Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

Riepilogo

Qui presentiamo indirizzabile gocciolina microarrays (ADMs), un metodo di matrice basata gocciolina in grado di determinare l'abbondanza assoluta della proteina in cellule singole. Dimostriamo la capacità di ADMs per caratterizzare l'eterogeneità nell'espressione della proteina oncosoppressore p53 in una linea cellulare di cancro umano.

Abstract

Comportamento spesso cellulare e risposte cellulari vengono analizzate a livello di popolazione, dove le risposte di molte cellule sono raggruppate insieme come un risultato medio il comportamento ricco singola cella all'interno di una popolazione complessa di mascheramento. Tecnologie di rilevazione e quantificazione della proteina singola cella hanno avuto un impatto notevole negli ultimi anni. Qui descriviamo una piattaforma di analisi unicellulare pratico e flessibile basata su microarrays gocciolina indirizzabile. Questo studio descrive come i numeri di copia assoluta di proteine bersaglio possono essere misurati con risoluzione di singola cellula. L'oncosoppressore p53 è il gene più comunemente mutato nel cancro umano, con oltre il 50% dei casi di cancro totale che esibiscono un modello di espressione di p53 non sani. Il protocollo descrive la procedura per creare 10 gocce nL entro il quale le cellule tumorali umane singolo sono isolate e il numero di copie della proteina p53 è misurato con risoluzione di singola molecola per determinare con precisione la variabilità nell'espressione. Il metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula compreso il materiale primario per determinare il numero di copia assoluta di qualsiasi proteine bersaglio di interesse.

Introduzione

L'obiettivo di questo metodo è quello di determinare la variazione in abbondanza di una proteina dell'obiettivo in una popolazione di cellule con risoluzione di singola cellula. Analisi unicellulare fornisce una serie di vantaggi che non sono disponibili con metodi biochimici ensemble tradizionale. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} in primo luogo, lavorare a livello di singola cellula può catturare l'eterogeneità ricca di una popolazione di cellule che altrimenti andrebbero persi il calcolando che si verifica con tecniche biochimiche ensemble tradizionale. La maggior parte dei metodi biochimici cavallo di lavoro funziona con la maggior parte, che richiedono, come spesso fanno, milioni di cellule per produrre un risultato. Naturalmente, le conseguenze della valutazione popolazioni a cellula intera dipende da una serie di fattori, ad esempio, l'eterogeneità nell'espressione della proteina dove possono essere perso alcune caratteristiche importanti della distribuzione dell'abbondanza di proteine. Dal punto di vista pratico, la sensibilità necessaria delle tecniche di singola cellula li rendono in grado di lavorare con quantità di materiale biologico che è insufficiente per anche più sensibili tecniche di bulk funzionare. Un esempio chiave è lo studio dei tipi cellulari rari come fare circolare le cellule del tumore (CTCs) dove anche per i pazienti con una prospettiva prognostico difficile meno di 10 CTCs potrebbero essere presenti in un singolo 7,5 mL di sangue disegnare. ⁶ qui presentiamo la metodologia necessaria per eseguire misurazioni di proteina singola cella usando un volume ridotto dosaggio anticorpo-basato che impiegano le goccioline di olio-capped stampato su un microarray dell'anticorpo.

Microfluidica gocciolina piattaforme sono a resa elevata, in grado di generare migliaia di goccioline al secondo e in grado di isolare e persino la coltura, singole cellule in singole gocce per eseguire una vasta gamma di analisi biochimiche. Tecniche basate su goccia sono adatti per analisi unicellulare,^7,8,9 con notevoli esempi recenti tra cui DropSeq¹⁰ e inDrop¹¹, che sono state notevolmente favorite dalla potenza di tecniche di amplificazione. La quantità limitata di materiale e senza metodi di amplificazione per proteine rendono unicellulare proteomica particolarmente impegnativi.

Le goccioline possono essere analizzate da un certo numero di metodi e microscopia di fluorescenza è stato ampiamente utilizzata. Tecniche di singola molecola come microscopia di fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale permette di molecole fluorescenti essere visualizzato con impareggiabile rapporto segnale-rumore. ¹² a causa del decadimento esponenziale del campo evanescente, solo fluorofori in alta vicinanza alla superficie (ordine di 100nm) sono eccitati rendendo TIRF una buona strategia nella rilevazione di piccole quantità di una molecola di target in una miscela complessa. La forza intrinseca di sezionamento ottica di TIRF aiuta anche ad per evitare fasi di lavaggio e limiti di analisi tempi e la complessità. Tuttavia, TIRF richiede superfici planari ed esempi di microscopia TIRF applicato a goccioline nel flusso comportano la formazione di una superficie planare di cui all'immagine. ¹³ a tal fine, tecniche di proteomica di singola cellula spesso progettare chip microfluidici intorno agenti di superficie-immobilizzata cattura in un formato di microarray. ^{4 , 14}

Le goccioline, essi stessi, possono essere formate in matrici su superfici planari, cosiddetto gocciolina microarrays. ^{15 , 16 , 17} organizzare spazialmente goccioline in matrici permette loro di essere convenientemente indicizzati, facilmente monitorati nel tempo, singolarmente indirizzati e, se necessario, Estratto. Gocciolina microarrays può raggiungere un'alta densità di micro-reattori con migliaia di elementi per ogni chip che sono supportati da strutture microtiter o autoportante. ^{18 , 19 , 20} può essere costituiti da deposizione sequenziale da robot di manipolazione dei liquidi, spotters a getto d'inchiostro, contattare microarrayers^{21,22,23,24,25, 26} , o essi possono assemblarsi su superfici come superhydrophillic macchie modellato su una superficie superidrofobiche. ^{27 , 28 , 29}

Con queste considerazioni in mente, indirizzabile gocciolina Microarrays (ADMs) sono stati progettati per combinare la versatilità, spaziale indirizzabilità e volumi ridotti di microarrays di goccia con la sensibilità di microscopia TIRF di singola molecola per quantitativamente misurare l'abbondanza di proteine. ⁵ ADMs abilitare analisi unicellulare formando un gocciolina microarray contenente cellule singole sopra un microarray dell'anticorpo, che è stato limitato con olio per evitare l'evaporazione. I volumi delle goccioline sono discreti per prevenire la perdita di campione, che altrimenti si otterrebbe con il chip valvole a flusso continuo microfluidica. ³⁰ la quantità assoluta di proteina bersaglio da una singola cellula è estremamente piccola; Tuttavia, il volume ridotto delle goccioline consente relativamente alta concentrazione locale in modo che essi vengono rilevati usando un'analisi di anticorpo panino - anticorpo è immobilizzato in una distinta regione, o spot, su una superficie che cattura la proteina che a sua volta lega per un anticorpo di rilevazione fluorescente etichettati presente nel volume delle gocce. Come un approccio privo di etichetta (cioè proteina gli obiettivi non devono essere etichettati direttamente), sono generalmente applicabili all'analisi di cellule da fonti primarie, come sangue trasformati ADMs, bene bisogno aspira e le biopsie del tumore dissociata, come pure le cellule dalla cultura e loro lisati.

Misura la variazione in abbondanza di proteine attraverso una popolazione delle cellule è importante nel determinare l'eterogeneità nella risposta, ad esempio, ad una droga e contribuirà a fornire approfondimenti funzioni cellulari e percorsi, valutazione sottopopolazioni e loro comportamento così come identificare eventi rari che altrimenti sarebbero mascherati da metodi di massa. Questo protocollo descrive come produrre e utilizzare indirizzabile gocciolina microarrays per determinare quantitativamente l'abbondanza del fattore trascrizione p53 in cellule tumorali umane e può essere usato per studiare il ruolo di p53 nella risposta ai farmaci chemioterapici. La proteina dell'obiettivo è determinata dalla scelta di acquisizione e rilevamento di anticorpi e può essere modificata per includere ulteriori o diverse destinazioni. Vengono fornite istruzioni per costruire un semplice apparato che incorporano un ugello concentrico da consumabili di laboratorio generali a 10 gocce di nL ricoperti con olio di matrice manualmente. Il processo completo sperimentale è descritto per cui ciascuna gocciolina viene quindi caricato con una singola cella, che è poi lisata e l'espressione della proteina determinata con risoluzione di singola molecola usando la microscopia TIRF.

Protocollo

1. preparazione

1. Rendere il chip e stampa anticorpo microarrays
   1. Allegare un isolatore di adesivo in silicone/acrilico per un vetrino coprioggetti funzionalizzato per supportare un microarray dell'anticorpo. Questa è detta il chip.
      Nota: Vari processi chimici superficiali sono stati testati per la loro idoneità con le goccioline di indirizzabile. ⁵ composizioni chimiche di superficie potrebbero essere necessario essere ottimizzato per gli agenti alternativi cattura. Isolatori ADM sono commercialmente disponibili o potrebbero essere prodotte da acrilico di taglio del laser (CAD file per isolatore utilizzato in questo lavoro è fornito come download; vedere il File di codice supplementare).
   2. Accendere il microarrayer e impostare l'umidità al 75%.
      Nota: umidità relativa riduce l'evaporazione della soluzione di stampa dal perno di microarray e variazione intra - e inter - spot.
   3. Pulire il perno di microarray nella pulizia soluzione per 5 min di sonicazione dei piedini. Sciacquare il perno con acqua ultra-pura utilizzando una spruzzetta ed asciugare utilizzando l'azoto.
      Nota: Sospendere il pin per quanto riguarda solo immergere la punta del perno. Un vetrino da microscopio con un gruppo opportunamente forato di fori aiuterà se un titolare di pin non può essere ottenuto.
   4. Fare 5 mL di buffer di stampa è composto da 3 × buffer di salino-sodio citrato (SSC), 1.5 M betaina completata con 0,01% sodio dodecil solfato (SDS). Conservare a 4 ° C a tempo indeterminato.
   5. Per preparare una soluzione di stampa, disgelo dell'anticorpo anti-p53 (p53/Mdm2 ELISA kit; veda la tabella materiali) aliquote conservate a-80 ° C. Mescolare 1:1 con buffer di stampa a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL. Carico: 5-10 µ l di soluzione di stampa in un 384 pozzetti con una micropipetta e posto nella microarrayer.
   6. Caricare il chip montato al punto 1.1.1 nella microarrayer. Programma microarrayer per stampare macchie alle coordinate definite al centro di ciascun pozzetto dell'isolatore.
      Nota: Microarrayers impiegare una gamma di, principalmente, software proprietario e così il lettore è incoraggiato a consultare la letteratura relativa. Il microarray necessario per l'isolatore ADM presenti nel file CAD associato al punto 1.1.1 è composto da elementi a sezione rettangolare; le distanze rilevanti sono fornite.
   7. Memorizzare i chip in contenitori chiusi ermeticamente e avvolgere con un foglio. Conservare a 4 ° C a 6 settimane.
      Nota: La pellicola è di impedire qualsiasi foto-danno. Conservazione a 4 ° C limita il tasso di degradazione di biomolecole ed eventuali reazioni deleterie che possono agire per ridurre l'attività di microarray. Un contenitore ermetico permette chip stabilizzare a temperatura ambiente prima dell'uso senza condensa formando sulla superficie del chip. Stampa contatto microarray sfrutta la tensione superficiale e adesione tra la soluzione di stampa e lo stampa substrato per produrre macchie. Pre-stampa o macchiare è normalmente necessario per rimuovere la soluzione in eccesso dal perno di microarray per produrre macchie uniformemente dimensioni. Non gettare il coprioggetto di pre-stampa sacrificale poiché può essere utilizzato per valutare la qualità del lotto.
2. Preparare le siringhe, concentrico e tubo ugello per l'erogazione di goccioline indirizzabile
   1. Smontare 100 µ l (per la gocciolina acquosa) e Hamilton siringhe di vetro da 1 mL (per la tappatura olio) e sciacquare le parti con acqua distillata H₂O.
   2. Nutrire una lunghezza di 100 mm di 150 µm ID/360 µm OD fuso tubo di silice attraverso una lunghezza di 40 mm di 1,0 mm ID/1/16 "tubazione di PFA OD fino a quando si sporge di 2 mm. Questo formerà l'ugello concentrico.
   3. Applicare un sottile strato di colla del cianoacrilato all'estremità della punta di una pipetta di 10 µ l e inserire il pezzo di 40 mm di 1,0 mm ID/1/16 "la tubazione di PFA OD. Se necessario, riposizionare il tubo di silice fusa per mantenere una protrusione di 2mm all'ugello prima i set di adesivi.
   4. Inserire l'altra estremità del capillare in silice fusa nell'estremità di una lunghezza di 200 mm di 0,014" ID/0,062" OD tubi in PTFE e collegarlo a un 100 µ l Hamilton siringa riempita con 4% albumina di siero bovino (BSA) in tampone fosfato salino (PBS) (PBSA).
      Nota: Proteine e altre specie biochimiche non specifico può associare alle superfici e può essere perso o denaturato. BSA è utilizzato per 'bloccare' superfici per minimizzare il legame non specifico legandosi con sacrificio a tali superfici.
   5. Inserire una punta di pipetta 200 µ l una lunghezza di 400 mm di Tubo FEP OD 1,0 mm ID/2.0 mm fino a formare un sigillo. Applicare un sottile strato di colla del cianoacrilato di un'altra pipetta 200 µ l e questo spingere la punta prima di fissare il tubo al suo posto. Collegare l'estremità aperta del tubo di FEP OD 1,0 mm ID/2.0 mm a un 1 mL siringa Hamilton riempita con olio minerale.
   6. Inserire il gruppo di punta di 200 µ l pipetta nella punta della pipetta 10 µ l dell'ugello concentrico. Posizionare le siringhe in pompe a siringa separata come avranno bisogno di essere gestito in modo indipendente.
   7. Riempire la siringa di 100 µ l con soluzione bloccante PBSA di 4%. Ricollegare e svuotare il tubo 'acquoso' con la soluzione bloccante. Ripetere due volte per un totale di 3 scale.
   8. Riempire la siringa di 100 µ l con anticorpo di rilevazione 0,125^-1 µ g mL (anticorpo anti-p53 (DO-1) etichettato con Alexa 488) in 4% PBSA e ri-collegare tubi. Sostituire la soluzione bloccante in tubi di erogazione 25 µ l rilevazione dell'anticorpo di soluzione.
   9. Sciacquare il tubo 'olio' con olio minerale fino a quando tutte le tubazioni e l'ugello si riempie di olio. Riempire la siringa da 1 mL con olio minerale e ri-collegare il tubo. Fissare il tubo e ugello di un manipolatore XYZ.
3. Preparare microinjector e micromanipolatore
   Nota: La procedura riportata di seguito fanno specifico riferimento ai componenti della microinjector e Apparato micromanipolatore specificato nella tabella materiali, ma è generalmente applicabile a qualsiasi tali apparecchi.
   1. Montare il microinjector la tubazione di pressione e titolare del capillare.
   2. Ruotare lentamente la manopola del pistone fino a quando l'olio minerale riempie completamente la linea.
   3. Montare il supporto capillare nell'apposito attacco testa di traduzione.
   4. Difficoltà capillare nel supporto capillare con la testa di presa.
   5. Dispensare una soluzione del 4% PBSA in uno dei pozzi dell'isolatore.
   6. Tradurre utilizzando il micromanipolatore e immergere la punta del capillare nella soluzione.
   7. Riempire lentamente il capillare con 4% PBSA e lasciare per bloccare per 10 min.
   8. Espellere il microcapillary e girevole modulo di traduzione in modo che l'assembly è chiaro del chip.

2. formare goccioline indirizzabile e carico con singole cellule

1. Formare goccioline indirizzabile
   1. Fissare il chip sulla fase di microscopio.
      Nota: Il microscopio è una fluorescenza invertita microscopio automatizzato capace di singola molecola TIRF dotato di un uno stadio XY codificato e un elettrone moltiplicando fotocamera charge coupled device (EM-CCD).
   2. Registrare le coordinate di fase di microscopio di ogni spot nella matrice utilizzando il software di controllo automatizzato microscopio.
   3. Impostare il manipolatore XYZ il tavolino del microscopio. Posizionare l'ugello ad un angolo di 50-60°. Assicurarsi che l'ugello sia sufficiente lunghezza e lo spazio per raggiungere il chip. Set 'acquoso' e 'olio' siringa pompe per dispensare 10 nL a 100 µ l/min e 5 µ l a 100 µ l/min, rispettivamente.
      Nota: Durante la preparazione, la soluzione acquosa alla testa dell'ugello può asciugare.
   4. Erogare la soluzione acquosa finché una goccia di liquido è visibile la testa dell'ugello. Tamponare con un panno libero da polvere per rimuoverlo.
      Nota: A seconda del numero delle condizioni sotto inchiesta, riserva un numero di pozzi per servire come serbatoi per le cellule. Per una singola cella/tipo di linea è sufficiente un singolo serbatoio.
   5. Utilizzando il software di controllo automatizzato microscopio, impostare le coordinate di fase microscopio in un punto dell'anticorpo nella matrice e messa a fuoco sulla superficie del vetrino coprioggetti.
   6. Attenzione a non disturbare il punto, utilizzando il manipolatore XYZ, allineare la punta capillare di vetro dell'ugello concentrico al lato dello spot dell'anticorpo e dispensare 10 nL di soluzione acquosa. Senza spostare le fasi, pipettare 5 µ l di olio per la soluzione acquosa di cap. Lentamente sollevare l'ugello chiaro della goccia e passare al successivo bene.
   7. Ripetere il passaggio 2.1.6 per tutti i punti dell'anticorpo nella matrice.
   8. Dopo 30 min, immagine tutti i punti della matrice utilizzando il software di controllo automatizzato microscopio per determinare lo sfondo di una singola molecola associato a ogni anticorpo spot prima celle di carico.
2. Goccioline indirizzabile con celle di carico
   1. Rimuovere i matracci di cultura cellulare dall'incubatrice e staccare le cellule con tripsina/EDTA soluzione.
      Nota: In questo studio, la linea BE umana del colon carcinoma delle cellule è stata utilizzata e coltivate utilizzando per volta Eagles Medium (DMEM di Dulbecco) completati con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS) in incubatore a CO₂ .
   2. Se necessario, macchia fluorescente di cellule.
      1. Risospendere le cellule in una soluzione di anticorpo di rilevazione 0,125 μg/mL (anticorpo anti-p53 (DO-1) etichettato con Alexa 488) in 10% FBS in media L-15. Per garantire una sospensione unicellulare, filtrare la soluzione di cella attraverso un colino di cella passo 40 µm.
   3. Contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire o concentrare la soluzione di cella a una concentrazione di 25-400 × 10³ cellule/mL. In questo modo quel sedimento di cellule con spaziatura sufficiente per manipolare comodamente il microcapillary.
   4. Singole celle di carico in goccioline indirizzabile dal bacino cella utilizzando il micromanipolatore e microcapillary.
      Nota: Le celle Non-aderenti possono essere caricate alla rinfusa nella micropipetta e dispensati uno in goccioline indirizzabile. Malgrado il trattamento superficiale di blocco, cellulari aderenti tenderà a non specifico attaccare alla parete interna di vetro microcapillary e perdersi.
   5. Utilizzando un obiettivo × 10 per osservare, utilizzare il microinjector per aspirare una singola cella in microcapillary dal bacino delle cellule.
   6. Memorizzare le coordinate di fase micromanipolatore se utilizza una fase manipolatore elettronico o manuale si noti la posizione z.
   7. Retrarre la micropipetta traslandolo verso l'alto per deselezionare l'altezza di 1 mm del chip. Eseguire questa operazione manualmente con un joystick o automaticamente utilizzando la funzionalità di 'Eject' di una fase di manipolatore elettronico.
   8. Insieme che la fase coordinate a che di una gocciolina indirizzabile usando microscopio controllo software automatizzato. 'Iniettare' la micropipetta riportandolo alla posizione z stored (o nota). Eseguire questa operazione manualmente con un joystick o automaticamente se si utilizza una fase manipolatore elettronico.
      Nota: Il microcapillary sarà perforare l'olio tappatura e trovarsi all'interno della parte acquosa della goccia indirizzabile.
   9. Dispensare la cella nella gocciolina indirizzabile utilizzando il microinjector. Il volume di una goccia di indirizzabile nL 10 aumenta da meno dell'1%.
   10. Ripetere 2.2.5-2.2.9 per le restanti goccioline indirizzabile lasciando alcuni gratuiti per il controllo sperimentale dove indirizzabile goccioline non contengono una cella.
       Nota: Un'alternativa più semplice per singole celle di carico in goccioline indirizzabili utilizzando un microcapillary e micromanipolatore consiste nel sostituire la soluzione nel passaggio 1.2.8 con una soluzione di anticorpo di rilevazione in cellule contenenti PBSA di 4% ad una concentrazione dell'ordine di 10 ⁵ cellule/mL, equivalente a 1 cella/10 nL. Occupazione singola cella sarà Poissoniano e concentrazione delle cellule avrà bisogno di essere ottimizzato.
3. Lisare le cellule e la matrice dell'immagine
   1. Celle di immagine nelle goccioline usando la microscopia in campo chiaro, compreso qualsiasi formazione immagine di fluorescenza.
      Nota: Imaging prende circa 3 min a goccioline di ~ 100 utilizzando un microscopio automatizzato di immagine. Eseguire imaging con un NA 60 = 1.49 obiettivo a immersione in olio. Non sono necessari filtri per campo chiaro imaging mentre set di filtri standard sono utilizzati per l'imaging di fluorescenza.
   2. Tutti i punti della matrice utilizzando la microscopia a singola molecola TIRF di immagine.
      Nota: Le impostazioni vengono utilizzate come nel passaggio 2.3.1 con un TIRF specializzati filtrare insieme. Queste immagini saranno successivamente analizzate nella sezione 3 per determinare lo sfondo di una singola molecola associato a ogni spot di anticorpo prima della lisi. Formazione immagine di singola molecola usando la microscopia a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale dura circa 5 min all'immagine ~ 100 punti.
   3. Concentrarsi su una cella in una gocciolina indirizzabile. Raggiungere lisi completa di ottica di messa a fuoco un singolo 6 ns laser di impulso (lunghezza d'onda 1064 nm, impulso energie 14,1 ± 0,3 µ j per impulso) vicino alla posizione della cella.
      Nota: L'impulso laser imposta un'espansione della bolla di cavitazione che cesoie la cella e libera costituenti cellulari nel volume delle gocce. ^{4 , 31} le lavorazioni meccaniche a causa di lisi indotta da laser non disturbare l'interfaccia acqua-olio a energie di impulsi a bassa. Lisi ottico richiede in genere circa 20-30 min a lisare 100 cellule. Come discusso nella sezione discussione, ci sono un numero di metodi alternativi per lisare cellule singole se ottico lisi di installazione non sono possibile.
   4. Ripetere per tutte le celle contenenti indirizzabile goccioline lasciando 5 gratis per il controllo sperimentale dove indirizzabile goccioline contengono un ONU-lisato cellulare.
   5. Si noti che il tempo in cui ogni cella è lisata.
      Nota: Questi tempi verranno essere utilizzati per correggere le curve di associazione individuale per ogni spot nel passaggio 3.1.9. Spesso è sufficiente notare i tempi quando il prime e l'ultima le cellule vengono lisate e stimano il resto assumendo una volta adeguatamente coerenza tra gli eventi di lisi.
   6. Acquisire immagini di singola molecola usando la microscopia TIRF di tutti punti ogni 10 min per i primi 30 min quindi ogni 20 min per ulteriori 60 minuti. Se interessato nella quantità di proteina legata all'equilibrio, solo immagine tutte le macchie dopo incubazione il chip per 90 min a temperatura ambiente.
      Nota: Il tempo per raggiungere l'equilibrio dipenderà il volume delle gocce e le affinità degli anticorpi utilizzati nel test. Microscopia TIRF viene eseguita utilizzando una sorgente di eccitazione laser presso = 488 nm e 1,5 mW di potenza misurata l'apertura posteriore utilizzando un misuratore di potenza ottica. Immagini di singola molecola vengono acquisiti impostando le impostazioni di acquisizione della fotocamera di EM-CCD per 900 ms tempo di acquisizione, digitalizzazione di 16-bit a velocità di lettura di 1 MHz e fattore di 10 di guadagno di un EM. L'isolatore può essere riutilizzato rimuovendo accuratamente il vetrino coprioggetto.

3. analisi dei dati

1. Singola molecola contando (regime di non-congestionata/digitale)
   1. Utilizzando Fiji (o Matlab), per qualsiasi località di anticorpo non congestionato, caricare l'immagine acquisita prima di lisi (sfondo, BKD).
      Nota: Le operazioni nei passaggi seguenti vengono eseguite semplicemente utilizzando software di analisi di immagine Fiji. Una guida per l'utente può essere trovato presso il seguente link https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html.
   2. Nelle Isole Figi, selezionare l'immagine BKD. Sotto il menu "Immagine" selezionare "Duplicate" a BKD duplicati. Selezionare l'immagine duplicata e sotto il "processo > filtri", selezionare "Gaussian Blur" e specificare un raggio di 50 pixel.
   3. Appiattire l'immagine BKD affinché ci sia una distribuzione efficace intensità uniforme della sorgente luminosa di eccitazione dividendo l'immagine BKD dall'immagine sfocata di BKD, producendo BKD_FLAT.
      1. Sotto "Processo" selezionare "immagine calcolatrice...", specifica l'operazione di "Divisione", le immagini necessarie e selezionando le caselle "Crea nuova finestra" e "32-bit (float) risultato."
   4. Sottrarre ogni pixel nell'immagine di 1 ("processo > Math", selezionare "Sottrarre..." e specificare un valore pari a 1). L'intensità di pixel medi deve essere 0.
      Nota: Campo appiattimento e immagini di sfondo appiattito possono essere controllate facilmente poiché la somma di tutti i pixel dovrebbe essere 0 e qualsiasi offset rimanenti possono essere più semplicemente state compensate.
   5. Selezionare un'area di 50 pixel × 50 pixel in uno dei 4 angoli dell'immagine BKD_FLAT. Misurare la deviazione standard di intensità pixel (σ) selezionando "Analizza" e "Misura".
      Nota: Le statistiche riassuntive della selezione verranno presentate in una finestra di risultati. Questo determina priorità bassa fuori posto dove c'è improbabile da essere un'alta densità di singole molecole. L'area da misurare può essere selezionata manualmente utilizzando gli strumenti di selezione di menu predefinito o eseguendo la macro codice "makeRectangle (x, y, width, height)"; Questo crea una selezione rettangolare, dove x e y sono argomenti le coordinate (in pixel) dell'angolo superiore sinistro.
   6. Impostare la soglia di immagine su 3 σ e creare un'immagine binaria SM_MASK.
      1. Sotto "Immagine > regolare", selezionare "Soglia..." e impostare il livello di soglia inferiore a 3 σ.
         Nota: Il cui valore sono sotto la soglia di pixel vengono impostati su zero e pixel che eccedono la soglia vengono impostati su 1. La soglia determinerà la fiducia con cui pixel con soglia appartengono a una singola molecola.
   7. Nell'immagine segmentata SM_MASK, valori di intensità di pixel set a zero di tutti gli oggetti che non hanno una dimensione di 4-9 pixel² e una circolarità di 0,5 - 1 selezionando "Analizzare" seguita da "Analizzare particelle" e specificare la dimensione e la circolarità.
      Nota: Le dimensioni dei pixel potrebbe essere necessario essere ottimizzato per altri fluorofori e microscopio set up. A causa del tipo di rumore fotocamera pixel singolo può essere superiore a questa soglia e non essere scartato pur non essendo singole molecole. Il criterio di dimensione pixel scarterà correttamente tali pixel. Singole molecole sono generalmente di forma circolare. Circolarità il valore 1 indica un cerchio perfetto, considerando che il valore si avvicina a 0 indica una forma sempre più allungata. Gli oggetti rimanenti sono singole molecole e possono essere contati. Una maschera può essere impostata per delimitare l'area della macchia per discriminare in loco e fuori posto conta per ogni frame. Questo è più facile per i frame acquisiti ai tempi più tardi quando c'è un segnale sufficiente in loco che può quindi essere applicato ai fotogrammi precedenti.
   8. Per nello stesso punto dell'anticorpo non congestionato, carico e ripetere i passaggi 3.1.1 - 3.1.7 per tutte le cornici immagine catturata come una serie di risolta nel tempo acquisito post lisi. Utilizzare i tempi di lisi annotati al punto 2.3.5. per correggere eventuali curve di associazione.
2. Singola molecola contando (regime di congestionato/analogico)
   1. Al fine di calcolare l'intensità media di una singola molecola, prima di procedere, ripetere i passaggi 3.1.1 - 3.1.8.
   2. Moltiplicare le immagini BKD_FLAT e SM_MASK per produrre un'immagine per cui i valori dei pixel diverso da zero sono associati a singole molecole.
      1. Per eseguire questo, sotto il menu "Processo", selezionare "Immagine calcolatrice...", specificare l'operazione «Moltiplica» e le immagini necessarie e selezionare le caselle "Crea nuova finestra" e "32-bit (float) risultato."
   3. Sommare tutti i valori di intensità di pixel selezionando "Analizza" e poi "Misura"; le statistiche riassuntive della selezione saranno presentate in una finestra di risultati. Dividere per il numero di molecole conteggiate singole secondo passaggio 3.1.8 per calcolare l'intensità media per singola molecola.
   4. Per qualsiasi posto l'anticorpo congestionata, caricare la post-Lisi immagine acquisita e appiattire con un'immagine di sfondo sfocato come per punti 3.1.2 e 3.1.3.
   5. Sottrarre ogni pixel nell'immagine appiattita da 1 ("processo > Math", selezionare "Sottrarre..." e specificare un valore di 1)
   6. Selezionare un'area di 50 pixel × 50 pixel in uno dei 4 angoli dell'immagine e misurare la deviazione standard di intensità pixel (σ). Vedere il punto 3.1.5 per dettagli.
   7. Creare una maschera di immagine binaria impostando la soglia di immagine a 3 σ e impostare i valori di intensità di pixel a zero di tutti gli oggetti con dimensioni inferiori a 4 pixel². Per eseguire questo, sotto il menu "Analizza", selezionare "Analizzare particelle" e specificare la dimensione e la circolarità.
   8. Moltiplicare l'immagine spot appiattito anticorpo congestionato per la maschera di immagine binaria.
      1. Per eseguire questo, sotto il menu "Processo", selezionare "Immagine calcolatrice...", specificare l'operazione «Moltiplica» e le immagini necessarie e selezionare le caselle "Crea nuova finestra" e "32-bit (float) risultato."
   9. Somma delle intensità pixel rimanenti selezionando "Analizzare" seguita da "Misura"; le statistiche riassuntive della selezione saranno presentate in una finestra di risultati.
   10. Dividere la somma delle intensità di pixel dall'intensità media singola molecola per calcolare il numero di singole molecole associato a posto congestionato.
3. Curva di taratura per quantificazione assoluta
   1. Ripetere i punti 1 e 2 per formare 10 goccioline indirizzabile nL con l'anticorpo di rilevazione in soluzione al 4% PBSA addizionati con una proteina ricombinante di concentrazione nota.
   2. Eseguire una serie di concentrazioni di 10²- 10⁷ proteine ricombinanti per goccia variando la concentrazione nota di proteina ricombinante aggiunta alla soluzione. Si consiglia di lavorare in termini di numero di proteine per goccia per rendere semplice calibrazione singola cella dati.
   3. Utilizzare la serie di concentrazione dati nel passaggio 3.3.2 per calibrare ogni singola molecola contano per ogni posto per abbondanza di proteina per goccia e dall'abbondanza di proteina di estensione per ogni singola cella.

Risultati

Il numero di copia assoluta basale della proteina di p53 è stato determinato con risoluzione singola cella in una linea cellulare di cancro del colon umano, le cellule BE. Dimostriamo come espressione di p53 può variare nel corso di diversi ordini di grandezza e mostrano una correlazione positiva debolmente tra numero di copia dimensioni e proteina delle cellule all'interno della popolazione di cellule BE riposo.

Indirizzabile...

Discussione

Indirizzabile gocciolina Microarrays sono un metodo sensibile ed estensibile per determinare quantitativamente il numero assoluto di copia della proteina all'interno di una singola cella.

Limitare il livello di legame aspecifico (NSB) è critico all'interno del protocollo al raggiungimento di un limite di rilevazione possibile come basso. Proteine e altre specie biochimiche non specifico può associare a un numero di interfacce presenti all'interno le goccioline — la superficie del vetrino c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Life Technologies	10010015
DMEM high glucose	Sigma	D6429
Foetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom	S0115
cell culture flasks	Corning	SIAL0639
Trypsin/EDTA	Biochrom	L2153
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microarray
Microcontact Arrayer	DigiLab, UK	OmniGrid Micro
Microcontact pin	ArrayIt, USA	946MP2
Coverslips (Nexterion)	Schott, Europe	1098523	Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibody	Enzo	ADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled	Santa Cruz	sc-126	stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate buffer	Gibco	15557-044
Betaine	Sigma	61962
Sodium dodecyl sulphate	Sigma	L3771
384 well plate (low volume)	Sigma	CLS4511
Nitrogen gas cylinder	BOC	Industrial grade, oxygen-free
Name	Company	Catalog Number	Comments
Droplets
Micromanipulator	Eppendorf	Patchman NP2
Manual Microinjector	Eppendorf	CellTram Vario
Micropipette	Origio, Denmark	MBB-FP-L-0
Syringe pumps	KD Scientific	KDS-210
100 μL syringe	Hamilton	81020	Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringe	Hamilton	81327	Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolator	Grace Bio-Labs	JTR24R-A-0.5	6x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutter	VersaLASE	VLS2.30 CO2 Laser 3W	for laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheet	Weatherall-UK	Clarex Precision Sheet 001	for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet	3M		used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glue	Loctite	LOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing	IDEX	FS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing	IDEX	1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing	Kinesis	008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing	IDEX	1673
Bovine Serum Albumen (BSA)	Fisher Scientific	BP9700100
Mineral oil	Sigma	M5904
Ultra-pure water	Millipore, Germany	MilliQ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stage	Nikon, Japan	Nikon Ti-E
EM-CCD	Andor Technologies, Ireland	IXON DU-897E
Laser excitation source	Vortran, USA	Stradus 488-50
Optical lysis laser source	Continuum, USA	Surelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRF	Chroma, USA	z488bp
Microscope filter cube for Optical Lysis	Laser 2000, UK	LPD01-532R-25
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Fiji	Open Source		Image analysis software
Matlab	Mathworks	version 7.14 or higher	Image analysis software