Le dosage de co-culture anneau aortique : Un outil pratique pour évaluer le potentiel angiogénique de cellules stromales mésenchymateuses In Vitro

Résumé

Nous présentons ici une nouvelle application du test de l’anneau aortique où prémarqués cellules mésenchymateuses sont conjointement cultivés avec réseaux endothéliales dérivées aorte de rat. Cette nouvelle méthode permet la visualisation des homing cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et intégration aux réseaux endothéliales, quantification des propriétés du réseau et l’évaluation des MSC immunophenotypes et l’expression génique.

Résumé

L’angiogenèse est un processus complexe, fortement réglementé, responsable de fournir et de maintenir la perfusion tissulaire adéquate. Entretien de vascularisation insuffisante et des malformations pathologiques peuvent entraîner maladies ischémiques sévères, tandis que trop abondante développement vasculaire est associée avec le cancer et les troubles inflammatoires. Une forme prometteuse de pro-angiogénique thérapie est l’utilisation de sources de cellules angiogéniques, qui peuvent fournir des facteurs de régulation ainsi que le soutien physique pour développer nouvellement système vasculaire.

Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont intensivement étudiés candidats pour régénération vasculaire en raison de leurs effets paracrine et leur capacité à détecter et abritant les tissus ischémiques ou enflammées. En particulier, premier trimestre des cellules du cordon ombilical humain périvasculaires (FTM HUCPVCs) sont un candidat très prometteur en raison de leurs propriétés pericyte, fort potentiel prolifératif et multilignée, privilège immunitaire propriétés et paracrine robuste Voir le profil. Evaluer efficacement potentiellement angiogénique cellules régénératrices, c’est une condition pour tester en fiable et « traduisible » essais précliniques. L’essai de l’anneau aortique est un modèle d’angiogenèse ex vivo qui permet pour la simple quantification des structures tubulaires d’endothéliales, fournit les accessoires cellules de soutien et de la matrice extracellulaire (MEC) de l’hôte, exclut les composantes inflammatoires et est rapide et peu coûteuse à mettre en place. Ceci est avantageux par rapport aux modèles in vivo (p. ex., cornée dosage, Matrigel prise test) ; l’essai de l’anneau aortique peut suivre les cellules administrées et observer les interactions intercellulaires tout en évitant le rejet de xeno-immunitaire.

Nous présentons un protocole pour une nouvelle application du test de l’anneau aortique, qui comprend les MSCs humaines dans des cultures co avec le développement de réseaux endothéliales aortiques de rat. Ce test permet l’analyse de la contribution de MSC dans le tube de formation et développement grâce à des interactions de type pericyte physiques et de leur puissance de migration activement aux sites de l’angiogenèse et pour évaluer leur capacité à effectuer et médiation Traitement de l’ECM. Ce protocole prévoit plus d’informations sur les changements MSC phénotype et l’expression génique suite co-culture.

Introduction

Le processus complexe de l’angiogenèse améliore et maintient la perfusion tissulaire en favorisant le développement de navire du sang neuf de préexistant vascularisation¹. C’est un processus fortement réglementé, équilibré par des facteurs pro-angiogéniques et anti-angiogéniques. Toute carence dans ce système peut conduire à l’entretien insuffisant de navire ou de croissance, provoquant de graves maladies ischémiques, y compris la maladie myocardique, accident vasculaire cérébral et les maladies neurodégénératives. Cependant, développement vasculaire exagérée est caractéristique pour les conditions, y compris le cancer et les troubles inflammatoires,².

Développement de thérapies visant à contrôler l’angiogenèse pour atteindre la régénération tissulaire favorable est d’une importance capitale. Malgré des recherches précliniques et cliniques approfondies, tentatives de stimuler l’angiogenèse à l’aide de micro-ARN et facteurs pro-angiogéniques ont échoué à atteindre les résultats souhaités^3,4,5. Les raisons possibles pour les effets transitoires incluent : longévité limitée de protéines angiogéniques et acides nucléiques et le nombre fini de ciblée des facteurs de croissance^6,7. Bien que les facteurs angiogéniques solubles sont essentiels pour initier l’angiogenèse, l’entretien et la fonctionnalité du système vasculaire dépendent supportant les types de cellules, y compris les péricytes et muscle lisse cellules⁸. Le domaine des thérapies pro-angiogénique étudie maintenant les sources potentielles de cellule cellules souches et progénitrices qui pourraient constituer des facteurs angiogéniques localement, tandis que physiquement soutenir nouvellement développé vascularisation, renouvellement automatique ou même différencier en cellules endothéliales^9,10. Trouver l’angiogénique optimale des types de cellules ayant la capacité de répondre à ces exigences fonctionnelles est un très prometteur pour la régénération des tissus ischémiques.

Afin de les traduire avec succès des thérapies potentielles sur les cellules dans les essais cliniques, des études précliniques doivent démontrer leur efficacité et de mettre en évidence les mécanismes angiogéniques. Malgré le nombre élevé d’essais établis l’angiogenèse, le champ n’est pas un essai de « étalon-or » in vitro qui pourrait sûrement évaluer l’efficacité du potentiel candidat cell types^{11,12, 13}. plupart in vitro l’angiogenèse essais (y compris les essais de formation tube, la migration et la prolifération endothéliales) généralement évaluer les effets des cellules ou des composés sur changements phénotypiques ou la différenciation en cellules endothéliales tubulaire et des structures de réseau^14,15. Alors que ces caractéristiques sont essentielles pour l’angiogenèse, un test « traduisible » devrait également évaluer : 1) l’augmentation mammaire ou le remplacement des prise en charge types de cellules y compris les péricytes ou 2) le traitement des ECM ou membrane basale, les cellules musculaires lisses, et 3). l’efficacité pour promouvoir la formation de microcirculation fonctionnelle. Modèles in vivo angiogenèse, y compris le dosage cornéenne et Matrigel fiche dosage, récapitulent le microenvironnement unique in vivo mais sont contestées par la difficulté des cellules de suivi administré d’observer des interactions physiques. En outre, dans des modèles in vivo , rejet de xeno-immunitaire peut se produire lors du test de potentiels cellules allogéniques thérapie candidats¹⁶. Ex vivo angiogenèse modèles, en particulier le dosage de l’anneau aortique peut fournir : observation 1) facile et quantification des structures tubulaires, des cellules de soutien 2) accessoires, ECM 3) de l’hôte et fournitures artificiels, 4) exclusion d’inflammatoire composants et 5) installation rapide et peu coûteux de^17,18. En règle générale, l’essai de l’anneau aortique peut tester le potentiel angiogénique de petites protéines sécrétoires, agents pharmacologiques et les modèles de rongeurs transgéniques^19,20,21.

MSCs sont prometteurs pour la régénération vasculaire principalement par leurs effets médiés par les paracrine^22,23,24. MSCs auraient dû être divulgués à sécréter des facteurs angiogéniques clés dont le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), facteur de croissance des hépatocytes (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) et angiopoeitin-1 (Ang-1)^{25 ,26}. MSCs peuvent également détecter et tissus abrite ischémique ou enflammés, cependant, les mécanismes exacts sont toujours sous enquête. De plus en plus, la littérature soutient l’hypothèse que MSCs la plupart proviennent des cellules périvasculaires, expriment co pericyte marqueurs et peuvent se comporter comme des péricytes²⁷. HUCPVCs sont une source de jeune de MSCs, dérivée de la région périvasculaire du cordon ombilical humain. Ils représentent une population de MSCs ayant des propriétés pericyte et ont été caractérisés de FTM et à terme des cordons ombilicaux. FTM HUCPVCs démontrent une forte expression de marqueurs pericyte y compris CD146 et NG2, fort potentiel prolifératif et multilignée, propriétés immunitaires de privilèges et afficher une robuste paracrine profil²⁸. FTM HUCPVCs sont un type de cellule du candidat idéal pour favoriser la régénération des tissus lésés par le biais de la promotion du nouveau système vasculaire par l’intermédiaire de leurs propriétés pericyte.

Pour tester le potentiel angiogénique et pericyte-comme des propriétés de MSCs humaines, un nombre très limité d’essais de l’angiogenèse est disponible où positive angiotropic migrations (ci-après dénommé « homing »), ECM traitement et développement de physique interactions entre les types de cellules peuvent être étudiées, tout en obtenant des données quantitatives sur le développement de la microcirculation.

Par les présentes, nous présentons un protocole décrivant une nouvelle application du test de l’anneau aortique. MSCs humaines ont été conjointement cultivés avec développement dérivée de rat aortiques endothéliale des réseaux afin d’évaluer leur contribution pour la formation, la maturation et l’homéostasie de tube. Cette version du test de l’anneau aortique évalue la capacité et la puissance des candidats de thérapie cellulaire Accueil aux sites de l’angiogenèse, effectuer et médiation traitement ECM, et contribuer à endothélial développement tubulaire en créant des pericyte forme physique interactions. En plus de la quantification de l’effet net de MSCs sur la formation de réseau endothéliales in vitro et en observant les interactions intercellulaires, nous avons également optimisé un protocole visant à isoler les MSCs des co-cultures. En effectuant de qPCR et cytométrie en flux, il est possible de caractériser les changements MSC phénotype et gene expression suite co-culture. En tant que types de modèle de cellule, nous avons comparé ontologiquement au début (prénatal) et des sources tardives (adultes) de MSCs humaines : FTM HUCPVCs et MSCs de moelle osseuse humaine (BMSC), respectivement, dans l’essai de l’anneau aortique. Nous proposons que l’essai de l’anneau aortique peut être utilisé pour étudier le potentiel angiogénique de n’importe quel type de cellule physiquement soutien lorsque incriminés pour applications régénératrice angiogénique.

Protocole

toutes les études portant sur des animaux ont été effectuées et selon arrivée directives ²⁹. Toutes les études sont effectuées avec l’approbation du Conseil de recherche institutionnelle éthique (nombre de CÉR 4276). Animal toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l’University Health Network (Toronto, Canada), et tous les animaux ont reçu des soins compatissants en conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, 8 ^ème édition ( Les instituts nationaux de santé 2011).

1. installation de dosage anneau aortique

1. isolat l’aorte de rat.
   1. Euthanasier 8 - rats Sprague-Dawley de 10 semaines à l’aide de CO ₂ asphyxie : remplacement de gaz CO Set ₂ chambres à 20 % (débit = 0,2 x chambre volume/min). Confirmer en l’absence de pincement réflexe et le coeur bat en palpant poitrine.
   2. Mouiller la fourrure sur la région de la poitrine à l’aide de gaze stérilisé avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des ciseaux et pinces stérilisées pour pratiquer une incision dans la médiane de la poitrine et couper à travers les couches de peau et le muscle.
   3. Une fois la cage thoracique est exposée, la cage thoracique, découpez chaque côté et plier vers le haut environ 5 mm du sternum sur chaque côté. Des saignements sont attendu à partir des artères intercostales dans les cadavres frais.
   4. Pousser le tissu pulmonaire et le cœur vers la droite anatomique pour exposer l’aorte. L’aorte est le blanc de couleur navire situé adjacente à la colonne vertébrale.
   5. Utilisation pince à pincer l’aorte (après la crosse aortique) et utiliser des ciseaux chirurgicaux pour faire l’incision première tout en tenant l’aorte avec une pince. Après coupure de l’aorte, la cage thoracique se remplira rapidement avec le sang, c’est pourquoi il est essentiel de travailler rapidement pour obtenir de l’aorte avant la coagulation sanguine.
   6. Pinces à utiliser pour tenir l’aorte et décoller doucement l’aorte vers le bas, la colonne vertébrale. La traction va rompre les artères intercostales sans autres incisions. Obtenir environ 10 cm de tissu et/ou avant de l’aorte se divise en deux branches dans la cavité abdominale et coupe l’aorte de la carcasse. Pousser le diaphragme si nécessaire à la direction caudale pour gagner accès à des sections de l’aorte à.
      NOTE : Peler l’aorte doucement car force intense peut amener à déchirer. Si les larmes de l’aorte, permettent la coagulation du sang pendant quelques secondes et utilisez un essuie-tout pour enlever le sang coagulé, assurant une visibilité de l’aorte restante.
   7. Placer l’aorte dans un tube de 15 mL avec 10 mL de Hank glacee ' s Balanced Salt Solution (HBSS) additionné de 1 % la pénicilline/streptomycine (P/S). Garder les lampes sur glace
      NOTE : Le tissu aortique peut durer pendant 1-2 h sur la glace, mais il est préférable de le traiter aussi rapidement que possible.
2. Préparer les milieux de culture de dosage anneau aortique dans une armoire de biosécurité stérile (BSC).
   1. Préparer le milieu de croissance endothéliale (EGM) en utilisant une unité de filtration pour filtre 500 mL de milieu Basal endothélial (EBM) additionné de 2 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 % de gentamicine et facteurs de croissance (voir Table des matières). Placer 50 mL des médias filtrées dans un talon ou le bain-marie à 37 ° C.
   2. Une autre unité de filtration permet de filtrer 100 mL de EBM additionné de 2 % de SVF et 1 % P/S à préparé l’EBM 2 % SVF (EBM-BF) et conserver à 4 ° C.
3. Enduire des plaques de culture de tissu de 12 puits avec l’extrait de Membrane basale (BME) alors qu’il travaillait sur la glace.
   1. Place une plaque de 12 puits sur une surface froide (gros bloc de glace ou un plateau). Ajouter 200 µL/puits d’utilisation de BME fraîchement décongelées réfrigéré pointes de pipette et agiter les Afro-Caribéens afin d’assurer le même revêtement. Travail rapidement pour éviter une polymérisation inégale de la BME.
      Remarque : Une excision aorte typique donne 20 anneaux aortiques. Pour tenir compte de la variabilité entre les essais de l’anneau aortique, configurer au moins trois essais de l’anneau aortique par groupe de traitement et inclure un contrôle. Si la source le permet, il est recommandé de 6 anneaux par groupe de traitement.
   2. Placer les plaques revêtues en incubateurs humidifiés (95 % d’humidité relative, 37 ° C, 5 % CO ₂ ; ces conditions s’appliquent à toutes les étapes de l’incubateur humidifié ci-après) pendant 30 min. Place 1 000 µL pipette bascule à-20 ° C pour l’étape 1.5.3.
      NOTE : Tandis que l’extrait de la membrane basale est utilisé en concentration stock, sa consistance et la rigidité est strictement contrôlé par le temps de polymérisation. Veillez à garder les mêmes temps de polymérisation exacte pour tous les parallèles et les expériences indépendantes.
4. La section de l’aorte en rondelles uniformes.
   1. Prenez l’aorte du tube de 15 mL et placez-le dans un plat de 10 cm avec 10 mL de HBSS frais additionné de 1 % P/S.
   2. Utiliser deux paires de pinces pour séparer soigneusement l’excès de tissu conjonctif, le tissu adipeux et utilisez un scalpel pour les autres branches des artères intercostales connecté à l’aorte. Cela réduit la variabilité entre les unités de l’anneau issu des différents niveaux du tissu résiduel. Enlever tout résidu coagulé sang prélevé à l’intérieur de l’aorte.
   3. Placer une règle ou une grille sous le plat de 10 cm pour couper précisément à 1-2 mm larges sections de l’aorte à l’aide de forceps et bistouri stérile. Couper les sections aussi exacte que possible de réduire la variabilité entre les unités.
5. Incorporer les anneaux aortiques dans BME.
   Remarque : Si le sectionnement des anneaux aortiques n’est pas terminé avant l’incubation de polymérisation BME, enlever les plaques de revêtement de l’incubateur humidifié et ajouter 100 µL de l’EBM dans chaque puits de mettre fin à la polymérisation. Chronologie exacte est critique car trop de polymérisation des afro-caribéens peut-être interférer avec la migration de développement et de la cellule endothéliale réseau. Une fois que les anneaux aortiques sont prêts, retirer les puits de l’EBM et continuer sur l’étape 1.5.2.
   1. Supprime les puits BME enduite des incubateurs humidifiés et retourne à la GCS.
   2. Soigneusement ramasser les anneaux aortiques individuels avec une pince et placez-en un au milieu de chaque puits BME-enduit. Répéter pour les reste des anneaux aortiques.
      NOTE : Media transféré avec l’anneau aortique doit être maintenu un minimum afin d’éviter des irrégularités de polymérisation.
   3. Utilisation refroidi (-20 ° C) 1 000 pointes de pipette µL d’ajouter 300 µL d’afro-caribéens sur le dessus de chaque anneau aortique et répartir uniformément le BME autour du puits.
   4. Retourner les anneaux aortiques embarqués pour les incubateurs humidifiés pendant 30 min.
   5. Enlever les plaques avec l’anneau aortique incorporé les incubateurs humidifiés et ajouter lentement 1 000 µL d’EGM (préparé et réchauffé à étape 1.2.1) en plaçant la pipette Astuce contre le mur de la culture bien.
      NOTE : Pipetage directement les médias sur les Afro-Caribéens peut perturber le BME polymérisée et entraver le développement du réseau endothéliales continue. Utilisez une pipette multicanaux appropriée, le cas échéant.
   6. Après 24 h, retirez 1 000 µL d’EGM et remplacez-le par 1 000 µL de EBM-FBS préparées à l’étape 1.2.2, encore une fois en pipettant également lentement contre le côté de la culture bien.
6. Maintenir l’essai de l’anneau aortique en remplaçant 500 µL de EBM-FBS avec 500 µL de frais EBM-FBS (37 ° C) chaque 48 h
   Remarque : Voir section 2 pour démarrer l’expansion de la culture du SMC sur le même jour que la création de test anneau aortique. Cela garantira que MSCs sont prêts pour la co-culture, lorsque les réseaux endothéliales sont prêts.
7. Utiliser la microscopie lumineuse pour suivre le développement de réseau endothéliales test anneau aortique (voir la Figure 1 comme référence pour le développement de réseau optimale). Une fois l’aspect endothéliales réseaux tel qu’illustré à la Figure 2, procéder à la mise en place de l’anneau aortique dosage-MSC co-cultures (section 3). Reportez-vous à l’étape 4.1 pour plus de détails sur l’imagerie des réseaux endothéliales.

2. Culture de tissus

1. préparation des solutions mères de milieux de culture de tissu.
   1. Culture FTM HUCPVCs (précédemment établie, n ≥ 3 lignes indépendantes pour chacune) ³⁰ et BMSC commercialement disponible en alpha-MEM additionné de 10 % de SVF et 1 % P/S.
   2. Stériliser les médias à l’aide de 0,2 µm pore taille filtre bouteilles.
   3. Stocker les solutions supports préparés à 4 ° C pendant 3 semaines.
2. Maintenir FTM HUCPVC et BMSC cultures dans des incubateurs humidifiés ou passage à la confluence de 70 à 80 % déterminé par microscopie à contraste de phase. Utilisation des volumes appropriés des médias pour la taille du plat de la culture de tissus utilisés (c'est-à-dire 10 mL dans un plat de 10 cm). Utilisez ces conditions de culture pour le maintien et le passage des MSCs.
3. Se dissocient les monocouches MSC pour passage ou anneau aortique dosage-MSC conjointement les cultures à l’aide d’une solution d’enzyme de dissociation (plat de 4 mL/10 cm) et incuber dans les incubateurs humidifiés pendant 3 min. veiller à ce détachement des cellules à l’aide de la microscopie en champ clair ; incuber pour un 1-2 min supplémentaire, si nécessaire.
4. Transférer les cellules dissociées dans un tube de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
5. Aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire et remettre en suspension les cellules dans 1 mL d’un milieux de culture appropriés (alpha-MEM de médias complet pour le passage des cellules ou EBM-FBS pour anneau aortique dosage/MSC co-cultures) pour le comptage en utilisant un compteur cellulaire.

3. Préparation de l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures

1. 10 graines ⁴ MSCs sur chacun incorporé anneau aortique (9 000 cellules/cm ² / plaque de 12 puits). Basée sur le nombre d’épreuves de l’anneau aortique, pré tacher les MSCs avec colorant fluorescent viable et non transférable. Maintenir au moins trois puits des anneaux aortiques sans MSCs pour un groupe de contrôle.
   1. Pour colorer 10 médias ⁵ MSCs/mL EBM-FBS, ajouter 2,5 µL de viable, médias non transférable colorant fluorescent/mL (5 µM) dans un tube de 15 mL et placez dans l’incubateur humidifié pendant 30 min. mélangent doucement le tube au milieu de l’incubation.
   2. Suivant les 30 min d’incubation, ajouter 1 volume de EBM-FBS fraîches aux cellules colorées et essorer à 400 x g pendant 5 min.
   3. Enlever le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de médias de EBM-FBS. Confirmer la coloration réussie des MSCs à l’aide de la microscopie de fluorescence.
2. Sortir les plaques contenant de l’anneau aortiques de l’incubateur humidifié et retirez chaque puits de 500 µL de EBM-FBS.
3. Graines soigneusement 10 ⁴ MSCs dans 500 µL de EBM-FBS sur chaque anneau aortique embarqué par pipetage uniformément autour des réseaux endothéliales. Répartissent en le secouant doucement la plaque de culture.
   1. Ajouter EBM-FBS supplémentaires pour s’assurer que le volume total des médias sur l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures est 1 000 µL.
4. La microscopie de fluorescence permet de visualiser les MSCs fluorescent étiquetés dans l’essai de l’anneau aortique.

4. microscopie

1. utilisation brillante-microscopie d’imager les réseaux endothéliales rat avant l’anneau aortique dosage/MSC cultures conjointement des mesures de référence (jour 0) des propriétés réseau endothéliales (p. ex., réseau longueur, boucles de réseau). Image 4 quadrants / puits de l’anneau aortique à la section plus éloignée du réseau endothéliale dans ce quadrant. Réseaux d’anneau
   1. image de l’aorte après l’anneau aortique dosage/MSC cultures co 3, 5 et 7 jours. Utiliser ces images pour quantifier l’effet MSC sur le développement du réseau endothéliales.
2. Utiliser la microscopie de fluorescence pour image préétiquetés MSCs dans l’essai de l’anneau aortique.
   1. 24h suivant de l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures, utiliser la microscopie de fluorescence pour visualiser MSC homing, élongation et intégration avec les réseaux endothéliales. Se chevauchent les images fluorescentes de MSCs avec les images de champ lumineux des cellules endothéliales à observer la co-localisation des deux types de cellules.
   2. D’image les MSCs localisées au sein des réseaux endothéliales développés proximales pour le tissu de l’anneau aortique et les MSCs localisées à l’intérieur nouvellement développement réseaux distales dans le tissu de l’anneau aortique ( Figure 2).

5. Flow Cytometry et qPCR

1. un jour avant la dissociation des réseaux endothéliales anneau aortique, décongeler a gelé à 4 ° C O/N. Section 5.3 est identique pour la cytométrie en flux et qPCR.
2. Chauffer 50 mL d’a et 50 mL de 0,5 % trypsine dans bain de perle ou de l’eau 37 ° C.
3. Récupérer les cellules pour l’analyse de l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures.
   1. Après 1 semaine de culture mixte de dosage/MSC anneau aortique, retirez le support de culture et ajouter 1 mL de Phosphate-Buffered Saline (PBS) lentement pour chacun bien pendant 3 min et retirer. Répétez ce laver deux fois plus.
   2. Ajouter 800 µL de préchauffée a dans chaque puits et incuber dans les incubateurs humidifiés pendant 15 min.
   3. Retirer les plaques les incubateurs humidifiés et suspendre a de pipetage (5-10 x) pour défaire les afro-caribéens et transférer le contenu de chaque puits dans des tubes distincts 15 mL.
   4. Répéter l’étape 5.3.3 avec frais a préchauffé jusqu'à aucun résiduel BME est observée dans la culture bien. Ajouter 1 volume de PBS additionné de 3 % SBF à la suspension de cellules a pour inactiver l’a. Retirer les anneaux aortiques flottant dans la suspension de cellules à l’aide de pointes de pipette.
   5. Tourner les suspensions cellulaires à 400 g pour 5 min. Retirez le surnageant avec soin, laissant 3 mL de suspension cellulaire dans le tube de 15 mL.
      Remarque : Une pastille évidente, solide n’est peut-être pas visible, mais les cellules et les Afro-Caribéens sont présents.
   6. Ajouter 3 mL de préchauffée trypsine de 0,5 % pour les cellules de remettre (5-10 x par pipetage) suspension cellulaire et vigoureusement. Incuber les solutions de débris cellulaires dans les incubateurs humidifiés pendant 10 min.
   7. Enlever les suspensions de débris cellulaires de l’incubateur humidifié et ajouter 6 mL de PBS additionné de 3 % FBS et remettre quelques times. Faites tourner les suspensions cellulaires à 400 g pendant 5 min.
   8. Soigneusement retirer tous le surnageant, en laissant le culot cellulaire dans le tube et remettre en suspension des cellules dans 1 mL de PBS additionné de 3 % FBS dans chaque tube.
   9. Filtrer la suspension cellulaire de 1 mL à l’aide d’une passoire de cellule 70 µm pour enlever les cellules agrégées et BME résiduelle de la suspension cellulaire. Compter les cellules dans 1 mL de suspension cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules.
4. Préparer les cellules pour la cytométrie en flux.
   1. Incuber les cellules des suspensions (10 cellules de ⁵ à 200 µL de PBS additionné de 3 % FBS) conjugué à un fluorophore (FITC ou APC) les anticorps primaires (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentration = 01:40) à 4 ° C pendant 30 min, l’abri de la lumière.
      NOTE : Cytométrie en flux pour MSCs a été optimisé par Hong et al., 2013 ²⁸. Il faut un minimum de 10 000 cellules pour une lecture précise.
   2. Après l’incubation de 30 min, de remettre en suspension les cellules dans 2 mL de PBS additionné de 3 % FBS et centrifuger (400 x g, 5 min).
   3. Cellules de conserver à 4 ° C, abri de la lumière jusqu'à ce que l’analyse par cytométrie en flux (au moins 1 x 10 ⁴ événements) à 1 h. Pour la stratégie de blocage, voir supplémentaire Figure 1. Trier les MSCs humaines à l’aide d’anti-TRA-1-85 (APC) (concentration : 01:40 et à 0,5 % FBS/PBS) et trier des cellules dans 350 µL de tampon de lyse cellulaire pour l’analyse de qPCR.
      Remarque : Les cellules lysées peuvent être stockées à-80 ° C jusqu'à 3 mois pour l’analyse des futurs qPCR.
5. Préparer les cellules pour l’analyse de qPCR.
   1. Isoler l’ARN des cellules lysées à l’aide de kits d’isolation RNA basée sur les colonnes et déterminer la concentration d’ARN et de la qualité.
   Réaction de
   2. Prepare cDNA de jusqu'à 5 µg d’ARN par 100 µL de la transcriptase inverse. Exécuter une étape de pré amplification si le rendement de RNA est faible (< 10 ng/µL). Utilisation de moins de 100 ng d’ARN se traduira par un taux élevé de faux négatifs.
      Remarque : Les modèles de cDNA peuvent être stockés à-20 ° C pour une analyse ultérieure jusqu'à 4 mois.
   3. Effectuer le qPCR l’utilisation de l’angiogenèse expression profileur tableaux pour détecter des changements dans l’expression des gènes. L’utilisation de 5 ng de l’ADNc par réaction (40 cycles, 60 ° C température de recuit/extension). Express pli changement d’expression par rapport aux échantillons de cDNA MSC dérivé indifférenciées. Exécuter les contrôles négatifs appropriés (anneau aortique sans humains MSCs).

6. Réseau de Quantification suivante aortique Ring test/MSC co-cultures

1. Télécharger le logiciel d’imagerie comme ImageJ ainsi que de l’angiogenèse Analyzer plugin ³¹.
2. Importer les images réseau endothéliales prises et d’ouvrir en utilisant le logiciel.
3. Convertir les échelles d’image basés sur les spécifications du microscope utilisé.
4. Un outil linéaire permet de mesurer la croissance du réseau radial.
5. Compter les boucles endothéliales réseau à l’aide de l’outil de compteur de cellules (les boucles au moins 4 côtés doivent être quantifiés).
6. Pour quantification supplémentaire des propriétés du réseau, utilisez le plugin angiogenèse Analyzer ou autres plugins similaires pour analyser les segments maîtres, total longueur de segment, zones de l’ensemble du réseau et nombre de jonctions. Utilisez l’outil de masque flou pour brouiller les tissus de l’anneau aortique et des espaces vides pour éviter des fausses positifs calculs.
7. Transférer les valeurs dans un programme et graphique réseau endothéliales propriétés des statistiques suite à l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures.

Résultats

Le flux de travail schématique pour établir le dosage de co-culture anneau aortique/MSC est illustré dans la Figure 1. Les étapes principales incluent : isolement de l’aorte, sectionnement et incorporation des anneaux aortiques, suivi l’endothéliale de la germination et le développement de réseau et enfin l’étiquetage et administrer les MSCs de rat. La chronologie de l’analyse de réseau endothéliales décrit la fenêtre pour les analyses r?...

Discussion

Il y a plusieurs étapes essentielles à mettre en place un test réussie anneau aortique expérience de co-culture MSC. Tout d’abord, les étapes les plus importantes lorsque l’isolant et en sectionnant l’aorte sont : 1) obtenir exclusivement le segment thoracique de l’aorte ; 2) soigneusement enlever les vaisseaux sanguins ramifiés, conjonctif et le tissu adipeux et ; 3) coupe même des sections de l’aorte (~ 1 mm) pour limiter la variabilité entre chaque essai. Deuxièmement, l’intégration réussie d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alpha-MEM	Gibco	12571071	For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85	R&D Systems	FAB3195A	Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel)	Corning	354234	For aorta embedding
Bullet-kit	Lonza	CC-3162	Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo-fisher	C2925	For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope	Olympus		For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase	StemCell technologies	7923	For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels	VWR	21909-654	For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM)	Lonza	CC-3156	Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade	VWR	97064-768	To sterilize surfaces
EVOS	Life Technologies		In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)	GE Healthcare	SH3039603	Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody	BD	558068	Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody	BD	560846	Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps	Almedic	7727-A10-704	For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-094	1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	51026410	For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array	Qiagen	PAHS-024Z	Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ			Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II	BD		UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit	Qiagen	330421	For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit	Qiagen	330451	Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors	Fine Science Tools	14059-11	For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze	VWR	3084	To dampen and sterilize chest fur
TrypleE	Thermo Fisher Scientific	12605036	MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit	Thermo Fisher Scientific	566-0020	To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco	25200056	For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes	Corning	25382-428	For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates	Corning-Sigma Aldrich	CLS3513	For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube	BD Falcon	352096	For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer	Fisherbrand	22363548	To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting