发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里, 我们提出了一个新的应用的主动脉环法 prelabelled 间充质细胞共大鼠主动脉源性内皮网络。这种新的方法可以可视化间质基质细胞 (MSCs) 归巢和与内皮网络整合, 网络属性的量化, 并评价 MSC 免疫和基因表达。

摘要

血管生成是一个复杂的, 高度规范的过程, 负责提供和维持足够的组织灌注。血管维持不足和病理性畸形可能导致严重的缺血性疾病, 而过度丰富的心血管发育与癌症和炎症失调有关。pro-angiogenic 治疗的一种很有希望的形式是使用血管生成细胞源, 它可以为新发展的血管提供调节因子和物理支持。

骨髓间质细胞 (msc) 是广泛研究的候选血管再生由于其分泌的影响和能力, 以检测和家庭缺血性或发炎组织。特别是, 第一个四个月的人脐带血管细胞 (FTM HUCPVCs) 是一个非常有希望的候选者, 由于其细胞性质, 高增殖和多向电位, 免疫特权的属性, 和强健的分泌配置.为了有效地评估潜在的血管生成再生细胞, 这是一个必要的测试他们在可靠和 "可翻译的" 前临床化验。主动脉环试验是一种体外血管生成模型, 可以方便地量化管状内皮结构, 提供宿主的辅助支持细胞和胞内基质 (ECM), 不包括炎症成分, 并且快速和低廉的设置。这是有利的, 当与在体内模型 (如: 如, 角膜检测, 基质插头检测);主动脉环试验可以跟踪所管理的细胞, 观察细胞间的相互作用, 同时避免异免疫排斥反应。

我们提出了一个新的应用的主动脉环试验的协议, 其中包括人骨髓间充质干细胞在 co-cultures 发育大鼠主动脉内皮网络。这种方法可以分析 MSC 对导管的形成和发展的贡献, 通过物理细胞样的相互作用及其效力, 积极迁移到血管生成的部位, 并评估其执行和调解的能力ECM 处理。该协议提供了进一步的信息, 在 MSC 表型的变化和基因表达后共培养。

引言

血管生成的复杂过程改善和维持组织灌注, 促进新的血管发育从预先存在的血管1。它是一个严密调控, 平衡的过程由 pro-angiogenic 和血管因素。该系统的任何缺陷都可能导致血管维持或生长不足, 导致严重的缺血性疾病, 包括心肌病、中风和神经退行性疾病。然而, 夸大的血管发育是典型的条件, 包括癌症和炎症性疾病2。

开发旨在控制血管生成以获得良好组织再生的治疗方法至关重要。尽管进行了广泛的前临床研究, 但使用 pro-angiogenic 因子和 rna 刺激血管生成的尝试未能达到预期的结果3,4,5。暂时性影响的可能原因包括: 血管生成蛋白和核酸的寿命有限, 以及靶生长因子的有限数量6,7。虽然可溶性血管生成因子对启动血管形成至关重要, 但血管的维持和功能依赖于支持的细胞类型, 包括周和平滑肌细胞8。pro-angiogenic 疗法的领域现在正在探索潜在的干细胞和祖细胞来源, 可能提供局部血管生成因子, 而物理支持新发展的血管, 更新甚至分化成内皮样细胞9,10。寻找能够满足这些功能要求的最佳血管生成细胞类型对缺血性组织再生有很大的希望。

为了成功地将可能的细胞疗法转化为临床试验, 前期研究需要证明它们的功效, 并强调潜在的血管生成机制。尽管已经建立了大量的血管生成试验, 但该领域缺乏一个 "金标准" 的体外检测方法, 可以可靠地评估潜在候选细胞类型的有效性11,12, 13. 大多数体外, 血管生成检测 (包括内皮细胞增殖、迁移和试管形成分析) 通常评估细胞或化合物对血管型变化或分化的影响管状和网络结构14,15。虽然这些功能对血管生成至关重要, 但 "可翻译" 的化验还应评估: 1) 增强或替换支持的细胞类型, 包括周或平滑肌细胞, 2) 处理 ECM 和/或基底膜, 和 3)促进功能性微血管形成的效率。在体内血管生成模型, 包括角膜检测和基质塞检测, 概括了独特的体内微环境, 但由于跟踪被管理的细胞观察物理相互作用的困难而面临挑战。此外, 在体内模型中, 异免疫排斥可能发生在测试潜在的异基因细胞治疗候选者16。前体血管生成模型, 特别是主动脉环试验可以提供: 1) 管状结构, 2) 辅助支持细胞, 3) 从主机和人工用品的 ECM, 4) 排斥炎症组件和 5) 快速且价格低廉的设置17,18。通常, 主动脉环试验可以检测小分泌蛋白、药理制剂和转基因啮齿动物模型的血管生成电位19,20,21。

骨髓间充质干细胞主要通过其分泌介导的效果22,23,24, 有望成为血管再生的候选对象。骨髓间充质干细胞已被证实能分泌血管内皮生长因子 (VEGF)、肝细胞生长因子 (HGF)、胰岛素样生长 Factor-1 (IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 和 angiopoeitin-1 (Ang-1) 的主要血管生成因子 (25 ,26。MSCs 也可以检测到缺血性或发炎的组织, 但确切的机制仍在调查中。越来越多的文献支持的假说, 大多数 MSCs 产生的血管细胞, co-express 细胞标记, 并可以表现出像周27。HUCPVCs 是人类脐带血管区的一个年轻的骨髓间充质干细胞来源。它们代表了具有细胞样性质的 MSCs 的种群, 并且从 FTM 和足月的脐带中都有特征。FTM HUCPVCs 展示了细胞标记的高表达, 包括 CD146 和 NG2, 高增殖和多向电位, 免疫特权属性, 并显示一个健壮的分泌配置文件28。FTM HUCPVCs 是一个理想的候选细胞类型, 通过促进新的血管, 通过其细胞的性质, 促进损伤组织再生。

为了测试人类骨髓间充质干细胞的血管生成潜能和细胞样的特性, 在积极的 angiotropic 迁移 (以下简称为 "归巢")、ECM 处理和发展物理在获得微血管发育的定量数据的同时, 可以研究细胞类型之间的相互作用。

在此, 我们提出了一个协议, 描述了一个新的应用的主动脉环试验。人骨髓间充质干细胞与开发大鼠主动脉内皮网络共, 以评估其对管的形成、成熟和稳态的贡献。这一版本的主动脉环试验评估细胞治疗候选者的能力和效力的地方, 血管生成, 执行和调解 ECM 处理, 并促进内皮管发展通过建立细胞样的物理相互.除了量化 mscs 对体外内皮网络形成和观察细胞间相互作用的净效应之外, 我们还优化了从 co-cultures 中分离 mscs 的协议。通过执行流式细胞仪和 qPCR, 可以表征 MSC 表型和基因表达在共培养后的变化。作为模型细胞类型, 我们比较了 ontogenetically 早期 (产前) 和晚期 (成人) 的人骨髓间充质干细胞的来源: FTM HUCPVCs 和人骨骨髓间充质干细胞 (骨髓), 分别在主动脉环试验。我们建议, 在研究血管生成再生应用时, 主动脉环法可用于分析任何物理支持细胞类型的血管生成潜能。

研究方案

所有涉及动物的研究都是按照到达指南 29 进行的。所有研究都是通过机构研究伦理委员会的批准 (REB 号 4276) 进行的。所有动物程序均由大学卫生网络 (加拿大多伦多) 动物保育委员会批准, 所有动物都接受了符合《 动物保育和使用指南》的人道护理 , 8 th 版 (国立卫生研究院 2011).

1. 主动脉环试验装置

  1. 将大鼠主动脉分离。
    1. 安乐 8-10 周老大鼠使用 co 2 窒息: 设置 co 2 室到20% 气体置换 (流速 = 0.2 x 室容积/分钟)。确认由触摸胸部没有捏反射和心脏跳动.
    2. 用70% 乙醇消毒纱布在胸部区域湿润毛皮。使用灭菌钳和剪刀, 使胸部中线切开, 并通过皮肤和肌肉层.
    3. 一旦肋骨笼暴露, 削减两侧的肋骨笼和折叠向上约5毫米从胸骨两侧。新鲜尸体上的肋间动脉可能有出血.
    4. 将肺组织和心脏推到解剖右侧以暴露主动脉。主动脉是位于脊柱附近的白色彩色血管.
    5. 用镊子夹住主动脉弓后的主动脉, 用手术剪刀做第一个切口, 同时用镊子抓住主动脉。在切割主动脉时, 胸腔很快就会充满血液, 因此在凝血前快速获得主动脉是至关重要的.
    6. 使用镊子握住主动脉, 将主动脉向下轻轻剥离, 远离脊柱。这种拉力将会切断肋间动脉而不会进一步切口。获得大约10厘米的组织和/或前主动脉分为两个分支在腹腔和削减主动脉的胴体。如果需要, 将膜片推到尾侧方向, 以获得对主动脉下部部分的访问.
      注意: 轻轻地剥开主动脉, 因为强烈的力量会导致它撕裂。如果主动脉流泪, 允许血液凝固几秒钟, 用纸巾除去凝结的血液, 从而使余下的主动脉可见.
    7. 将主动脉置于15毫升管中, 10 毫升的 ice-cold 汉克和 #39 的平衡盐溶液 (HBSS) 补充1% 的青霉素/链霉素 (P/s)。把管子放在冰上.
      注: 主动脉组织可以在冰上持续1-2 小时, 但最好尽快处理.
  2. 在无菌生物安全柜 (BSC) 中准备主动脉环试验培养基。
    1. 通过使用过滤单元来筛选内皮生长培养基 (华), 以过滤500毫升的内皮基底培养基 (循证医学), 辅以2% 胎牛血清 (FBS)、1% 庆大霉素和生长因子 (见 材料表 )。50毫升的过滤介质成珠或水浴在37和 #176; C.
    2. 使用另一个过滤单元来过滤100毫升的循证医学, 补充 2% FBS 和1% 米/秒, 以准备循证医学 2% FBS (循证医学-FBS), 并存储在4和 #176; C.
  3. 在冰上工作时, 用基底膜萃取物 (BME) 将12层组织培养皿涂上。
    1. 在冷表面 (大冰包或托盘) 上放置一个12井板。添加200和 #181; 使用冷冻吸管提示和旋流 BME 的新鲜解冻 BME, 确保均匀涂层。工作迅速, 避免了 BME 的不均匀聚合.
      注: 一个典型的主动脉切除产生20主动脉环。为了解释主动脉环检测的变异性, 每个治疗组至少设置三主动脉环化验, 并包括一个控制。如果源许可证, 建议每治疗组6环.
    2. 将涂层的板置于湿恒温箱中 (95% 相对湿度, 37 和 #176; C, 5% CO 2 ; 这些条件适用于以下所有加湿孵化器步骤) 30 min. 1000 和 #181; L 吸管提示回到-20 和 #176; C 用于步骤 1.5.3.
      注: 当基膜萃取物用于储存浓度时, 其稠度和刚度严格受聚合时间的控制。确保所有的平行和独立的实验都保持完全相同的聚合时间.
  4. 将主动脉分为均匀环。
    1. 从15毫升的管中取主动脉, 并将其放入10厘米的盘中, 10 毫升的新鲜 HBSS 补充1% 的 P/秒.
    2. 使用两套镊子仔细分离多余的结缔组织, 脂肪组织, 并使用手术刀, 其余分支的肋间动脉连接到主动脉。这减少了基于不同水平的残余组织的环单元之间的变异性。从主动脉内取出任何残余凝结的血液.
    3. 在 10 cm 盘下放置一个标尺或网格, 用无菌手术刀和镊子精确切割 1-2 毫米宽的主动脉部分。尽可能精确地剪切剖面, 以减少单位间的可变性.
  5. 将主动脉环嵌入 BME.
    注意: 如果在 BME 聚合孵化前未完成主动脉环的切片, 则从湿化恒温箱中取出涂层板, 并添加100和 #181; 每一个井都要终止聚合。确切的时机是至关重要的, 因为 over-polymerization 的 BME 可能会干扰内皮网络的发展和细胞迁移。一旦准备好主动脉环, 从井中移除循证医学, 并继续1.5.2。
    1. 从湿润的恒温箱中取出 BME 涂层的井, 并返回到 BSC.
    2. 小心地拿起单独的主动脉环与钳子和安置一个在每个 BME 涂好的中间。对余下的主动脉环重复.
      注: 与主动脉环一起传输的介质应保持最小, 以避免聚合不规则.
    3. 使用冷却 (-20 和 #176; C) 1000 和 #181; l 吸管提示添加300和 #181; l BME 在每个主动脉环的顶部, 并均匀分布 BME 周围的井.
    4. 将嵌入的主动脉环返回到湿式恒温箱30分钟.
    5. 将带有嵌入的主动脉环的板从加湿的恒温箱中取出, 然后缓慢地添加1000和 #181; 华 (在步骤1.2.1 中准备和加热), 将吸管尖端放在文化壁上.
      注: 直接移介质上的 BME 会扰乱聚合 BME, 阻碍连续的内皮网络发育。如果可用, 请使用适当的多通道吸管.
    6. 24 小时后, 移除1000和 #181; 华, 替换为1000和 #181; 循证医学 FBS 的 1.2.2, 又慢慢地移在文化的侧面.
  6. 通过替换500和 #181 来保持主动脉环检测; 循证医学 FBS 与500和 #181; 新鲜循证医学 FBS (37 和 #176; C) 每 48 h.
    注意: 见 sec2开始 MSC 文化扩展与主动脉环化验建立同一天。这将确保 MSCs 可以在血管内皮网络准备就绪时进行共培养.
  7. 使用明亮的现场显微术跟踪主动脉环检测血管内皮网络的发育 (参见 图 1 作为最佳网络开发的参考)。一旦血管内皮网络方面如 图 2 所示, 继续建立主动脉环试验理学硕士 co-cultures (第3节)。有关血管内皮网络成像的进一步细节, 请参阅步骤 4.1.

2。组织培养

  1. 准备组织培养介质的库存解决方案。
    1. 区域性 FTM HUCPVCs (以前已建立, n 和 #8805; 3 独立行) 30 和商业上可用的骨髓基质细胞在α-记忆补充 10% FBS 和1% 的 P/秒。
    2. 使用0.2 和 #181 对介质进行消毒; m 孔径过滤瓶.
    3. 将准备好的介质解决方案存储在4和 #176; C 最多3周.
  2. 在 70-80% 70-100 中保持 FTM HUCPVC 和骨髓的培养, 通过相衬显微镜确定。使用适当的培养基体积大小的组织培养皿使用 ( 即 10 毫升在一个10厘米的菜肴)。使用这些区域性条件来维护和传代 MSCs.
  3. co-cultures 使用离解酶溶液 (4 mL/10 cm 盘) 和在加湿的恒温箱中孵育3分钟, 将 msc 单分子膜传代或主动脉环试验分离出来. 确保细胞脱离使用明亮的野外显微镜; 孵化额外的 1-2 分钟, 如果需要.
  4. 将离解的单元格转换为15毫升的管, 并在 400 x g 处离心5分钟.
  5. 吸上清液而不干扰细胞颗粒, 重1毫升的适当培养基中的细胞 (α-传代细胞的完整培养基或循证医学-FBS 主动脉环试验/MSC co-cultures) 用于计数使用细胞计数器.

3。主动脉环试验/msc 共培养物的制备

  1. 种子 10 4 MSCs 在每个嵌入的主动脉环上 (9000 单元/cm 2 /12-井板)。根据主动脉环检测的数量, pre-stain 了具有可行的不可荧光染料的 MSCs。在对照组中维持至少三口不含 MSCs 的主动脉环。
    1. 以着色 10 5 MSCs/mL 循证医学 FBS 介质, 将2.5 和 #181; 可转让的荧光染料/ml 介质 (5-#181; M) 添加到15毫升的管中, 并在湿化培养箱中放置30分钟. 轻轻地将试管混合在孵化的中途.
    2. 在30分钟孵化后, 在染色细胞中加入1体积的新循证医学 FBS, 并在 400 x g 处旋转5分钟.
    3. 在1毫升的循证医学 FBS 介质中去除上清和 re-suspend 细胞颗粒。使用荧光显微镜确认骨髓间充质干细胞的成功染色.
  2. 从湿化培养箱中取出主动脉环板, 并移除500和 #181; FBS。
  3. 小心种子 10 4 在500和 #181 中的 MSCs; 循证医学 FBS 对每个嵌入的主动脉环进行了均匀移周围的内皮网络。通过轻轻摇动培养基板确保均匀分布。
    1. 添加额外的循证医学 FBS, 以确保主动脉环检测/MSC co-cultures 的介质总容量为1000和 #181; L.
  4. 使用荧光显微镜来可视化主动脉环检测中的荧光标记的 MSCs.

4. 显微镜

  1. 在主动脉环检测/MSC co-cultures 基线 (天 0) 测量内皮网络属性 ( (如 、网络) 之前, 使用明亮场显微镜对大鼠内皮网络进行图像成像。长度, 网络循环)。图像4象限每井从主动脉环到最远的部分的内皮网络在该象限。
    1. 图像 co-cultures 在3、5和7天的主动脉环检测/MSC 后主动脉环网络。使用这些图像来量化 MSC 对内皮网络发育的影响.
  2. 使用荧光显微镜对主动脉环检测中的 pre-labelled MSCs 进行图像处理。
    1. 在 24 h 主动脉环试验/msc co-cultures 后, 使用荧光显微镜来可视化 msc 的归巢、伸长和与内皮网络的融合。将 MSCs 的荧光图像与内皮细胞的明亮场图像重叠, 以观察两种细胞类型的定位.
    2. 将 mscs 定位在主动脉环组织近端的发达内皮网络内, 并将 mscs 定位在主动脉环组织远端的新发展的网络中 ( 图 2 ).

5。流式细胞仪和 qPCR

  1. 前一日游离主动脉环内皮网络, 解冻冰冻中性在4和 #176; C O/n 段5.3 对于流式细胞术和 qPCR 是相同的.
  2. 暖50毫升的中性和50毫升0.5% 胰蛋白酶在37和 #176; C 珠或水浴.
  3. 从主动脉环检测/MSC co-cultures 中检索细胞进行分析。
    1. 在1周主动脉环检测/MSC 共培养后, 移除培养基, 并将1毫升磷酸缓冲盐 (PBS) 缓慢地添加到每一个井中3分钟并取出。重复这洗两次.
    2. 添加800和 #181; 5ml 中性每个井, 并在湿化孵化器中孵育15分钟.
    3. 从湿化恒温箱中取出板, 并将移 (5-10x) 暂停中性, 以分解 BME, 并将每个井的内容转换为单独的15毫升管.
    4. 重复步骤5.3.3 再次与新鲜5ml 中性, 直到没有残留的 BME 在文化中观察良好。添加1体积 PBS 补充与 3% FBS 中性细胞悬液, 使中性。移除在细胞悬浮漂浮的主动脉环使用吸管提示.
    5. 将电池悬浮在 400 x g 处旋转5分钟, 小心取出上清, 在 15 ml 管中留下3毫升的细胞悬浮液.
      注意: 一个明显的, 固体颗粒可能不可见, 但细胞和 BME 存在.
    6. 添加3毫升的 prewarmed 0.5% 胰蛋白酶到细胞悬浮和大力重 (5-10x 的移) 细胞。在湿润恒温箱中孵育 trypsinized 细胞溶液10分钟.
    7. 将 trypsinized 细胞悬浮液从加湿的恒温箱中取出, 并添加6毫升 PBS 补充 3% FBS 和重几个 tim达累斯萨拉姆.旋转细胞悬浮在 400 x g 为 5 min.
    8. 小心移除所有上清液, 将细胞颗粒留在试管中, 并在1毫升 PBS 重细胞中补充 3% FBS.
    9. 使用70和 #181 对 1 mL 细胞悬浮液进行过滤, 以去除细胞悬浮液中的聚集细胞和残余 BME。使用单元计数器对1毫升的细胞悬浮细胞进行计数.
  4. 为流式细胞术准备细胞。
    1. 在200和 #181 中孵化单元悬浮 (10 5 单元格; PBS 补充 3% FBS) 与荧光共轭 (FITC 或 APC) 主要抗体 (TRA-1-85, CD146, CD31) 浓度 = 1:40) 在4和 #176; C 为30分钟, 保护免受光.
      注: al. 的流式细胞仪是由红 et , 2013 28 优化的。准确读数需要至少1万细胞.
    2. 30 分钟孵育后, 重2毫升 PBS 补充 3% FBS 和离心机 (400 x g, 5 min) 的细胞.
    3. 将单元格保持在4和 #176; C 保护不受光照, 直到流式细胞仪 (至少 1 x 10 4 事件) 在 1 h 内进行分析。有关浇口策略, 请参见 补充图 1 。分类人 MSCs 使用 anti-TRA-1-85 (APC) (浓度: 1:40 和 0.5% FBS/PBS) 和排序细胞成350和 #181; 细胞裂解缓冲 qPCR 分析.
      注: 裂解细胞可存储在-80 和 #176; C 为未来 qPCR 分析3月.
  5. 为 qPCR 分析准备单元格。
    1. 使用列 rna 隔离套件将 rna 从裂解细胞中分离出来, 并确定 rna 的浓度和质量.
    2. 制备5和 #181 的 cDNA; 每100和 #181 的 RNA g; 反转录酶反应。如果 RNA 产量低 (#60; 10 ng/和 #181; L), 执行放大步骤。使用少于 100 ng 的 RNA 将导致高率的假阴性.
      注: cDNA 模板可存储在-20 和 #176; C 用于进一步分析, 可长达4月.
    3. 使用血管生成表达式探查器数组执行 qPCR, 以检测基因表达的变化。每个反应使用 5 ng (40 循环, 60 和 #176; C 退火/延长温度)。与未分化 MSC 衍生的 cDNA 样本相比, 表达式的折叠变化。运行适当的负控制 (主动脉环没有人 MSCs).

6。主动脉环检测/MSC 联合培养后的网络量化

  1. 下载图像处理软件 (如 ImageJ) 以及血管生成分析仪插件 31 。
  2. 使用该软件导入和打开的内皮网络图像.
  3. 根据所用显微镜的规格转换图像刻度.
  4. 使用 straight-line 工具来测量径向网络增长.
  5. 使用单元计数器工具计数内皮网络循环 (至少有4边的循环应该是量化的)
  6. 对于网络属性的其他量化, 请使用血管生成分析器插件或其他类似插件来分析主线段、总段长度、总网络区域和连接数。使用模糊蒙版工具来模糊主动脉环组织和空空间, 以避免假阳性计算.
  7. 将值转换为统计程序, 并在主动脉环检测/MSC co-cultures 后绘制内皮网络属性.

结果

在图 1中演示了建立主动脉环/MSC 共培养试验的示意图工作流程。主要步骤包括: 大鼠主动脉的分离、主动脉环的切片和嵌入、监测内皮的萌发和网络发育, 最后对 MSCs 进行标记和管理。内皮网分析的时间线概述了窗口为分析可行为每期间大块: 1 天, 5 和 #38; 7。附加注释由虚线框突出显示。

主动脉环内皮细...

讨论

在建立一个成功的主动脉环试验 MSC 共培养实验的几个关键阶段。首先, 分离和剖胸主动脉的最重要步骤是: 1) 完全获得主动脉的胸椎段;2) 仔细去除分支血管、结缔组织和脂肪组织;3) 切割甚至部分主动脉 (〜 1 mm), 以限制每一个化验之间的变异性。第二, 成功地将主动脉环植入 BME 是该方法的关键。如果 BME 没有完全聚合或聚合不均匀, BME 中嵌入的主动脉环将无法启动内皮发芽, 或者它们可能发育不?...

披露声明

Dr. 克利福德 l. Librach 是专利的联合持有者:分离和使用从早期的脐带组织中提取的细胞的方法。在加拿大和澳大利亚被授予。

致谢

作者感谢以下工作人员和研究人员: Andrée Gauthier-费希尔, 马修 Librach, 坦尼娅先生, Tharsan Velauthapillai 和萨拉 Laronde。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Alpha-MEMGibco12571071For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85R&D SystemsFAB3195AHuman-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel)Corning354234For aorta embedding
Bullet-kitLonzaCC-3162Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA DyeThermo-fisherC2925For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture MicroscopeOlympusFor bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counterInvitrogenC10227Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
DispaseStemCell technologies7923For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpelsVWR21909-654For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered salineSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM)LonzaCC-3156Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology GradeVWR97064-768To sterilize surfaces
EVOSLife TechnologiesIn-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)GE HealthcareSH3039603Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibodyBD558068Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibodyBD560846Human pericyte marker for flow cytometry
ForcepsAlmedic7727-A10-704For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175-0941X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific51026410For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR arrayQiagenPAHS-024ZHuman specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJOpen source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR IIBDUHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycinGibco15140122Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini KitQiagen74104For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand KitQiagen330421For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis KitQiagen330451Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissorsFine Science Tools14059-11For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauzeVWR3084To dampen and sterilize chest fur
TrypleEThermo Fisher Scientific12605036MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unitThermo Fisher Scientific566-0020To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200056For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishesCorning25382-428For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture platesCorning-Sigma AldrichCLS3513For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tubeBD Falcon352096For general tissue culture procedures
70 μm cell strainerFisherbrand22363548To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

参考文献

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

127

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。