O ensaio de co-cultura anel aórtico: Uma ferramenta conveniente para avaliar o potencial angiogênico das células estromais mesenquimais em Vitro

Resumo

Aqui, apresentamos uma aplicação nova do ensaio do anel aórtico onde prelabelled as células mesenquimais são co cultivadas com redes endotelial derivado de aorta de ratos. Este novo método permite a visualização de células estromais mesenquimais (MSCs) homing e integração com redes endoteliais, quantificação das propriedades de rede e avaliação de expressão de gene e immunophenotypes MSC.

Resumo

Angiogênese é um processo complexo, altamente regulamentado, responsável pela criação e manutenção de perfusão do tecido adequado. Manutenção de vascularização insuficiente e malformações patológicas podem resultar em graves doenças isquêmicas, enquanto excessivamente abundante desenvolvimento vascular está associado com câncer e doenças inflamatórias. Uma forma promissora de pro-angiogênico terapia é a utilização de fontes de célula angiogênico, que podem fornecer fatores regulatórios, bem como suporte físico para o desenvolvimento de recém vasculatura.

Células estromais mesenquimais (MSCs) são candidatos extensivamente investigados para regeneração vascular devido a seus efeitos parácrina e sua capacidade para detectar e lar de tecidos isquêmicos ou inflamados. Em particular, primeiro trimestre humana cordão umbilical perivasculares células (FTM HUCPVCs) são um candidato altamente promissor devido a suas propriedades como Pericito, alto potencial proliferativo e multilineage, Propriedades imune privilégios e parácrina robusta o seu perfil. Para efetivamente avaliar potencialmente angiogênico células regenerativas, é um requisito para testá-los em confiável e ensaios pré-clínicos "traduzíveis". O ensaio do anel aórtico é um ex vivo modelo de angiogênese que permite a fácil quantificação de estruturas tubulares endoteliais, fornece acessórias apoia células e matriz extracelular (ECM) do host, exclui componentes inflamatórios e é rápida e barata para configurar. Isto é vantajoso em relação na vivo modelos (por exemplo, ensaio da córnea, Matrigel ficha de ensaio); o ensaio do anel aórtico pode rastrear as células administradas e observar interações intercelulares, evitando a rejeição de xeno-imune.

Apresentamos um protocolo para um aplicativo de romance do ensaio do anel da aorta, que inclui a humanas MSCs em culturas co com desenvolvimento rato aórtica endotelial das redes. Este ensaio permite a análise da contribuição da MSC para tubo de formação e desenvolvimento através de interações físicas como Pericito e de sua potência para ativamente migrando para sites da angiogênese e para avaliar sua capacidade de realizar e mediar Processamento de ECM. Este protocolo fornece mais informações sobre as alterações na expressão de gene e fenótipo MSC seguinte co-cultura.

Introdução

O complexo processo de angiogênese melhora e mantém a perfusão do tecido, promovendo o desenvolvimento de embarcação de sangue novo de pré-existente vasculatura¹. É um processo rigidamente regulamentado, equilibrado por fatores pro-angiogênico e antiangiogênico. Qualquer deficiência neste sistema pode conduzir a embarcação insuficiente manutenção ou crescimento, causando graves doenças isquêmicas, incluindo doença do miocárdio, acidente vascular cerebral e doenças neurodegenerativas. No entanto, exagerado desenvolvimento vascular é característica para as condições, incluindo câncer e doenças inflamatórias².

Desenvolvimento de terapias que visam controlar a angiogênese para alcançar a regeneração tecidual favorável é de primordial importância. Apesar de extensas investigações pré-clínicos e clínicas, tentativas de estimular a angiogênese usando microRNAs e fatores de pro-angiogênico conseguiram alcançar os resultados desejados^3,4,5. Possíveis razões para os efeitos transitórios incluem: longevidade limitada de angiogênico proteínas e ácidos nucleicos e o número finito de alvo de fatores de crescimento^6,7. Embora fatores solúveis angiogênico são essenciais para dar início a angiogênese, a manutenção e a funcionalidade da vasculatura dependem de suporte a tipos de células, incluindo células de pericitos e músculo liso⁸. O campo de pro-angiogênico terapias agora é explorar potenciais células-tronco progenitoras célula fontes e que podem fornecer fatores angiogênico localmente, enquanto fisicamente apoiando recém desenvolvido vasculatura, auto renovação ou até mesmo diferenciar em células endoteliais^9,10. Encontrar o ideal angiogênico tipos de células com a capacidade de cumprir estes requisitos funcionais detém uma grande promessa para a regeneração do tecido isquêmico.

Para traduzir com sucesso potenciais terapias baseadas em células em ensaios clínicos, estudos pré-clínicos precisam demonstrar sua eficácia e destacar os mecanismos subjacentes de angiogênico. Apesar do elevado número de ensaios de angiogênese estabelecida, o campo carece de um "padrão-ouro" em vitro ensaio que confiantemente poderia avaliar a eficácia do potencial candidato célula tipos^{11,12, 13}. maioria em vitro angiogênese ensaios (incluindo os ensaios de formação de proliferação, migração e tubo endoteliais) normalmente avaliar os efeitos de células ou de compostos em mudanças fenotípica ou diferenciação em células endoteliais tubular e rede de estruturas de^14,15. Enquanto estes recursos são essenciais para a angiogênese, um ensaio "traduzível" também deve avaliar: 1) o aumento ou substituição do suporte tipos de células, incluindo pericitos ou células musculares lisas, 2) o processamento de ECM e/ou membrana basal, e 3). a eficiência para promover a formação de microvasculatura funcional. Na vivo angiogênese modelos, incluindo o ensaio da córnea e Matrigel plug ensaio, recapitular o microambiente exclusivo na vivo mas são desafiados pela dificuldade de rastreamento administrado células para observar interações físicas. Além disso, em modelos na vivo , xeno-imune rejeição pode ocorrer ao testar potenciais alogênico terapia candidatos¹⁶. Ex vivo angiogênese modelos, particularmente o ensaio do anel aórtico pode fornecer: 1) fácil observação e quantificação de estruturas tubulares, células de apoia 2) acessórias, 3) ECM de host e fontes artificiais, 4) exclusão de inflamatória componentes e 5) instalação rápida e barata de^17,18. Normalmente, o ensaio do anel aórtico pode testar o potencial angiogênico de pequenas proteínas secretoras, agentes farmacológicos e modelos de roedores transgênicos^19,20,21.

MSCs são candidatos promissores para regeneração vascular, principalmente através de seus efeitos mediados por parácrina^22,23,24. MSCs foram mostrados para secretar fatores chave angiogênico incluindo o fator de crescimento endotelial Vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), fator de crescimento do fibroblasto (bFGF) básica e angiopoeitin-1 (Ang-1)^{25 ,26}. Também podem detectar o MSCs e tecidos lar de isquêmico ou inflamadas, no entanto, os mecanismos exatos estão ainda sob investigação. Cada vez mais, a literatura suporta a hipótese de que a maioria MSCs surgem de células perivasculares, co expressam Pericito marcadores e podem comportar-se como pericitos²⁷. HUCPVCs são uma fonte jovem de MSCs derivado da região perivascular do cordão umbilical humano. Eles representam uma população de MSCs com propriedades como Pericito e foram caracterizados de ambos FTM e termo de cordões umbilicais. FTM HUCPVCs demonstram uma alta expressão de marcadores Pericito incluindo CD146 e NG2, alto potencial proliferativo e multilineage, Propriedades imune privilégios e exibir um parácrina robusto perfil²⁸. FTM HUCPVCs são um tipo de célula do candidato ideal para promover a regeneração do tecido lesado através da promoção de Nova vasculatura através de suas propriedades como Pericito.

Para testar o potencial angiogênico e Pericito, como propriedades de MSCs humanas, um número muito limitado de angiogênese ensaios está disponíveis onde positivo angiotropic migração (doravante referida como "homing"), ECM processamento e desenvolvimento da física interações entre tipos de células podem ser investigadas, enquanto a obtenção de dados quantitativos sobre o desenvolvimento da microvasculatura.

Temos a honra de apresentar um protocolo que descreve um novo aplicativo do ensaio do anel aórtico. MSCs humanas foram co cultivadas com desenvolvimento rato-derivado da aorta endotelial das redes para avaliar a sua contribuição para a formação, maturação e homeostase de tubo. Esta versão do ensaio do anel aórtico avalia a capacidade e a potência dos candidatos à terapia celular para casa para sites da angiogênese, realizar e mediar o processamento de ECM, e contribuir para endotelial desenvolvimento tubular através de estabelecer como Pericito física interações. Além de quantificar o efeito líquido de MSCs na formação de rede endotelial em vitro e observando interações intercelulares, nós também Aperfeiçoamos um protocolo para isolar MSCs de culturas co. Realizando qPCR e citometria de fluxo, é possível caracterizar mudanças na expressão de gene e fenótipo MSC co-cultura a seguir. Como tipos de células do modelo, comparamos ontogenetically cedo (pré-natal) e finais (adultas) fontes de MSCs humanos: HUCPVCs FTM e humano derivadas da medula óssea MSCs (BMSC), respectivamente, no ensaio de anel aórtico. Propomos que o ensaio do anel da aorta pode ser usado para estudar o potencial angiogênico de qualquer tipo de célula fisicamente apoio quando sob investigação por aplicações regenerativa angiogênico.

Protocolo

todos os estudos que envolvam animais foram conduzidos e relatados de acordo com orientações de chegada ²⁹. Todos os estudos foram realizados com a aprovação do Conselho de pesquisa institucional ética (número de REB 4276). Animal de todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal do University Health Network (Toronto, Canadá), e todos os animais receberam atendimento humano em conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, 8 ^th edição ( Institutos nacionais de saúde 2011).

1. configuração de ensaio de anel da aorta

1. isolar a aorta de rato.
   1. Euthanize 8 - ratos Sprague-Dawley de 10 semanas de idade usando CO ₂ asfixia: substituição de gás conjunto CO ₂ câmaras para 20% (taxa de fluxo = 0,2 x Câmara volume/min). Confirmar pela ausência de pitada reflexo e o coração bate por palpar peito.
   2. Molhar a pele na área do peito usando gaze esterilizada com etanol a 70%. Usar Pinças esterilizadas e tesoura para fazer uma incisão na linha média do peito e cortar através de camadas de pele e músculo.
   3. , Uma vez que a caixa torácica é exposta, corte a caixa torácica de cada lado e dobre para cima cerca de 5mm do esterno em cada lado. Algum sangramento é esperado de artérias intercostais em cadáveres frescos.
   4. Empurre o tecido do pulmão e do coração para o lado direito anatômico para expor a aorta. A aorta é o branco colorido navio localizado ao lado da coluna vertebral.
   5. Uso de fórceps para beliscar a aorta (após o arco aórtico) e use uma tesoura cirúrgica para fazer a primeira incisão, mantendo a aorta com fórceps. Após cortar a aorta, cavidade torácica vai encher rapidamente com sangue, portanto é fundamental trabalhar rapidamente para obter a aorta antes da coagulação sanguínea.
   6. Uso de fórceps para segurar a aorta e descasque delicadamente a aorta para baixo, longe da coluna vertebral. A atração vai cortar as artérias intercostais sem incisões ainda mais. Obtenção de aproximadamente 10 cm de tecido e/ou antes da aorta se divide em dois ramos na cavidade abdominal e corta a aorta fora da carcaça. Empurre o diafragma se necessário para a direção caudal para obter acesso para diminuir as seções da aorta.
      Nota: Descasque a aorta suavemente porque força intensa pode causar rasgá-la. Se as lágrimas da aorta, permitir a coagulação sanguínea por alguns segundos e use uma toalha de papel para remover o sangue coagulado, permitindo a visibilidade da aorta restante.
   7. Coloque a aorta em um tubo de 15 mL com 10ml de Hank gelada ' s solução sal equilibrado (HBSS) suplementado com 1% penicilina/estreptomicina (P/S). Manter os tubos em gelo
      Nota: O tecido da aorta pode durar 1-2 h no gelo, mas é melhor para processá-la tão rapidamente quanto possível.
2. Preparar os meios de cultura de ensaio do anel aórtico em um armário de biossegurança estéril (BSC).
   1. Preparar o meio de crescimento endotelial (EGM) usando uma unidade de filtração para filtrar 500 mL do meio Basal endotelial (EBM) suplementado com 2% de soro Fetal bovino (FBS), 1% gentamicina e fatores de crescimento (ver Tabela de materiais). Coloque 50ml da mídia filtrada em um banho do grânulo ou água a 37 ° C.
   2. Usar outra unidade de filtração para filtrar 100 mL de EBM suplementado com 2% FBS e 1% P/S para preparou o EBM 2% FBS (EBM-FBS) e armazenar em 4 ° C.
3. Revestimento de placas de cultura de tecidos de 12 poços com extrato de membrana Basal (BME) enquanto trabalhava no gelo.
   1. Lugar uma placa sobre uma superfície fria (grande bloco de gelo ou bandeja) 12. Adicione 200 µ l/poço de recém descongelado usando o BME refrigerado pontas de pipetas e agite o BME para garantir o mesmo revestimento. Trabalhar rapidamente para evitar a polimerização desigual do BME.
      Nota: Uma excisão de aorta típico produz 20 anéis da aorta. Para levar em conta a variabilidade entre ensaios o anel aórtico, configurar pelo menos três ensaios de anel aórtico por grupo de tratamento e incluir um controle. Se permite que a fonte, 6 anéis por grupo de tratamento recomenda-se.
   2. Colocar as placas revestidas em incubadoras umidificadas (37 ° C, umidade relativa de 95%, 5% CO ₂; estas condições se aplicam a todas as etapas da incubadora umidificado daqui em diante) por 30 min. lugar 1.000 pontas de pipetas µ l de retorno em-20 ° C para etapa 1.5.3.
      Nota: Enquanto o extrato de membrana basal é usado em concentração de ações, sua consistência e rigidez é estritamente controlado pelo tempo de polimerização. Certifique-se de manter os tempos de polimerização mesma exata para todos os paralelos e experimentos independentes.
4. Secção da aorta em rodelas uniformes.
   1. Levar a aorta do tubo de 15 mL e coloque-o em um prato de 10 cm com 10 mL de HBSS fresco suplementado com 1% P/S.
   2. Usar dois conjuntos de pinças para separar cuidadosamente o excesso de tecido conjuntivo, tecido adiposo e o uso de um bisturi para os restantes ramos das artérias intercostais ligado a aorta. Isto reduz a variabilidade entre as unidades de anel com base nos diferentes níveis do tecido residual. Remover qualquer resíduo coagulado sangue de dentro da aorta.
   3. Coloque uma régua ou grade sob o prato de 10cm para precisamente seções de corte 1-2 mm largura da aorta usando pinças e bisturi estéril. As seções de corte tão exata quanto possível reduzir a variabilidade entre unidades.
5. Incorporar os anéis da aorta BME.
   Nota: Se o seccionamento dos anéis da aorta não é concluída antes da incubação de polimerização BME, remover as placas revestidas de incubadoras umidificadas e adicione 100 µ l de EBM a cada poço para finalizar a polimerização. Timing exato é crítico como polimerização excessiva do BME pode interferir com a migração de desenvolvimento e célula endotelial rede. Uma vez que os anéis da aorta são preparados, remover o EBM dos poços e continuar da etapa 1.5.2.
   1. Remover os poços BME revestido das incubadoras umidificadas e retornar para o BSC.
   2. Cuidadosamente pegar anéis da aorta individuais com pinça e coloque um no meio de cada poço revestido BME. Repita para os restantes anéis da aorta.
      Nota: Mídia transferida juntamente com o anel da aorta deve ser mantida como mínima para evitar irregularidades de polimerização.
   3. Uso de refrigeração pontas de pipetas (-20 ° C) 1.000 µ l para adicionar 300 µ l de BME no topo de cada anel aórtico e distribuir uniformemente o BME em torno do poço.
   4. Retornar os anéis da aorta incorporados para as incubadoras umidificados por 30 min.
   5. Retire as placas com o anel aórtico incorporado às incubadoras umidificadas e lentamente adicione 1.000 µ l da EGM (preparado e aquecido no passo 1.2.1), colocando a pipeta ponta contra a parede da cultura bem.
      Nota: Pipetar diretamente os meios de comunicação para o BME pode perturbar o BME polimerizado e prejudicam o desenvolvimento contínuo de rede endotelial. Usar uma pipeta multicanal apropriada, se disponível.
   6. Após 24 h, remover 1.000 µ l da EGM e substituir com 1.000 µ l de EBM-FBS preparado na etapa 1.2.2, novamente pipetando lentamente contra o lado da cultura bem.
6. Manter o ensaio do anel aórtico, substituindo 500 µ l de EBM-FBS com 500 µ l de fresco EBM-FBS (37 ° C) a cada 48 h.
   Nota: Veja secção 2 para iniciar a expansão da cultura MSC no mesmo dia como estabelecimento de ensaio do anel aórtico. Isto garantirá que MSCs estejam prontos para co-cultura quando as redes endoteliais estão prontas.
7. Usar a microscopia de campo claro para seguir o anel aórtico ensaio rede endotelial desenvolvimento (veja a Figura 1 como referência para o desenvolvimento da rede ideal). Uma vez que o aspecto de redes endotelial como mostrado na Figura 2, prosseguir com a criação das culturas de co de ensaio-MSC (secção 3) do anel aórtico. Consulte a etapa 4.1 para mais detalhes da imagem latente as redes endoteliais.

2. Cultura do tecido

1. preparar soluções estoque de meios de cultura de tecido.
   1. Cultura FTM HUCPVCs (previamente estabelecidas, n ≥ 3 linhas independentes para cada um) ³⁰ e BMSCs disponíveis comercialmente em alfa-MEM suplementado com 10% FBS e 1% P/S.
   2. Esterilizar a mídia usando garrafas de filtro de tamanho de poro 0,2 µm.
   3. Armazenar as soluções de mídia preparada a 4 ° C por até 3 semanas.
2. HUCPVC de FTM manter e BMSC culturas em incubadoras umidificadas e passagem livre na confluência de 70-80% determinada pela microscopia de contraste de fase. Uso de volumes adequados de mídia para o tamanho do prato de cultura de tecidos utilizados (ou seja, 10 mL em um prato de 10 cm). Use estas condições de cultura para a manutenção e a passagem do MSCs.
3. Dissociar as monocamadas MSC para passagem ou ensaio do anel aórtico-MSC co culturas usando uma solução de enzima de dissociação (prato de 4 mL/10 cm) e faça a incubação de incubadoras umidificadas para 3 min. Certifique-se de desprendimento das células usando microscopia de campo claro; incubar por um adicional 1-2 min, se necessário.
4. Transferir as células dissociadas em um tubo de 15 mL e centrifugar a 400 x g por 5 min.
5. Sem perturbar o centrifugado, Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de uma adequada cultura mídia (alfa-MEM completa para passagem de células ou EBM-FBS para anel aórtico ensaio/MSC co culturas) para a contagem, usando um contador de célula.

3. Preparação de aórtica anel ensaio/MSC culturas co

1. 10 sementes ⁴ MSCs em cada incorporado anel aórtico (9.000 células/cm ² / 12-bem placa). Com base no número de ensaios de anel aórtico, pre-manche os MSCs com tintura fluorescente viável, intransferível. Manter pelo menos três poços de anéis da aorta sem MSCs para um grupo de controle.
   1. Mancha 10 ⁵ MSCs/mL EBM-FBS mídia, adicionar 2,5 µ l de viável, mídia intransferível corante fluorescente/mL (5 µM) em um tubo de 15 mL e lugar na incubadora umidificada por 30 min. Misture suavemente o tubo no meio da incubação.
   2. As seguintes 30 min incubação, adicionar 1 volume de EBM-FBS fresco para as células coradas e girar a 400 x g durante 5 min.
   3. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 mL de mídia EBM-FBS. Confirmar a coloração bem sucedida dos MSCs usando microscopia de fluorescência.
2. Remova as placas contendo anel aórtica da incubadora umidificada e 500 µ l de EBM-FBS de cada poço.
3. Sementes cuidadosamente 10 ⁴ MSCs em 500 µ l de EBM-FBS em cada anel aórtico incorporado pipetando uniformente em torno das redes endoteliais. Garantir a distribuição uniforme agitando suavemente a placa de cultura.
   1. Adicionar EBM-FBS adicionais para assegurar que o volume total dos meios de comunicação sobre as culturas de co de ensaio/MSC anel aórtico é 1.000 µ l.
4. Usar microscopia de fluorescência para visualizar os MSCs fluorescente rotulados no ensaio de anel aórtico.

4. microscopia

1. microscopia de campo claro uso a imagem das redes endotelial rato antes do anel aórtico ensaio/MSC co culturas para medições de linha de base (dia 0) das propriedades de rede endotelial (por exemplo, rede comprimento, loops de rede). Imagem 4 quadrantes por alvéolo do anel aórtico a seção mais distante da rede endotelial dentro esse quadrante. Redes de anel
   1. imagem a aórtica seguindo o anel aórtico ensaio/MSC co culturas nos dias 3, 5 e 7. Use estas imagens para quantificar o efeito de mestrado sobre o desenvolvimento da rede endotelial.
2. Usar microscopia de fluorescência para imagem previamente rotulados MSCs no ensaio de anel aórtico. Culturas de co
   1. seguintes 24 h do anel aórtico ensaio/MSC, usar microscopia de fluorescência para visualizar MSC homing, alongamento e integração com as redes endoteliais. Sobrepor as imagens fluorescentes do MSCs com as imagens de campo brilhante das células endoteliais para observar o colocalization de ambos os tipos de célula.
   2. De imagem os MSCs localizadas dentro das redes endoteliais desenvolvidas proximais ao tecido do anel aórtico e os MSCs localizadas dentro recentemente desenvolvendo redes distais ao tecido do anel da aorta ( Figura 2).

5. Flow Cytometry e qPCR

1. um dia antes da dissociando as redes endotelial anel aórtico, descongelar congelado dispase a 4 ° C O/s. secção 5.3 é idêntica para citometria de fluxo e qPCR.
2. Aqueça 50 mL de dispase e 50 mL de tripsina de 0,5% em banho de água ou talão de 37 ° C.
3. Recuperar as células para análise de culturas ensaio/MSC-co o anel aórtico.
   1. Após 1 semana da cultura co do ensaio/MSC anel aórtico, remova a mídia de cultura e adicione 1 mL de Phosphate-Buffered salino (PBS) lentamente para cada um bem por 3 min e remover. Repetir esta lavagem mais duas vezes.
   2. Adicionar 800 µ l de pré aquecido dispase a cada poço e faça a incubação de incubadoras umidificadas por 15 min.
   3. Remover as placas das incubadoras umidificadas suspender dispase pipetando (5-10 x) para separar o BME e transferir o conteúdo de cada poço para tubos de 15ml separada.
   4. Repita o passo 5.3.3 novamente com fresco dispase previamente aquecido até não residual BME é observada na cultura do bem. Adicionar 1 volume de PBS, complementada com 3% FBS para a suspensão de células dispase para inactivar a dispase. Remova os anéis da aorta flutuando na suspensão de célula usando pontas de pipetas.
   5. Girar as suspensões celulares a 400 x g por 5 min. Retire o sobrenadante cuidadosamente, deixando 3 mL de suspensão de células no tubo de 15 mL.
      Nota: Um sedimento sólido, óbvio pode não ser visível, mas as células e BME estão presentes.
   6. Adicionar 3 mL de tripsina escaldadas de 0,5% para a suspensão de células e vigorosamente os eritrócitos (5-10 x pipetando). Incubar as soluções de célula trypsinized nas incubadoras umidificadas por 10 min.
   7. Remover as suspensões celulares de trypsinized de incubadoras umidificadas e adicionar 6 mL de PBS, complementada com 3% FBS e ressuspender alguns times. Girar as suspensões celulares em 400 x g, durante 5 min.
   8. Cuidadosamente retire todo o sobrenadante, deixando o centrifugado no tubo e ressuspender as células em 1 mL de PBS, complementada com 3% FBS em cada tubo.
   9. Filtrar a suspensão de células de 1 mL usando um coador de célula 70 µm para remover células agregadas e BME residual da suspensão celular. Contar as células em 1 mL de suspensão de células usando um contador celular.
4. Preparar as células por citometria de fluxo.
   1. Incubar a célula suspensões (10 ⁵ células em 200 µ l PBS, complementada com 3% FBS) com fluoróforo conjugado (FITC ou APC) anticorpos primários (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentração = 01:40) a 4 ° C por 30 min, protegido da luz.
      Nota: Citometria de fluxo para MSCs foi otimizada por Hong et al, 2013 ²⁸. Um mínimo de 10.000 células é necessário para leituras precisas.
   2. Após incubação a 30 min, Ressuspender as células em 2 mL de PBS, complementada com 3% FBS e centrífuga (400 x g, 5 min).
   3. Células de manter a 4 ° C, protegido da luz, até a análise por citometria de fluxo (pelo menos 1 x 10 ⁴ eventos) dentro de 1h. Para a estratégia associada, consulte complementar Figura 1. Classificar o MSCs humanas usando anti-TRA-1-85 (APC) (concentração: 01:40 e em 0,5% FBS/PBS) e classificar as células em 350 µ l de tampão de lise celular para análise de qPCR.
      Nota: Lisadas células podem ser armazenadas a-80 ° C por até 3 meses para análise futura qPCR.
5. Preparar as células para análise de qPCR.
   1. Isolar o RNA das células lisados usando kits de isolamento de RNA baseada em coluna e determinar a concentração de RNA e qualidade.
   Reação de transcriptase reversa
   2. preparar cDNA de até 5 µ g de RNA por 100 µ l. Executar uma etapa de Pre-amplificação se o rendimento do RNA é baixo (< 10 ng / µ l). Utilização de menos de 100 ng do RNA resultará em uma alta taxa de falsos negativos.
      Nota: Os modelos de cDNA podem ser armazenados a-20 ° C para posterior análise por até 4 meses.
   3. Executar o qPCR usando matrizes de criador de perfil de expressão de angiogênese para detectar alterações na expressão gênica. Uso 5 ng de cDNA por reação (40 ciclos, 60 ° C temperatura de recozimento/extensão). Express prega mudança de expressão em comparação com amostras de cDNA indiferenciadas MSC derivado. Executar os controles negativos apropriados (anel aórtica sem humanos MSCs).

6. Quantificação anel aórtico seguinte ensaio/MSC de co culturas de rede

1. baixar software de imagem tais como ImageJ juntamente com analisador de angiogênese plugin ³¹.
2. Importar as imagens endoteliais rede tomadas e abra usando o software.
3. Converter as escalas de imagem com base nas especificações do microscópio usado.
4. Usar uma ferramenta em linha reta para medir o crescimento da rede radial.
5. Contar os loops de rede endotelial usando a ferramenta de contador de célula (loops com pelo menos 4 lados devem ser quantificadas).
6. Para adicional quantificação das propriedades de rede, use o plugin de angiogênese Analyzer ou outros plugins semelhantes para analisar segmentos mestre, total comprimento do segmento, áreas de rede total e o número dos cruzamentos. Use a ferramenta máscara borrada para desfocar o tecido do anel aórtico e espaços vazios para evitar falsos positivos cálculos.
7. Transferir os valores para um programa e gráfico rede endotelial Propriedades de estatísticas seguindo as anel aórtico ensaio/MSC co culturas.

Resultados

O fluxo de trabalho esquemático para estabelecer o ensaio de co-cultura de anel/MSC aórtica é demonstrado na Figura 1. As etapas principais incluem: rato isolamento da aorta, seccionamento e incorporação dos anéis da aorta, monitoramento da brotação endotelial e desenvolvimento da rede e finalmente a rotulagem e administrando os MSCs. A linha do tempo da análise endotelial rede descreve a janela para as análises viáveis para cada período de cultiv...

Discussão

Existem vários estágios críticos na criação de um ensaio de anel aórtico bem sucedida experiência de co-cultura MSC. Primeiro, os passos mais importantes quando isolando e aorta de corte são: 1) obtenção exclusivamente o segmento torácico da aorta; 2) cuidadosamente removendo a ramificação dos vasos sanguíneos, o conjuntivo e o tecido adiposo e; 3) seções até corte da aorta (~ 1mm) para limitar a variabilidade entre cada ensaio. Em segundo lugar, a incorporação de sucesso dos anéis da aorta em BME é ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alpha-MEM	Gibco	12571071	For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85	R&D Systems	FAB3195A	Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel)	Corning	354234	For aorta embedding
Bullet-kit	Lonza	CC-3162	Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo-fisher	C2925	For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope	Olympus		For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase	StemCell technologies	7923	For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels	VWR	21909-654	For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM)	Lonza	CC-3156	Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade	VWR	97064-768	To sterilize surfaces
EVOS	Life Technologies		In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)	GE Healthcare	SH3039603	Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody	BD	558068	Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody	BD	560846	Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps	Almedic	7727-A10-704	For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-094	1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	51026410	For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array	Qiagen	PAHS-024Z	Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ			Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II	BD		UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit	Qiagen	330421	For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit	Qiagen	330451	Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors	Fine Science Tools	14059-11	For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze	VWR	3084	To dampen and sterilize chest fur
TrypleE	Thermo Fisher Scientific	12605036	MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit	Thermo Fisher Scientific	566-0020	To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco	25200056	For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes	Corning	25382-428	For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates	Corning-Sigma Aldrich	CLS3513	For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube	BD Falcon	352096	For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer	Fisherbrand	22363548	To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting