АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем Роман применение аортального кольца assay где prelabelled Мезенхимальные клетки совместно культивируемых с крыса аорто производные эндотелиальной сетями. Этот новый метод позволяет визуализация самонаведения мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и интеграцию с эндотелиальной сетями, количественная оценка свойств сети и оценки иммунофенотипа и генной экспрессии MSC.

Аннотация

Ангиогенез-это комплекс, жестко регулируемых процесс, ответственный за обеспечение и поддержание адекватного ткани перфузии. Обслуживания недостаточно сосудистую и патологических уродств может привести к тяжелой ишемической болезни, в то время как чрезмерно обильные сосудистой развитие связано с рак и воспалительные заболевания. Перспективной формой pro ангиогенных терапии является использование ангиогенных клеток источников, которые могут обеспечить регуляторные факторы, а также физической поддержки для новых развивающихся сосудистую.

Мезенхимальные стромальные клетки (Майкрософт) (MSCs) являются широко исследованы кандидатами для сосудистой регенерации из-за их паракринными эффекты и их способность обнаруживать и домом для ишемического или воспаленных тканей. В частности первый триместр человеческой пуповинной периваскулярной клетки (FTM HUCPVCs) являются весьма перспективный кандидат из-за их перицит как свойства, Высокий пролиферативный и мультилинейного потенциал, иммунной привилегированный свойства и надежные паракринными профиль. Чтобы эффективно оценить потенциально ангиогенных регенерации клеток, это условие, чтобы проверить их в надежных и «перевода» предварительно клинических анализов. Assay аортального кольца является ex vivo ангиогенеза модель, которая позволяет легко количественная оценка эндотелиальной трубчатых структур, обеспечивает аксессуар поддержки клетки и внеклеточного матрикса (ECM) от хоста, исключает воспалительного компонентов и является быстрый и недорогой для установки. Это выгодно, когда по сравнению с моделями в естественных условиях (например, роговицы пробирного, Matrigel вилка пробирного); assay аортального кольца можно отслеживать управляемых клетки и наблюдать межклеточных взаимодействий избегая xeno иммунной неприятие.

Мы представляем протокол для Роман применение assay аортального кольца, которая включает в себя человека MSCs в совместное культур с развивающимися крыса аорты эндотелиальной сетями. Этот assay позволяет для анализа вклада MSC в трубку формирования и развития посредством физических взаимодействий перицит как и их потенции для активно мигрируют на сайты по ангиогенез и для оценки их способности выполнять и посредником ECM обработки. Этот протокол обеспечивает дополнительную информацию об изменениях в MSC фенотипа и ген выражение после совместного культуры.

Введение

Сложный процесс ангиогенеза улучшает и поддерживает перфузии тканей путем содействия развитию новой крови судна из существующих сосудистую1. Это жестко регулируется, сбалансированный процесс про ангиогенных и анти ангиогенными факторами. Любой недостаток в этой системе может привести к недостаточной судно обслуживания или роста, вызывая тяжелые ишемического заболевания, включая болезни миокарда, инсульта и нейродегенеративных расстройств. Однако преувеличенные сосудистой развития характерно для условий, включая рак и воспалительные заболевания2.

Ключевое значение имеет разработка методов лечения, которые направлены на контроль ангиогенеза для достижения благоприятного регенерацию. Несмотря на обширные доклинических и клинических исследований попытки стимулировать ангиогенеза, с помощью про ангиогенных факторов и микроРНК не смогли достичь желаемых результатов3,4,5. Возможные причины для переходных эффектов: ограниченное долголетия ангиогенных белков и нуклеиновых кислот, и конечное число целевых факторов роста6,7. Хотя растворимые ангиогенных факторов необходимы для инициирования ангиогенеза, содержание и функциональность сосудистую зависят от поддержки типов клеток, включая pericytes и гладкомышечные клетки8. Поле pro ангиогенных терапии в настоящее время изучает потенциальные источники стволовых клеток и прародитель клеток, которые могут предоставить ангиогенных факторов на местном уровне, хотя физически поддерживать недавно разработали сосудистую, самостоятельного обновления или даже дифференциации в 9,клетки эндотелия как10. Нахождение оптимального ангиогенных типы клеток с возможностью выполнять эти функциональные требования открывает большие перспективы для регенерации ишемии тканей.

Для того, чтобы успешно воплотить потенциальные терапии на основе ячеек в клинических испытаниях, доклинические исследования должны продемонстрировать их эффективность и выделить основные механизмы ангиогенных. Несмотря на большое количество установленных ангиогенеза анализов, поле не хватает «золотой стандарт» в vitro assay, который может достоверно оценить эффективность потенциального кандидата ячейка типы11,12, 13. Большинство в vitro ангиогенеза анализы (в том числе эндотелиальной анализов формирования распространения, миграции и трубки) обычно оценить влияние клеток или соединений на эндотелиальных клеток фенотипические изменения или различия в трубчатые и сетевых структур14,15. Хотя эти особенности важны по ангиогенез, «переводимые» Пробирная следует также оценить: 1) увеличения или замена вспомогательных типов клеток, включая pericytes или гладких мышечных клеток, 2) обработка ECM и/или базальной мембраны, и 3). эффективность для поощрения формирования функциональных microvasculature. В естественных условиях ангиогенез моделей, включая роговицы пробирного и Matrigel вилка assay, пилки микроокружения уникальный в естественных условиях , но оспариваются трудности отслеживания управляемых клеток соблюдать физических взаимодействий. Кроме того в в естественных условиях модели, xeno иммунной отказа может произойти во время тестирования кандидатов терапии потенциальных аллогенных клеток16. Ex vivo модели ангиогенеза, особенно аортального кольца assay может обеспечить: 1) легко наблюдения и количественная оценка трубчатых структур, 2) аксессуар поддержки клетки, 3) ECM от принимающей страны и искусственные материалы, 4) исключения воспалительных компоненты и 5) быстрый и недорогой установки17,18. Как правило пробирного аортального кольца можно протестировать ангиогенных потенциал малых выделительные протеины, фармакологических агентов и трансгенных грызунов модели19,,2021.

MSCs являются перспективными кандидатами для сосудистой регенерации главным образом через их паракринными опосредованной эффекты22,,2324. Было показано, что MSCs выделяют ключевые ангиогенных факторов, включая Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), инсулина подобный фактор роста-1 (ИФР-1), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и angiopoeitin-1 (анг-1)25 ,26. MSCs может также обнаружить и ишемического или воспаленные ткани, однако, точные механизмы находятся в стадии расследования. Все больше литературы поддерживает гипотезу о том, что большинство MSCs возникают из клеток периваскулярной, совместно Экспресс перицит маркеры и могут вести себя как pericytes27. HUCPVCs являются источником молодой MSCs, производный от региона периваскулярной человека пуповины. Они представляют собой население MSCs с перицит как свойства и характеризовались из пуповины FTM и срок. FTM HUCPVCs демонстрируют высокое выражение перицит маркеров, включая CD146 и NG2, Высокий пролиферативный и мультилинейного потенциал, иммунной привилегированный свойства и отображать надежный паракринными профиль28. FTM HUCPVCs являются тип ячейки идеальным кандидатом для содействия восстановлению пораженных тканей путем поощрения новой сосудистую через их свойства перицит как.

Чтобы проверить ангиогенных потенциал и перицит как свойства человека MSCs, очень ограниченное количество анализов по ангиогенез, где положительные angiotropic миграции (в дальнейшем именуемый «самонаведения»), ECM обработки и развитие физической взаимодействий между типами клеток могут быть исследованы, во время получения количественных данных о microvasculature развитии.

Настоящим мы представляем протокол, который описывает Роман применение assay аортального кольца. Человека MSCs были совместно культивируемых с развивающимися крыса производные аорты эндотелиальных сетями, оценить их вклад в формирование, созревания и гомеостаза. Эта версия аортального кольца assay оценивает способности и потенции кандидатов терапии клетки Главная сайты по ангиогенез, выполнять и посредником ECM обработки и вносить эндотелиальной трубчатых развития путем установления перицит как физической взаимодействий. Помимо количественного чистый эффект MSCs на в vitro формирование эндотелиальной сети и наблюдения межклеточных взаимодействий, мы также оптимизирован протокол изолировать MSCs от совместного культур. Выполняя проточной цитометрии и ПЦР, это можно охарактеризовать изменения в MSC фенотипа и ген выражение после совместного культуры. Как модель типов клеток мы сравнили онтогенетически рано (дородовой) и поздний (взрослый) источники человека MSCs: FTM HUCPVCs и человека МСК костного мозга-производных (BMSC), соответственно, в assay аортального кольца. Мы предлагаем, что аортального кольца assay может использоваться для изучения ангиогенных потенциал любой физически поддержки типа ячейки, когда расследуется ангиогенных регенеративной приложений.

протокол

все исследования, с участием животных были проведены и согласно прибытия рекомендации 29. Все исследования были проведены с одобрения Совета этики институциональных исследований (номер 4276 REB). Всех животных, которые процедуры были утверждены Комитетом животных ухода из университетской сети здравоохранения (Торонто, Канада) и все животные получили гуманной помощи в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных, 8 (th) издание Национальные институты здравоохранения 2011).

1. аортального кольца Assay установки

  1. изолировать аорты крысы.
    1. Euthanize 8 - 10-недельных Sprague-Dawley крыс с помощью CO 2 удушение: набор CO 2 камер до 20% газ замена (скорость потока = 0,2 x камеры тома/мин). Подтвердите отсутствие щепотку рефлекс и сердце бьется, пальпируя груди.
    2. Мокрый мех на области груди, с использованием стерилизовать марлей с 70% этиловом спирте. Использовать стерилизованные щипцы, ножницы и надрезают в средней линии груди и прорваться через слои кожи и мышц.
    3. Когда грудная клетка подвергается, разрезать грудную клетку на каждой стороне и сложить вверх примерно на 5 мм от грудины на каждой стороне. Некоторые кровотечение ожидается от межреберных артерий в свежих трупов.
    4. Ткани легких и сердца Нажимай анатомические правой стороне подвергать аорты. Аорты является белый цветной судна расположенный рядом хребтовой колонки.
    5. Использования щипцов щепотку аорты (после аорты) и использовать Ножницы хирургические, чтобы сделать первый разрез удерживая аорты с щипцами. После резки аорты, грудной полости будут быстро наполнить кровью, поэтому важно, чтобы работать быстро, чтобы получить аорты до свертывания крови.
    6. Использования щипцов провести аорты и аккуратно чистить аорты вниз, от позвоночника. Тянуть будет разорвать межреберных артерий без дальнейшего разрезов. Получите около 10 см ткани и/или аорты делится на две ветви в брюшной полости и вырезать аорты из каркаса. Толкать диафрагму при необходимости хвостового направления для получения доступа к ниже разделы аорты.
      Примечание: Корки аорты осторожно потому что интенсивной силы может привести к его разорвать. Если слезы аорты, разрешить свертывание крови в течение нескольких секунд и использовать бумажную салфетку, чтобы удалить коагулированного крови, позволяя видимость оставшихся аорты.
    7. Место аорты в 15 мл тюбик 10 мл ледяной Хэнк ' s, сбалансированный соли раствора (HBSS) дополнен с 1% пенициллина/стрептомицина (P/S). Держите трубы на льду
      Примечание: Аорты ткани может длиться в течение 1-2 ч на льду, но это лучше обработать его как можно скорее.
  2. Подготовить аортального кольца пробирного культуры средств массовой информации в стерильных биобезопасности кабинета (BSC).
    1. Подготовить эндотелиальной среднего роста (СГЭ), используя блок фильтрации для фильтрации 500 мл эндотелиальной базальной среды (дм) с 2% плода Bovine сыворотки (ФБС), гентамицин 1% и факторы роста (см. Таблицу материалы). Место 50 мл отфильтрованных СМИ в ванну из бисера или воды 37 ° C.
    2. Использовать другой блок фильтрации для фильтрации 100 мл EBM, дополненная 2% FBS и 1% P/S для подготовил МВБ 2% FBS (EBM-FBS) и хранить при 4 ° C.
  3. Пальто 12-ну тканевые культуры пластин по экстракт с базальной мембраны (BME) во время работы на льду.
    1. Место 12-ну плиты на холодной поверхности (большой пакет со льдом или лоток). Добавьте 200 мкл/хорошо свежей талой BME использования рефрижераторов наконечники и вихрем BME обеспечить ровное покрытие. Работа быстро, чтобы избежать неравномерного полимеризации БМЭ.
      Примечание: Типичный аорты иссечение дает 20 аортального кольца. Чтобы учесть изменчивость между аортального кольца анализов, установки по крайней мере три аортального кольца анализов в группе лечения и включать элемент управления. Если источник позволяет, 6 колец в группе лечения рекомендуется.
    2. Место пластины с покрытием в увлажненные инкубаторы (относительная влажность 95%, 37 ° C, 5% CO 2; эти условия применяются к все увлажненной инкубатор шаги далее) для 30 min. место 1000 мкл наконечники обратно в-20 ° C для шага 1.5.3.
      Примечание: Хотя в складе концентрации используется экстракт базальной мембраны, ее последовательность и жесткость строго контролируется время полимеризации. Не забудьте сохранить точное же время полимеризации для всех параллелей и независимых экспериментов.
  4. Раздел аорты в единообразных кольца.
    1. Взять аорты из 15 мл трубки и поместить его в 10 см блюдо с 10 мл свежего HBSS дополнен с 1% P/S.
    2. Использовать два набора щипцами осторожно отделить избыток соединительной ткани, жировой ткани и использования скальпеля для остальных ветвей межреберных артерий связано в аорту. Это снижает изменчивость между подразделениями кольцо, основанные на различных уровнях остаточной ткани. Удалить любые остаточные свернувшийся крови от внутри аорту.
    3. Место правителя или сетки под 10 см блюдо точно отрезать 1-2 мм широкого круга аорты, используя стерильным скальпель и пинцет. Вырезать в разделах как точные, как можно снизить изменчивость между подразделениями,.
  5. Вставлять аортального кольца в БМЭ.
    Примечание: Если секционирование аортального кольца не завершена до инкубации полимеризации BME, удалить пластины с покрытием из увлажненной инкубаторы и 100 мкл EBM по каждой скважине прекратить полимеризации. Точные сроки имеет решающее значение, как чрезмерной полимеризации BME может помешать миграции развития и клеток эндотелия сети. Как только готовы аортального кольца, удалите МВБ из скважин и продолжите с шага 1.5.2.
    1. Удалить скважин BME покрытием из увлажненной инкубаторы и вернуться к BSC.
    2. Тщательно подобрать индивидуальные аортального кольца с щипцами и одна в середине каждой скважины, BME-покрытием. Повторите эти действия для остальных аортального кольца.
      Примечание: СМИ, переданы вместе с аортальной кольцо должно быть минимальным для того, чтобы избежать нарушения полимеризации.
    3. Использование охлаждением (-20 ° C) 1000 мкл наконечники 300 мкл БМЭ метки поверх каждого аортального кольца и равномерно распределять BME вокруг колодца.
    4. Возвращает встроенный аортального кольца для увлажненные инкубаторы для 30 мин
    5. Удалить пластины с помощью встроенного аортального кольца из увлажненной инкубаторы и медленно добавить 1000 мкл EGM (подготовленные и утепленные на шаг 1.2.1), поместив пипеткой подсказка к стене культуры хорошо.
      Примечание: Непосредственно закупорить СМИ на BME может нарушить полимеризованной БМЭ и препятствовать развитию непрерывного эндотелиальной сети. При наличии используйте соответствующие многоканальные пипетки.
    6. После 24 ч, удалите 1000 мкл внеочередного общего собрания акционеров и замените 1000 мкл EBM-FBS, подготовленный на этапе 1.2.2, снова медленно хорошо закупорить против стороны культуры.
  6. Поддерживать пробирного аортального кольца, заменив 500 мкл EBM-FBS 500 мкл свежих EBM-FBS (37 ° C) каждые 48 ч.
    Примечание: См. секТион 2 начать MSC культура расширение, в тот же день, как создание пробирного аортального кольца. Это будет гарантировать, что MSCs готовы для совместного культуры, когда эндотелиальной сети готовы.
  7. Использовать яркие поля микроскопии следовать аортального кольца пробирного эндотелиальной сети развития (см. Рисунок 1 как ссылка для развития оптимальной сети). После эндотелиальной сетей аспект является, как показано на рисунке 2, продолжите создание совместного культур аортального кольца пробирного MSC (раздел 3). Обратитесь к шагу 4.1 для дальнейших деталей изображений эндотелиальной сетей.

2. Культура ткани

  1. подготовка запасов решения тканевой культуры средств массовой информации.
    1. HUCPVCs FTM культуры (ранее созданных, n ≥ 3 независимые линии для каждого) 30 и коммерчески доступных BMSCs в альфа MEM дополнена 10% FBS и 1% P/S.
    2. Стерилизации средств массовой информации, с использованием 0.2 мкм поры размер фильтра бутылок.
    3. Хранения подготовленных медиа-решения на 4 ° C до 3 недель.
  2. Поддерживать HUCPVC FTM и BMSC культур в увлажненные инкубаторы и проход на 70-80% confluency определяется фазово-контрастной микроскопии. Соответствующие объемы использования средств массовой информации для размера тканевой культуры блюдо используется (т.е. 10 мл в 10 см блюдо). Используйте эти культуры условий для сохранения и пассированый MSCs.
  3. Отделить MSC монослои для пассированый или аортального кольца пробирного MSC совместно культур с помощью раствором фермента диссоциации (4 мл/10 см блюдо) и инкубировать в увлажненные инкубаторы для 3 мин обеспечить отряд клеток, используя яркие области микроскопии; инкубировать для дополнительных 1-2 мин, если требуется.
  4. Передача диссоциированных клетки в 15 мл трубки и центрифуги на 400 g x 5 мин
  5. Аспирационная супернатант не нарушая Пелле клеток и Ресуспензируйте клеток в 1 мл соответствующей культуры средств массовой информации (альфа MEM полный СМИ для пассированый клетки или EBM-FBS аортального кольца пробирного/MSC Сопредседатель культур) для подсчета, используя счетчик клеток.

3. Подготовка аортального кольца Assay/MSC Сопредседатель культур

  1. 10 семян 4 MSCs на каждом встроенных аорты кольцо (9000 клеток/см 2 / 12-ну пластины). Основываясь на количество анализов аортального кольца, предварительно пятно MSCs с жизнеспособным, непередаваемую Люминесцентную краску. Поддерживать по крайней мере три скважины аортального кольца без MSCs для группы управления.
    1. Пятно 10 5 MSCs/мл ДМ-FBS СМИ, 2,5 мкл жизнеспособным, непередаваемую Флюоресцентная краска/мл СМИ (5 мкм) в 15 мл трубки и место в увлажненные инкубатора для 30 мин осторожно смешать трубки на полпути через инкубации.
    2. Следующие 30 мин инкубации, добавить 1 объем свежего EBM-FBS окрашенных клеток и спина на 400 x g 5 мин
    3. Удалить супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл ДМ-FBS средств массовой информации. Подтверждение успешного пятнать MSCs, с помощью микроскопии флуоресцирования.
  2. Аортального кольца содержащих пластины из увлажненной инкубатора и удалите из каждой скважины 500 мкл EBM-FBS.
  3. Тщательно семян 10 4 MSCs в 500 мкл EBM-FBS на каждого внедренного аортального кольца, равномерно закупорить вокруг эндотелиальной сетей. Обеспечить равномерное распределение, слегка покачивая пластину культуры.
    1. Добавить дополнительные EBM-FBS для обеспечения того, чтобы общий объем средств массовой информации на аортального кольца пробирного/MSC Сопредседатель культур 1000 мкл.
  4. Визуализировать дневно помечены MSCs в assay аортального кольца с помощью микроскопии флуоресцирования.

4. микроскопия

  1. использования ярко поле микроскопии изображений крыса эндотелиальной сетей до аортального кольца пробирного/MSC совместно культур для измерения базовых (день 0) свойства эндотелия сети (например, сеть Длина сети петли). Изображение 4 квадрантов на колодец из аорты кольцо в секцию дальней эндотелиальной сети в этом квадранте.
    1. Изображения аортального кольца сетей после аортального кольца пробирного/MSC совместно культур на 3, 5 и 7 дней. Используйте эти образы для количественного определения MSC эффект на развитие эндотелиальной сети.
  2. Использовать изображение предварительно помечены MSCs в assay аортального кольца микроскопии флуоресцирования.
    1. Следующие 24 часа аортального кольца пробирного/КБМ Сопредседатель культур, использовать микроскопии флуоресцирования визуализировать MSC самонаведения, удлинение и интеграцию с эндотелиальной сетями. Перекрытие флуоресцентного изображения MSCs с светлые области изображения эндотелиальных клеток соблюдать colocalization обоих типов клеток.
    2. Изображения MSCs, локализованные в рамках развитых сетей эндотелиальной проксимальнее аортального кольца ткани и MSCs, локализованные в новых развивающихся сетей дистальнее аортального кольца ткани ( рис. 2).

5. Поток цитометрии и ПЦР

  1. за один день до отделения аортального кольца эндотелиальной сетей, оттепель замороженных dispase при температуре 4 ° C O/н. раздел 5.3 идентичен для проточной цитометрии и ПЦР.
  2. Теплый 50 мл dispase и 50 мл 0,5% трипсина в ванне шарик или воды 37 ° С.
  3. Получить клетки для анализа из культур совместного анализа/MSC аортального кольца.
    1. После 1 недели аортального кольца пробирного/MSC Сопредседатель культуры, извлеките носитель культуры и добавьте 1 mL из Phosphate-Buffered солевой (PBS) медленно, чтобы каждый хорошо для 3 мин и удалить. Повторите это мыть дважды больше.
    2. Добавить 800 мкл предварительно разогретую dispase для каждой скважины и инкубировать в увлажненные инкубаторы для 15 мин
    3. Удалить пластины из увлажненной инкубаторы и приостановить dispase, дозирование (5-10 x) с распадаются БМЭ и перенесите содержимое каждой скважины в отдельные 15 мл пробирок.
    4. Повторите шаг 5.3.3 снова с свежими подогретым dispase пока не остаточной BME наблюдается также в культуре. Добавить 1 объем PBS, дополненный 3% FBS в суспензии dispase клеток для инактивации dispase. Удаление аортального кольца, плавающие в суспензии клеток, используя наконечники.
    5. Спина клеточных суспензий на 400 x g для 5 минут удалить супернатант тщательно, оставляя 3 мл суспензии клеток в 15 мл тюбик.
      Примечание: Очевидно, твердые гранулы могут быть не видны, но присутствуют клетки и БМЭ.
    6. Добавить 3 мл 0,5% подогретую трипсина в суспензию клеток и энергично Ресуспензируйте (5-10 x, закупорить) клетки. Инкубировать решения trypsinized клеток в увлажненные инкубаторы для 10 мин
    7. Снять trypsinized клеточных суспензий с увлажненной инкубаторы и добавить 6 мл PBS, дополненный 3% FBS и Ресуспензируйте несколько ТимES. Спиновые клеточных суспензий на 400 g x 5 мин
    8. Тщательно удалить все супернатанта, оставляя ячейки гранул в трубе и Ресуспензируйте клеток в 1 мл PBS, дополненный 3% FBS в каждой тюбике.
    9. Фильтр 1 мл суспензии клеток, используя стрейнер ячейки 70 мкм для удаления из суспензии клеток агрегированных клетки и остаточной БМЭ. Подсчет клеток в 1 мл суспензии клеток, используя счетчик клеток.
  4. Подготовить клетки для проточной цитометрии.
    1. Инкубировать клетка подвески (10 5 клеток в 200 мкл PBS, дополненный 3% FBS) с Флюорофор (FITC или APC) первичных антител конъюгированных (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) концентрация = 1:40) на 4 ° C на 30 мин, защищенном от света.
      Примечание: Гонконг et al., 2013 28 был оптимизирован проточной цитометрии для MSCs. Для точных результатов требуется как минимум 10 000 ячеек.
    2. После 30 минут инкубации, Ресуспензируйте клетки в 2 мл PBS, дополненный 3% FBS и центрифуги (400 x g, 5 мин).
    3. Клетки хранить при 4 ° C, защищенном от света до анализа подачей cytometry (по крайней мере 1 x 10-4 события) в течение 1 ч. Шлюзовые стратегии смотрите Дополнительные рисунок 1. Сортировать человека MSCs с помощью анти TRA-1-85 (APC) (концентрация: 1:40 и в 0,5% FBS/PBS) и сортировать клетки в 350 мкл буфера lysis клетки для ПЦР анализа.
      Примечание: Лизированных клетки могут храниться при температуре-80 ° C до 3 месяцев для будущих ПЦР анализа.
  5. Подготовить клетки для ПЦР анализа.
    1. Изолировать РНК от лизированных клеток, используя наборы изоляции RNA на основе столбцов и определения концентрации РНК и качество.
    2. Подготовка cDNA от до 5 мкг РНК на 100 мкл обратной транскриптазы реакции. Выполнение предварительного усиления шаг при низкой урожайности РНК (< 10 нг/мкл). Использование менее чем 100 нг РНК приведет к высокий уровень ложных негативов.
      Примечание: CDNA шаблоны могут храниться при температуре-20 ° C для дальнейшего анализа на срок до 4 месяцев.
    3. Выполнять ПЦР с помощью ангиогенеза выражение профилировщик массивы обнаружить изменения в экспрессии генов. Использование 5 нг cDNA в реакции (40 циклов, отжиг/расширение температура 60 ° C). Экспресс раз изменения выражения по сравнению с недифференцированными MSC получены образцы cDNA. Запустите соответствующий негативный контроль (аортального кольца без человека MSCs).

6. Сети количественной оценки следующие аортального кольца Assay/MSC совместно культуры

  1. скачать изображений программное обеспечение таких как ImageJ наряду с ангиогенеза анализатор плагин 31.
  2. Импорта эндотелиальной сети снимки и открывать с помощью программного обеспечения.
  3. Конвертировать изображения весы, основанный на спецификации используется Микроскоп.
  4. Использовать прямой инструмент для измерения роста радиальная сеть.
  5. Количество эндотелиальных сети петли, с помощью инструмента Счетчик клеток (петли с по крайней мере 4-х сторон должны быть количественно).
  6. Для дополнительного количественного определения свойств сети, использовать анализатор ангиогенеза плагин или другие аналогичные плагины для анализа главных сегментов, Общая длина сегмента, областях общей сети и количество узлов. Используйте средство затуманенное маски для размытия аортального кольца ткани и пустые пространства, чтобы избежать ложных положительных расчеты.
  7. Передачи значения статистики программы и график эндотелиальной свойства сети после совместного культур аортального кольца пробирного/MSC.

Результаты

Схема работы потока для создания пробирного Сопредседатель культуры аортального кольца/MSC показана на рисунке 1. Основные этапы включают в себя: Крыса аорты изоляции, секционирование и встраивание аортального кольца, мониторинг эндотелиальной прорас?...

Обсуждение

Существует несколько критических этапов в создании успешных аортального кольца пробирного MSC Сопредседатель культуры эксперимент. Во-первых, являются наиболее важных шагов при изоляции и секционирование аорты: 1) получения исключительно сегмента грудной аорты; 2) тщательно устранения...

Раскрытие информации

Доктор Клиффорд л Librach является совместное держателем патента: методы изоляции и использования клеток, полученных от первого триместра ткани пуповины. Предоставлено в Канаде и Австралии.

Благодарности

Авторы поблагодарить следующих сотрудников и исследования персонала: Andrée Готье-Фишер, Мэтью Librach, Таня Барретто, Tharsan Velauthapillai и Сара Laronde.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Alpha-MEMGibco12571071For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85R&D SystemsFAB3195AHuman-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel)Corning354234For aorta embedding
Bullet-kitLonzaCC-3162Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA DyeThermo-fisherC2925For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture MicroscopeOlympusFor bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counterInvitrogenC10227Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
DispaseStemCell technologies7923For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpelsVWR21909-654For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered salineSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM)LonzaCC-3156Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology GradeVWR97064-768To sterilize surfaces
EVOSLife TechnologiesIn-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)GE HealthcareSH3039603Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibodyBD558068Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibodyBD560846Human pericyte marker for flow cytometry
ForcepsAlmedic7727-A10-704For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175-0941X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific51026410For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR arrayQiagenPAHS-024ZHuman specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJOpen source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR IIBDUHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycinGibco15140122Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini KitQiagen74104For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand KitQiagen330421For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis KitQiagen330451Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissorsFine Science Tools14059-11For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauzeVWR3084To dampen and sterilize chest fur
TrypleEThermo Fisher Scientific12605036MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unitThermo Fisher Scientific566-0020To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200056For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishesCorning25382-428For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture platesCorning-Sigma AldrichCLS3513For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tubeBD Falcon352096For general tissue culture procedures
70 μm cell strainerFisherbrand22363548To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

Ссылки

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

127

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены