عد البروتينات في الخلايا المفردة مع الحبرية عنونة [ميكروارس]

Summary

نقدم هنا الحبرية عنونة [ميكروارس] (ADMs)، أسلوب صفيف على أساس الحبرية قادراً على تحديد وفرة البروتين المطلق في الخلايا المفردة. علينا أن نظهر قدرة ADMs على تميز عدم التجانس في التعبير عن p53 البروتين القامع الورم في خط خلية سرطان بشرية.

Abstract

ويتم تحليل السلوك كثيرا ما الخلوية والاستجابات الخلوية على مستوى السكان حيث يتم تجميع الردود من العديد من الخلايا معا كنتيجة متوسط إخفاء سلوك خلية مفردة غنية داخل سكان معقدة. جعلت تكنولوجيات الكشف والتحديد الكمي البروتين وحيد الخلية أثرا ملحوظا في السنوات الأخيرة. هنا يصف لنا منصة تحليل عملي ومرن من خلية واحدة استناداً إلى الحبرية عنونة [ميكروارس]. تصف هذه الدراسة كيف يمكن قياس الأرقام المطلقة نسخة من البروتينات المستهدفة مع القرار خلية مفردة. هو p53 القامع الورم الأكثر شيوعاً تحور الجين في السرطان البشري، مع أكثر من 50% حالات سرطان الكلي نستعرض نمط تعبير p53 غير صحية. البروتوكول يصف الخطوات لإنشاء 10 قطرات nL ضمنه الخلايا السرطانية البشرية واحدة معزولة ويتم قياس عدد نسخ البروتين p53 مع القرار جزيء واحد لدقة تحديد التغير في التعبير. قد يتم تطبيق الأسلوب إلى أي نوع من الخلايا بما في ذلك المواد الأولية لتحديد عدد النسخ المطلق من البروتينات المستهدفة أي اهتمام.

Introduction

والهدف من هذا الأسلوب لتحديد التباين في وفرة البروتين المستهدف في عدد سكان خلية مع القرار خلية مفردة. تحليل وحيد الخلية يوفر عددا من المزايا التي لا تتوفر بالطرق البيوكيميائية الفرقة التقليدية. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} أولاً، العمل على مستوى الخلية الواحدة التقاط الغنية عدم تجانس السكان الخلية التي سوف تضيع خلاف ذلك من متوسط الذي يحدث مع التقنيات التقليدية فرقة البيوكيميائية. غالبية الطرق البيوكيميائية الحصان العمل العمل مع الجزء الأكبر، التي تتطلب، كما يفعلون في كثير من الأحيان، ملايين خلايا للحصول على نتيجة. بطبيعة الحال، والمترتبة على تقييم السكان الخلية بأكملها يتوقف على عدد من العوامل، على سبيل المثال، عدم التجانس في التعبير البروتين حيث قد غاب عن بعض الميزات الهامة لتوزيع وفرة البروتين. من منظور عملي، جعلها الحساسية اللازمة لتقنيات خلية واحدة قادرة على العمل مع كميات من المواد البيولوجية التي لا تكفي حتى التقنيات الأكبر أكثر حساسية وظيفة. مثال أساسي لهذا هو دراسة أنواع الخلايا النادرة مثل تعميم ورم الخلايا (ريادية) فيها حتى بالنسبة للمرضى الذين يعانون من نظرة تشخيصية فقراء أقل من 10 ريادية قد تكون موجودة في دم واحد 7.5 مل رسم. ⁶ هنا نقدم المنهجية اللازمة لإجراء القياسات البروتين وحيد الخلية تخفيض حجم التحليل القائم على جسم تستخدم قطرات النفط توج المطبوعة على ميكرواري جسم استخدام.

هي منصات الحبرية موائع جزيئية عالية الإنتاجية، قادرة على توليد آلاف قطرات في الثانية، وقادرة على عزل، واستزراع حتى، الخلايا المفردة في قطرات الفردية لأداء مجموعة واسعة من الاختبارات البيوكيميائية. الأساليب المستندة إلى الحبرية أيضا مناسبة لتحليل خلية مفردة،^7،،من⁸⁹ مع الأمثلة الأخيرة الجديرة بالذكر بما في ذلك دروبسيق¹⁰ وإيندروب¹¹، التي ساعدت إلى حد كبير بقوة تقنيات التضخيم. كمية محدودة من المواد ولا أساليب التضخيم للبروتينات تجعل البروتيوميات خلية مفردة تنطوي على تحديات خاصة.

قطرات قد يتم تحليلها بعدد من الأساليب والفحص المجهري الأسفار وقد استخدمت على نطاق واسع. تقنيات جزيء واحد مثل الانعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية تسمح جزيئات الفلورية تصور مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء لا مثيل لها. ¹² سبب الانحلال الأسى من ميدان زائل، متحمسون فقط فلوروفوريس بالقرب من السطح (ترتيب 100nm) عالية مما يجعل TIRF استراتيجية جيدة في الكشف عن كميات صغيرة من جزيء الهدف في خليط معقد. قوة تقطيع البصرية المتأصلة TIRF كما يساعد على تجنب خطوات الغسيل والاعتداء حدود الوقت وتعقيد. ومع ذلك، TIRF يتطلب السطوح المستوية وأمثلة للفحص المجهري TIRF المطبقة على قطرات في تدفق تنطوي على تشكيل سطح مستو منها بصورة. ¹³ تحقيقا لهذه الغاية، تقنيات البروتين وحيد الخلية غالباً تصميم رقائق موائع جزيئية حول عوامل التقاط سطح معطلة في شكل ميكرواري. ^{4 , 14}

قد شكلت القطرات، أنفسهم، في صفائف على الأسطح المستوية الحبرية ما يسمى [ميكروارس]. ^{15 , 16 , 17} تنظيم قطرات مكانياً في صفائف يسمح لهم بتكون مريح فهرستها بسهولة رصدها مع مرور الوقت وفردية موجهة و، إذا لزم الأمر، استرداد. ويمكن تحقيق الحبرية [ميكروارس] بكثافة عالية من المفاعلات الصغيرة مع آلاف عناصر كل شريحة بذاتها أو تدعمها هياكل ميكروويل. ^{18 , 19 , 20} أنها قد تكون شكلت بترسب متسلسلة بمناولة السائل الروبوتات، مستطلعين النافثة للحبر، اتصل ميكرواراييرس^21،،من^2223،،من^{2425، 26} أو أنها يمكن تجميع ذاتي على السطوح مثل سوبيرهيدروفيليك البقع منقوشة على سطح سوبيرهيدروفوبيك. ^{27 , 28 , 29}

في ضوء هذه الاعتبارات، صممت عنونة الحبرية [ميكروارس] (ADMs) الجمع بين براعة و addressability المكانية وكميات مخفضة من [ميكروارس] الحبرية مع حساسية جزيء واحد TIRF المجهري للكمية قياس وفرة البروتين. ⁵ ADMs تمكين تحليل خلية مفردة تشكيل ميكرواري الحبرية التي تحتوي على خلايا مفردة أكثر جسم ميكرواري، الذي هو ثم توج بالنفط لمنع التبخر. وحدات تخزين القطرات منفصلة لمنع فقدان عينة، تتحقق إلا بأحكام بصمام على شريحة في تدفق مستمر ميكروفلويديكس. ³⁰ المبلغ المطلق للبروتين الهدف من خلية واحدة صغيرة للغاية؛ ومع ذلك، يسمح تدني حجم القطرات لتركيز المحلية مرتفعة نسبيا كيما يتم الكشف عنها باستخدام مقايسة أضداد ساندويتش-جسم هو المعطل تداولها في منطقة متميزة، أو بقعة على سطح الذي يلتقط البروتين الذي يربط بدوره لجسم فلوريسسينتلي المسمى الكشف عن هذا في حجم قطره. كنهج خالية من التسمية (أي البروتين أهدافا لا تحتاج إلى أن توصف بشكل مباشر)، ADMs قابلة للتطبيق عموما لتحليل الخلايا من المصادر الأولية، مثل الدم المجهزة، وغرامة بحاجة إلى تبين وينتابها ورم الخزعات، فضلا عن خلايا من الثقافة و ما ليساتيس.

قياس التباين في وفرة البروتين عبر سكان خلية مهم في تحديد تباين استجابة، على سبيل المثال، إلى مخدرات وسوف يساعد في توفير نظرة ثاقبة الوظائف الخلوية ومسارات، تقييم الفئات السكانية الفرعية وبهم السلوك، فضلا عن تحديد الأحداث النادرة التي خلاف ذلك سوف يكون مقنعا بأساليب الجزء الأكبر. توضح هذه المقالة كيفية إنتاج واستخدام عنونة الحبرية [ميكروارس] لتحديد الكمية وفرة p53 عامل النسخ في الخلايا السرطانية البشرية هذا البروتوكول ويمكن استخدامها للتحقيق في دور p53 في الاستجابة للعلاج الكيميائي المخدرات. البروتين الهدف يتحدد باختيار الالتقاط والكشف عن الأجسام المضادة ويمكن تعديله لتشمل أهدافا مختلفة أو أكثر. يتم توفير إرشادات لبناء جهاز بسيطة تتضمن فوهة متحدة مركز من لوازم مختبر العامة لصفيف 10 قطرات nL توج بالنفط يدوياً. ويرد وصف عملية تجريبية كاملة بموجبه كل قطره ثم تحميل مع خلية مفردة، ومن ثم تفكيك والتعبير عن البروتين مصممة مع القرار جزيء واحد استخدام الفحص المجهري TIRF.

Protocol

1-إعداد

1. رقائق وطباعة جسم [ميكروارس]
   1. إرفاق المعزل لاصق سيليكون/اكريليك ساترة فونكتيوناليزيد لدعم ميكرواري جسم. وهذا يشار إليه كشرائح.
      ملاحظة: تم اختبار كيمياء السطح مختلف لملاءمتها مع قطرات عنونة. ⁵ قد تحتاج كيمياء السطح الأمثل لوكلاء أسر بديلة. ADM عوازل متوفرة تجارياً أو قد يتم إنتاجها بالليزر قطع اﻷكريليك (CAD الملف للمعزل المستخدمة في هذا العمل يتم توفيرها للتنزيل؛ راجع ملف التعليمات البرمجية الإضافية).
   2. التبديل في ميكروارايير وتعيين نسبة الرطوبة إلى 75%.
      ملاحظة: الرطوبة النسبية يقلل من تبخر المحلول الطباعة من طرف ميكرواري ويقلل التباين داخل وبين سبت.
   3. تنظيف دبوس ميكرواري في دبوس تنظيف الحل لمدة 5 دقائق قبل ultrasonication. شطف pin مع المياه النقية فائقة باستخدام زجاجة غسيل والجاف باستخدام النتروجين.
      ملاحظة: تعليق رقم التعريف الشخصي فيما يتعلق بألا تزج نصيحة دبوس. سوف تساعد شريحة مجهر مع مجموعة على النحو المناسب حفر ثقوب إذا لا يمكن الحصول على حامل دبوس.
   4. إجراء 5 مل من المخزن المؤقت للطباعة تتألف من 3 × سترات الصوديوم المالحة (SSC) العازلة، بروبيل بتائين 1.5 متر وتستكمل مع 0.01 ٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS). تخزين في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
   5. لإعداد حل طباعة، ذوبان الأجسام المضادة-p53 (p53/Mdm2 أليسا كيت؛ انظر الجدول للمواد) مختبرين المخزنة في-80 درجة مئوية. مزيج من 1:1 مع المخزن المؤقت للطباعة إلى تركيز نهائي من 0.5 ملغ/مل. تحميل 5-10 ميليلتر من حل الطباعة في صفيحة جيدا 384 استخدام ميكروبيبيتي وفي ميكروارايير.
   6. تحميل رقائق تجميعها في خطوة 1.1.1 في ميكروارايير. برنامج ميكروارايير لطباعة بقع في الإحداثيات التي حددها المركز من كل بئر المعزل.
      ملاحظة: ميكرواراييرس تستخدم طائفة من، أساسا، البرمجيات المسجلة الملكية وحتى القارئ مدعوة إلى مراجعة الأدبيات ذات الصلة. ميكرواري المطلوبة للمعزل ADM واردة في الملف CAD المصاحبة لها في خطوة 1.1.1 يتألف من العناصر مستطيلة؛ يتم توفير مسافات ذات الصلة.
   7. تخزين الرقائق في حاويات محكم والتفاف مع إحباط. تخزين في 4 درجات مئوية إلى 6 أسابيع.
      ملاحظة: إحباط لمنع أي صور--الضرر. حدود التخزين في 4 درجات مئوية معدل تدهور الجزيئات الحيوية وأي ردود الأفعال الضارة التي قد تعمل على الحد من نشاط ميكرواري. وعاء محكم يسمح رقائق لحجته إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها دون التكثيف تشكيل على سطح الرقاقة. طباعة جهات الاتصال ميكرواري يستغل التوتر السطحي والالتصاق بين حل الطباعة والركيزة الطباعة لإنتاج البقع. ما قبل الطباعة أو النشاف مطلوب عادة إزالة الحل الزائدة من طرف ميكرواري تؤتي البقع موحد الحجم. عدم تجاهل ساترة ما قبل الطباعة الذبيحة حيث يمكن استخدامه لتقييم نوعية دفعة.
2. إعداد المحاقن، فوهة الأنابيب ومتحدة للاستغناء عن قطرات عنونة
   1. تفكيك 100 ميليلتر (الحبرية مائي) ومل 1 (للنفط متوجا) الزجاج المحاقن هاملتون وشطف الأجزاء مع المقطر H₂o.
   2. تغذية بطول 100 مم من 150 ميكرومتر معرف/360 ميكرومتر OD تنصهر والسليكا الأنابيب عن طريق طوله 40 مم من 1.0 مم معرف/1/16 "أنابيب OD منهاج العمل حتى أنه يبرز من 2 مم. وستشكل هذه الفوهة متحدة المركز.
   3. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate إلى نهاية طرف ماصة 10 ميليلتر وإدراج قطعة 40 مم من 1.0 مم معرف/1/16 "أنابيب OD منهاج عمل بيجين. إذا لزم الأمر، قم بتغيير موضع الأنبوب والسليكا فوسيد للحفاظ على نتوء 2 مم في الفوهة قبل مجموعات لاصقة.
   4. إدراج الطرف الآخر من السليكا فوسيد الشعرية في نهاية طوله 200 ملم 0.014 "معرف/0.062" OD PTFE أنابيب والاتصال هذا 100 ميليلتر هاملتون حقنه مليئة 4% مصل بقرى الزلال (BSA) في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) (ببسا).
      ملاحظة: البروتينات وغيرها من الأنواع الكيميائية الحيوية قد ربط غير خصيصا للأسطح ويمكن فقدت أو التشويه والتحريف. يتم استخدام جيش صرب البوسنة 'تعطيل' السطوح إلى أدنى حد غير محددة ملزمة قرباني ملزمة لتلك السطوح.
   5. أدخل طول 400 مم من 1.0 مم معرف/2.0 مم أنابيب OD FEP في تلميح ماصة 200 ميليلتر حتى أنها تشكل ختم. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate على آخر 200 ميليلتر ماصة نصيحة ودفع هذا في أول تلميح لإصلاح الأنبوب في مكانة. قم بتوصيل الطرف فتح أنابيب OD FEP ملم معرف/2.0 1.0 مم 1 مل هاملتون حقنه مليئة بالزيوت المعدنية.
   6. إدراج 200 ميليلتر ماصة نصيحة الجمعية في 10 ميليلتر ماصة غيض من فوهة متحدة المركز. ضع الحقن في مضخات حقنه منفصلة كما أنها سوف تحتاج إلى أن تعمل بشكل مستقل.
   7. ملء المحاقن 100 ميليلتر مع 4% ببسا عرقلة الحل. أعد وتدفق الأنابيب 'مائي' عرقلة للحل. كرر هذه العملية مرتين لمجموعة الإحمرار 3.
   8. ملء المحاقن 100 ميليلتر مع 0.125 ميكروغرام مل^-1 الكشف عن الأجسام المضادة (p53 المضادة جسم (-1) المسمى مع أليكسا 488) 4% ببسا وإعادة إرفاق الأنابيب. يستعاض عن عرقلة الحل في الأنابيب بالاستغناء عن 25 ميليلتر كشف الأجسام المضادة الحل.
   9. تدفق الأنابيب 'النفط' مع الزيوت المعدنية حتى تملأ جميع الأنابيب والفوهة بالنفط. إعادة ملء المحاقن 1 مل مع الزيوت المعدنية وإعادة إرفاق الأنابيب. تأمين الجمعية مناور XYZ على الأنابيب وفوهة.
3. إعداد ميكروينجيكتور وميكرومانيبولاتور
   ملاحظة: الخطوات أدناه إشارة محددة إلى مكونات ميكروينجيكتور وجهاز ميكرومانيبولاتور المحددة في "الجدول للمواد"، ولكن قابلة للتطبيق عموما لأي جهاز من هذا القبيل.
   1. التجمع في ميكروينجيكتور عن طريق ربط أنابيب الضغط وحامل الشعرية.
   2. تدوير ببطء الاتصال الهاتفي المكبس حتى يملأ الزيوت المعدنية تماما على الخط.
   3. جبل صاحب الشعرية في جبل الرأس الترجمة.
   4. إصلاح شعري في حامل الشعرية مع رئيس قبضة.
   5. "الماصة؛" حلاً 4% ببسا إلى واحدة من آبار المعزل.
   6. ترجمة باستخدام ميكرومانيبولاتور وتزج غيض من شعري في الحل.
   7. ملء ببطء شعري مع 4% ببسا وإجازة لحظر لمدة 10 دقائق.
   8. إخراج ميكروكابيلاري وقطب وحدة الترجمة حيث أن الجمعية الواضح للرقاقة.

2-تشكيل قطرات عنونة وتحميل مع خلايا مفردة

1. شكل قطيرات عنونة
   1. تأمين الرقاقة على المسرح المجهر.
      ملاحظة: هو المجهر الأسفار مقلوب المجهر الآلي قادر على جزيء واحد TIRF مزودة مرحلة XY مرمز والكترون ضرب جهاز الكاميرا (م-اتفاقية مكافحة التصحر).
   2. تسجيل إحداثيات المرحلة المجهر من كل بقعة في الصفيف باستخدام برامج التحكم الآلي المجهر.
   3. تعيين مناور XYZ على المسرح المجهر. ضع الفوهة في زاوية من 50-60 درجة مئوية. ضمان أن الفوهة طول كاف والتخليص للوصول إلى شرائح. تعيين 'مائي' و 'النفط' المحاقن مضخات الاستغناء عن 10 nL في 100 ميليلتر/min و 5 ميليلتر في الدقيقة 100 ميليلتر، على التوالي.
      ملاحظة: أثناء الإعداد، قد جاف محلول مائي على رأس الفوهة.
   4. الاستغناء عن محلول مائي حتى حبة سائل مرئياً على رأس الفوهة. الدأب مع مسح غبار مجاناً لإزالته.
      ملاحظة: اعتماداً على عدد الشروط قيد التحقيق، حجز عدد من الآبار لتكون بمثابة خزانات للخلايا. سوف يكفي خزان واحد لخط أو نوع خلية مفردة.
   5. باستخدام برامج التحكم الآلي المجهر، تعيين إحداثيات المرحلة المجهر إلى بقعة جسم في الصفيف والتركيز على سطح ساترة.
   6. الحرص على عدم الإخلال بالحال، استخدام مناور XYZ، محاذاة طرف فوهة متحدة المركز إلى جانب بقعة جسم الشعرية الزجاج والاستغناء عن 10 nL محلول. دون الانتقال إلى المراحل، الاستغناء عن 5 ميليلتر من النفط الحد الأقصى في المحلول. ببطء رفع الفوهة واضحة من الحبرية والانتقال إلى التالي جيدا.
   7. كرر الخطوة 2.1.6 لكل جسم بقع في الصفيف.
   8. وبعد 30 دقيقة، صورة جميع النقاط في الصفيف باستخدام برامج التحكم الآلي المجهر لتحديد خلفية الجزيئات واحدة ملزمة لكل جسم بقعة قبل تحميل خلايا.
2. تحميل قطرات عنونة مع الخلايا
   1. إزالة قوارير الثقافة الخلية من الحاضنة وفصل الخلايا باستخدام حل التربسين/يدتا.
      ملاحظة: في هذه الدراسة، خط خلية سرطان القولون البشرية تكون استخدمت ومثقف استخدام تعديل النسور المتوسطة (دميم دولبيكو) تستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) في حاضنة₂ CO.
   2. إذا لزم الأمر، وصمة عار فلوريسسينتلي الخلايا.
      1. ريسوسبيند الخلايا في حل من 0.125 ميكروغرام/مل الكشف عن الأجسام المضادة (p53 المضادة جسم (-1) المسمى مع أليكسا 488) في 10% FBS في L-15 وسائل الإعلام. للتأكد من تعليق خلية مفردة، تصفية الحل خلية عن طريق مصفاة خلية الملعب 40 ميكرومتر.
   3. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتمييع أو تركيز حل الخلية بتركيز 25-400³ × 10 خلايا/مل. وهذا ما يضمن أن الرواسب الخلايا مع تباعد كافية لمعالجة بشكل مريح في ميكروكابيلاري.
   4. تحميل خلايا مفردة في عنونة قطرات من الخزان الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور وميكروكابيلاري.
      ملاحظة: الخلايا غير ملتصقة قد تكون محملة بكميات كبيرة إلى ميكروبيبيتي والاستغناء عن واحدة تلو الأخرى إلى قطيرات عنونة. على الرغم من المعاملة حظر السطحية، سوف تميل خطوط الخلايا ملتصقة العصا غير تحديداً إلى الجدار الداخلي ميكروكابيلاري الزجاج وتضيع.
   5. استخدام هدفا × 10 للاحتفال، استخدم في ميكروينجيكتور لنضح خلية واحدة في ميكروكابيلاري من الخزان الخلية.
   6. تخزين إحداثيات المرحلة ميكرومانيبولاتور في حالة استخدام مرحلة مناور إلكترونية أو ملاحظة z-الموقف يدوياً.
   7. سحب ميكروبيبيتي بترجمة صعودا إلى مسح ارتفاع 1 مم للرقاقة. تنفيذ ذلك يدوياً مع جويستيك أو تلقائياً باستخدام ميزة 'إخراج' مرحلة مناور الإلكترونية.
   8. مجموعة تنسق المرحلة إلى أن من الحبرية عنونة استخدام الآلي مجهر مراقبة البرامج. 'حقن' ميكروبيبيتي طريق العودة إلى المخزن (أو ذكر) z-الموقف. القيام بهذا يدوياً مع جويستيك أو تلقائياً في حالة استخدام مرحلة مناور إلكترونية.
      ملاحظة: سوف بيرس النفط متوجا ميكروكابيلاري وتكون موجودة داخل جزء مائي الحبرية عنونة.
   9. الاستغناء عن الخلية في الحبرية عنونة استخدام في ميكروينجيكتور. سيتم زيادة حجم معالجة تجميعية nL سعته 10 بأقل من 1%.
   10. كرر 2.2.5-2.2.9 قطرات عنونة المتبقية تاركة بعض الخطوط لمراقبة التجريبية حيث قطرات عنونة لا يحتوي على خلية.
       ملاحظة: بديلاً أبسط لتحميل خلايا مفردة في عنونة قطرات باستخدام ميكروكابيلاري وميكرومانيبولاتور ليحل محل الحل في الخطوة 1.2.8 مع إيجاد حل للكشف عن الأجسام المضادة في 4% ببسا التي تحتوي على الخلايا بتركيز يقارب 10 ⁵ خلايا/مل، أي ما يعادل 1 خلية/10 nL. شغل خلية مفردة بويسونيان وتركيز الخلية سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل.
3. الخلايا ومجموعة الصور
   1. صورة الخلايا في قطرات استخدام الفحص المجهري برايتفيلد، بما في ذلك أي تصوير الأسفار.
      ملاحظة: التصوير يأخذ حوالي 3 دقائق صورة قطرات ~ 100 مجهر الآلي باستخدام. القيام بالتصوير مع غ 60 = 1.49 الغمر النفط الهدف. مطلوبة أية عوامل تصفية للتصوير برايتفيلد بينما تستخدم مجموعات التصفية القياسية لتصوير الأسفار.
   2. صورة جميع النقاط في الصفيف باستخدام جزيء واحد TIRF المجهري.
      ملاحظة: يتم استخدام إعدادات كما في الخطوة 2.3.1 مع TIRF متخصصة تصفية مجموعة. سيتم تحليل هذه الصور في وقت لاحق في القسم 3 لتحديد خلفية الجزيئات واحدة منضمة إلى كل بقعة جسم قبل تفسخ. تصوير جزيء واحد باستخدام الانعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية يأخذ حوالي 5 دقائق لصورة البقع ~ 100.
   3. وتركز على خلية في الحبرية سعته. تحقيق تحلل ضوئي كاملة بالتركيز 6 واحد ns ليزر النبض (طول موجي 1064 نانومتر، µJ ± 0.3 الطاقات 14.1 نبض كل نبض) القريبة من موقع الخلية.
      ملاحظة: نبض الليزر يضع فقاعة تكهف توسع أن المقصات الخلية وتحرر مكونات الخلوية في حجم قطره. ^{4 , 31} عدم الإزعاج العمليات الميكانيكية بسبب تحلل المستحثة بالليزر واجهة الزيت عن الماء في طاقات نبض منخفضة. تحلل ضوئي يستغرق عادة حوالي 20-30 دقيقة 100 خلية. كما تمت مناقشته في المقطع المناقشة، وهناك عدد من الطرق البديلة الخلايا المفردة إذا لم يكن ممكناً إعداد تحلل ضوئي.
   4. كرر كل قطرات عنونة الخلية التي تحتوي على ترك 5 مجاناً لعنصر التحكم التجريبية حيث قطرات عنونة يحتوي على خلية تابعة للأمم المتحدة.
   5. ملاحظة الوقت الذي هو تفكيك كل خلية.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذه الأوقات لتصحيح منحنيات الربط الفردي لكل بقعة في خطوة 3.1.9. غالباً ما يكون كافياً لملاحظة الأوقات عندما يتم تفكيك الخلايا الأولى والأخيرة وتقدير بقية افتراض وقت كاف متسقة بين أحداث تحلل.
   6. الحصول على الصور جزيء واحد باستخدام TIRF المجهري لجميع البقع كل 10 دقيقة لأول 30 دقيقة ثم كل 20 دقيقة لزيادة 60 دقيقة. إلا إذا كان مهتم كمية البروتين ملزمة في التوازن، صورة جميع البقع بعد حضانة شرائح لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الوقت للتوصل إلى توازن سيتوقف على حجم التجميعية والانتماءات من الأجسام المضادة التي تستخدم في الفحص. TIRF مجهرية تتم باستخدام ليزر مصدر إثارة في = 488 نانومتر و 1.5 ميغاواط السلطة كما يقاس في الفتحة الخلفية باستخدام مقياس طاقة ضوئية. الصور جزيء واحد يتم الحصول عليها عن طريق تحديد الإعدادات الحصول على الكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر إلى 900 مللي وقت الامتلاك، رقمنة 16 بت معدل قراءات 1 ميغاهرتز واكتساب م عامل قدرة 10. قد يعاد استخدامها في المعزل عن طريق إزالة بعناية ساترة.

3-بيانات التحليل

1. جزيء واحد العد (نظام غير مزدحمة/الرقمية)
   1. استخدام فيجي (أو Matlab)، لأي بقعة في جسم غير مزدحمة، تحميل الصورة المكتسبة قبل تحلل (الخلفية، بكد).
      ملاحظة: تجري العمليات في الخطوات التالية مستقيم باستخدام برمجيات تحليل الصورة في فيجي. يمكن الاطلاع على دليل مستخدم في https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html الرابط التالي.
   2. وفي فيجي، حدد الصورة بكد. ضمن القائمة "صورة" حدد "مكرر" إلى BKD مكررة. حدد صورة مكررة وضمن "عملية > عوامل التصفية"، حدد "التمويه الضبابي" وحدد نصف قطرها 50 بكسل.
   3. تسطيح الصورة BKD حيث أن هناك توزيعاً كثافة موحدة فعالة مصدر الضوء الإثارة بتقسيم الصورة بكد بالصورة بكد غير واضحة، وإنتاج BKD_FLAT.
      1. في إطار "عملية" حدد "صورة آلة حاسبة..."، وتحديد عملية "الفجوة"، والصور المطلوبة، وتحديد مربعات "إنشاء إطار جديد" و "نتيجة 32-بت (عدد عشري)".
   4. طرح كل بيكسل في الصورة 1 ("عملية > الرياضيات" وحدد "طرح..."، وحدد قيمة 1). كثافة بكسل المتوسط يجب أن تكون 0.
      ملاحظة: حقل التسوية وقد دققت الأرض خلفية الصور بسهولة حيث يجب أن يكون مجموع كل بكسل 0 ويمكن تعويضه أي إزاحة المتبقية أكثر مستقيم ل.
   5. حدد منطقة بكسل × 50 بكسل 50 في أي من 4 زوايا الصورة BKD_FLAT. قياس الانحراف المعياري بكثافة بكسل (σ) عن طريق تحديد "تحليل" و "التدبير".
      ملاحظة: سيقدم إحصاءات موجزة للتحديد في إطار نتائج. وهذا يحدد خلفية قبالة بقعة حيث هناك من غير المرجح أن تكون كثافة عالية من جزيئات مفردة. يجوز اختيار المنطقة لقياس يدوياً باستخدام أدوات التحديد الافتراضي القائمة أو عن طريق تشغيل الماكرو البرمجية "ماكيريكتانجلي (x، y، العرض، والارتفاع)"؛ يؤدي هذا إلى إنشاء شبكة تحديد مستطيلة، حيث x و y الحجج هي إحداثيات الزاوية العليا اليسرى (بالبكسل).
   6. تعيين العتبة الصورة إلى 3σ وخلق صورة ثنائي SM_MASK.
      1. تحت "الصورة > ضبط"، حدد "عتبة..."، وتعيين مستوى العتبة الدنيا إلى 3σ.
         ملاحظة: يتم تعيين القيمة التي أدنى من العتبة بكسل إلى الصفر وكسل تتجاوز العتبة تم تعيينها إلى 1. وستحدد العتبة الثقة التي تنتمي ثريشولديد بكسل لجزيء واحد.
   7. في صورة مجزأة SM_MASK، قيم الكثافة بكسل تعيين إلى الصفر أي الكائنات التي لم تقم حجم 4-9 بكسل² وتدوير من 0.5-1 عن طريق تحديد "تحليل" تليها "تحليل الجزيئات" وتحديد حجم والتدوير.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى حجم بكسل الأمثل لمجموعة أخرى فلوروفوريس ومجهر ups. بسبب نوع الضوضاء الكاميرا بكسل واحد قد يكون أعلى من هذا الحد ولم يتم إهمالها على الرغم من كونه لا جزيئات مفردة. سيتم تجاهل معيار حجم بكسل بشكل صحيح تلك بكسل. جزيئات وحيدة عموما الشكل الدائري. وتشير قيمة تدوير 1 إلى دائرة كاملة بينما تشير قيمة تقترب من 0 إلى شكل متزايد ممدود. الكائنات الباقية هي جزيئات مفردة وقد عدها. قد يتم تعيين قناع لترسيم منطقة بقعة للتمييز في مكان و قبالة بقعة تحسب لكل إطار. هذا أسهل للإطارات التي اكتسبت في وقت لاحق عندما يكون هناك إشارة كافية في الموقع التي يمكن تطبيقها ثم إلى إطارات سابقة.
   8. لنفس المكان جسم غير مزدحمة، تحميل، وكرر الخطوات 3.1.1-3.1.7 لكافة إطارات الصور القبض على سلسلة حل الوقت اكتسبت تحلل الوظيفة. استخدام الأوقات تحلل بتدوينه في الخطوة 2.3.5. لتصحيح أي منحنيات ملزمة.
2. جزيء واحد العد (نظام المزدحمة/تناظري)
   1. ولحساب متوسط كثافة جزيء واحد، قبل المضي قدما، كرر الخطوات 3.1.1-3.1.8.
   2. وتتكاثر الصور BKD_FLAT و SM_MASK لإنتاج صورة موجبة قيم غير الصفر بكسل ترتبط مع جزيئات مفردة.
      1. للقيام بذلك، ضمن القائمة "عملية"، حدد "صورة الحاسبة..."، عملية "ضرب" والصور المطلوبة، ثم حدد مربعات "إنشاء إطار جديد" و "نتيجة 32-بت (عدد عشري)".
   3. مجموع كافة قيم كثافة بكسل عن طريق تحديد "تحليل" و "قياس"؛ ثم سيقدم إحصاءات موجزة للتحديد في إطار نتائج. القسمة على عدد الجزيئات واحدة الأصوات التي تم فرزها حسب الخطوة 3.1.8 لحساب متوسط كثافة كل جزيء واحد.
   4. لأي جسم ازدحام المكان، تحميل تحلل ما بعد الصورة المكتسبة وتتسطح مع صورة خلفية واضحة وفقا للخطوات 3.1.2 و 3.1.3.
   5. طرح كل بيكسل في الصورة مسطح 1 ("عملية > الرياضيات" وحدد "طرح..."، وحدد قيمة 1)
   6. حدد منطقة بكسل × 50 بكسل 50 في أي من زوايا الصورة 4 وقياس الانحراف المعياري بكثافة بكسل (σ). راجع الخطوة 3.1.5 للحصول على التفاصيل.
   7. إنشاء قناع صورة ثنائية عن طريق تعيين عتبة الصورة إلى 3σ وتعيين قيم كثافة البيكسل إلى الصفر أي كائنات ذات حجم أقل من 4 بكسل². للقيام بذلك، ضمن القائمة "تحليل"، حدد "تحليل الجزيئات" وتحديد حجم والتدوير.
   8. ضرب صورة بقعة الأرض جسم المزدحمة بقناع الصورة الثنائية.
      1. للقيام بذلك، ضمن القائمة "عملية"، حدد "صورة الحاسبة..."، عملية "ضرب" والصور المطلوبة، ثم حدد مربعات "إنشاء إطار جديد" و "نتيجة 32-بت (عدد عشري)".
   9. مجموع كثافة بكسل المتبقية عن طريق تحديد "تحليل" تليها "تدبير"؛ سيقدم إحصاءات موجزة للتحديد في إطار نتائج.
   10. تقسيم مجموع كثافة بكسل بكثافة جزيء واحد متوسط لحساب عدد جزيئات واحدة ملزمة على الفور المزدحمة.
3. منحنى المعايرة للقياس الكمي المطلق
   1. كرر القسمين 1 و 2 لتشكيل 10 قطرات عنونة nL مع جسم الكشف في حل ببسا 4% ارتفعت مع بروتين تركيز معلوم المؤتلف.
   2. تنفيذ سلسلة تركيز 10²-10⁷ البروتينات المؤتلف كل قطره باختلاف تركيز المعروف من البروتين المؤتلف، إضافة إلى الحل. من المستحسن للعمل من حيث عدد البروتينات الواحدة الحبرية لجعل البيانات خلية مفردة معايرة مباشرة.
   3. استخدام تركيز سلسلة البيانات في الخطوة 3.3.2 لمعايرة أي جزيء واحد بحساب كل بقعة لوفرة البروتين الواحد الحبرية، ووفرة البروتين تمديد كل خلية مفردة.

النتائج

تم تحديد عدد نسخ البروتين القاعدي المطلقة p53 مع القرار خلية مفردة في القولون بشرية سرطان خلية خط، وتكون الخلايا. ونحن تثبت كيف يمكن أن تختلف على عدة أوامر من ضخامة التعبير p53 وتظهر علاقة إيجابية ضعيفة بين عدد نسخ البروتين وحجم الخلايا داخل السكان خلية يكون يستريح.

Discussion

عنونة الحبرية [ميكروارس] أسلوب الحساسة والقابلة للتوسعة لتحديد الكمية عدد النسخ المطلق للبروتين داخل خلية واحدة.

الحد من مستوى الربط غير محددة (أيضا) أمر بالغ الأهمية ضمن البروتوكول إلى تحقيق كانخفاض حد من الكشف عن قدر الإمكان. البروتينات وغيرها من الأنواع الكيميائية الحيو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Life Technologies	10010015
DMEM high glucose	Sigma	D6429
Foetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom	S0115
cell culture flasks	Corning	SIAL0639
Trypsin/EDTA	Biochrom	L2153
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microarray
Microcontact Arrayer	DigiLab, UK	OmniGrid Micro
Microcontact pin	ArrayIt, USA	946MP2
Coverslips (Nexterion)	Schott, Europe	1098523	Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibody	Enzo	ADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled	Santa Cruz	sc-126	stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate buffer	Gibco	15557-044
Betaine	Sigma	61962
Sodium dodecyl sulphate	Sigma	L3771
384 well plate (low volume)	Sigma	CLS4511
Nitrogen gas cylinder	BOC	Industrial grade, oxygen-free
Name	Company	Catalog Number	Comments
Droplets
Micromanipulator	Eppendorf	Patchman NP2
Manual Microinjector	Eppendorf	CellTram Vario
Micropipette	Origio, Denmark	MBB-FP-L-0
Syringe pumps	KD Scientific	KDS-210
100 μL syringe	Hamilton	81020	Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringe	Hamilton	81327	Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolator	Grace Bio-Labs	JTR24R-A-0.5	6x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutter	VersaLASE	VLS2.30 CO2 Laser 3W	for laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheet	Weatherall-UK	Clarex Precision Sheet 001	for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet	3M		used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glue	Loctite	LOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing	IDEX	FS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing	IDEX	1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing	Kinesis	008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing	IDEX	1673
Bovine Serum Albumen (BSA)	Fisher Scientific	BP9700100
Mineral oil	Sigma	M5904
Ultra-pure water	Millipore, Germany	MilliQ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stage	Nikon, Japan	Nikon Ti-E
EM-CCD	Andor Technologies, Ireland	IXON DU-897E
Laser excitation source	Vortran, USA	Stradus 488-50
Optical lysis laser source	Continuum, USA	Surelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRF	Chroma, USA	z488bp
Microscope filter cube for Optical Lysis	Laser 2000, UK	LPD01-532R-25
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Fiji	Open Source		Image analysis software
Matlab	Mathworks	version 7.14 or higher	Image analysis software