1:40) 4 ° c で 30 分間、光から保護します
      。 注: MSCs のフローサイトメトリー香港 ら、2013年 28 によって最適化を行った。10,000 のセルの最小測定値を正確に必要です
      2. 。
    2. 2 mL の PBS 3 %fbs と遠心分離機 (400 × g、5 分) を添加した細胞を再懸濁します次の 30 分インキュベーションします
      3. 。
    3. 4 ° c 1 時間以内フローサイトメトリー (少なくとも 1 x 10 の 4 イベント) による分析までの光から保護維持セル。ゲーティング戦略 補足図 1 を参照してください。アンチ-トラ-1-85 (APC) を使用して人間の MSCs を並べ替える (濃度: 1:40 0.5 %fbs/PBS) qPCR 解析のためのセル換散バッファーの 350 μ L にセルを並べ替えると
      。 メモ: 分離細胞保存できる-80 ° C で将来 qPCR 解析まで 3 カ月
      4. 。
  5. QPCR 分析用セルを準備します。
    1. 列に基づく RNA 分離キットを使用して分離細胞からの RNA を隔離し、RNA 濃度と品質を決定します
      2. 。
    2. RNA の 100 あたり最大 5 μ g から準備 cDNA μ L 逆転写酵素反応。RNA の収穫が少ない場合、中古増幅は手順 (< 10 ng/μ L)。100 未満の使用 ng の RNA の偽陰性率が高いことになります
      。 注: cDNA テンプレート保存できるさらなる分析のための-20 ° C で 4 ヶ月
      3. 。
    3. は、遺伝子発現の変化を検出する血管新生式プロファイラー アレイを用いた qPCR を実行します。反応 (40 サイクル、60 ° C 温度の熱処理/拡張) あたり cDNA の 5 ng。未分化の MSC 由来 cDNA サンプルと比べた式のフォールドの変更を表現します。適切なネガティブ コントロール (大動脈リング無し人間 MSCs) を実行します
      4. 。

6。ネットワーク定量化次大動脈リング分析/MSC 共培養

  1. 血管新生アナライザー プラグイン 31 と共に ImageJ などイメージング ソフトウェアをダウンロードします
    2. 。
  2. 撮影内皮ネットワーク画像をインポートし、ソフトウェアを使用してを開きます
    3. 。
  3. 使用される顕微鏡の仕様に基づくイメージ スケールを変換します
    4. 。
  4. 放射状ネットワークの成長を測定する直線ツールを使用します
    5. 。
  5. 細胞カウンター ツールを使用して内皮細胞ネットワーク ループをカウント (少なくとも 4 つの側面のループを定量化する必要があります).
  6. ネットワーク プロパティの追加数量マスターのセグメントを分析する血管新生 Analyzer プラグインまたは他の同様のプラグインを使用して合計セグメントの長さは、合計ネットワーク エリア、ジャンクションの数。大動脈リング組織と偽肯定的な計算を避けるために空のスペースをあいまいにぼかしたマスク ツールを使用します
    7. 。
  7. 大動脈リング分析/MSC 共培養を次統計プログラムとグラフ内皮ネットワーク プロパティに値をコピーします
    8. 。

結果

大動脈リング/MSC 共培養法を確立するための作業フローの図は、図 1に示されています。主な手順を含める: ラット大動脈隔離区分し大動脈リングの埋め込み、監視内皮発芽およびネットワークの開発と最後にラベリング、MSCs を管理します。内皮細胞ネットワーク解析のタイムライン共培養期間ごとに実行可能な解析のウィンドウの概要: 日 1、5...

ディスカッション

成功した大動脈リング アッセイ MSC の培養実験を設定するのにはいくつかの重要な段階があります。まず、最も重要なステップを分離し、大動脈を切断するときは、: 1) 大動脈; の胸部のセグメントのみを取得2) 慎重に分岐血管、結合および脂肪組織を削除して。3) 切削各測定間変動を制限する大動脈 (~ 1 mm) のセクションでさえ。第二に、大動脈リングの BME へ埋め込み成功は、この試金のた...

開示事項

博士クリフォード ・ l ・ Librach は、特許の共同保有者:最初の学期臍帯組織由来細胞の分離とファージのメソッド。カナダとオーストラリアで与えられます。

謝辞

著者らは次のスタッフ メンバーに感謝し、研究の人員: Andrée ゴーティエ ・ フィッシャー、マシュー Librach、ターニャ · バレット、Tharsan Velauthapillai、サラ Laronde。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Alpha-MEMGibco12571071For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85R&D SystemsFAB3195AHuman-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel)Corning354234For aorta embedding
Bullet-kitLonzaCC-3162Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA DyeThermo-fisherC2925For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture MicroscopeOlympusFor bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counterInvitrogenC10227Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
DispaseStemCell technologies7923For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpelsVWR21909-654For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered salineSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM)LonzaCC-3156Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology GradeVWR97064-768To sterilize surfaces
EVOSLife TechnologiesIn-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)GE HealthcareSH3039603Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibodyBD558068Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibodyBD560846Human pericyte marker for flow cytometry
ForcepsAlmedic7727-A10-704For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175-0941X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific51026410For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR arrayQiagenPAHS-024ZHuman specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJOpen source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR IIBDUHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycinGibco15140122Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini KitQiagen74104For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand KitQiagen330421For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis KitQiagen330451Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissorsFine Science Tools14059-11For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauzeVWR3084To dampen and sterilize chest fur
TrypleEThermo Fisher Scientific12605036MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unitThermo Fisher Scientific566-0020To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200056For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishesCorning25382-428For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture platesCorning-Sigma AldrichCLS3513For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tubeBD Falcon352096For general tissue culture procedures
70 μm cell strainerFisherbrand22363548To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

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