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요약

여기 선물이 주소 드롭릿 microarrays (Adm), 작은 물방울 배열 기반 메서드 단일 셀에 절대 단백질 풍부를 확인할 수 있습니다. Adm의 기능 인간 암 세포 선에서 종양 억제기 단백질 p53의 표현에이 특성을 설명 합니다.

초록

종종 세포 행동 및 세포질 응답 마스킹 복잡 한 인구 내의 풍부한 단일 셀 동작 결과 평균으로 많은 세포의 반응을 함께 풀링된는 인구 수준에서 분석 된다. 단일 셀 단백질 검출 및 정량화 기술 최근 몇 년 동안에 주목할 만한 영향을 만들었습니다. 여기는 주소 드롭릿 microarrays는 실용적이 고 유연한 단일 세포 분석 플랫폼에 설명 합니다. 이 연구는 단일 셀 해상도 대상 단백질의 절대 복사 번호 수 있습니다 측정 하는 방법을 설명 합니다. 종양 억제기 p53 아닌 건강 한 p53 식 패턴을 전시 총 경우의 50% 이상으로 인간의 암에 가장 일반적으로 돌연변이 유전자입니다. 프로토콜을 식에 변화를 정확 하 게 결정을 단일 분자 해상도 10 nL 방울은 단일 인간의 암 세포는 격리 하 고 p53 단백질의 복사본 수를 측정 만드는 단계를 설명 합니다. 에 모든 셀 형식을 기본 자료를 포함 하 여 관심사의 어떤 대상 단백질의 절대 복사본 수를 결정 하는 메서드를 적용할 수 있습니다.

서문

이 방법의 목표는 단일 셀 해상도 세포 인구에서 대상 단백질의 풍부에 있는 변화를 결정 하는. 단일 세포 분석은 전통적인 앙상블 생 화 확 적인 방법으로 사용할 수 없는 혜택을 제공 합니다. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 첫째, 단일 셀 수준 작업 전통 앙상블 생 화 확 적인 기술로 발생 하 셀 인구는 평균에 의해 그렇지 않으면 손실 될 것 이라고 그의 풍부한이 캡처할 수 있습니다. 대부분 작업 말 생 화 확 적인 방법의 사용 대량, 요구, 그들은 종종 할 때, 결과 생산 하는 세포의 수백만. 물론, 전체 세포 인구를 평가의 결과에 따라 다릅니다 여러 가지 요인, 예를 들어 단백질 식 단백질 풍부의 분포의 몇 가지 중요 한 기능을 놓칠 수 있습니다에서. 실용적인 관점에서 단일 셀 기술의 필요한 감도 있도록 생물 소재도 기능에 더 민감한 대량 기술에 대 한 충분 하지 않은 양의 작업 가능. 이것의 핵심 예제 희귀 한 종류의 세포 등 순환 종양 세포 (CTCs) 어디 그릴 10 CTCs 단일 7.5 mL 혈액에 존재 수도 보다도 가난한 전조 outlook 환자에 대 한 연구 이다. 6 여기 우리 항 체 microarray에 인쇄 된 항 체 기반 분석 결과 기름 덮인 방울 고용 감소 볼륨을 사용 하 여 단일 셀 단백질 측정을 수행 하는 데 필요한 방법론을 제시.

미세 물방울 플랫폼은 높은 처리량, 다양 한 생 화 확 적인 분석 실험을 수행 하기 위해 개별 방울에서 두 번째, 및 격리, 그리고 심지어 경작, 단일 셀 수 있는 방울의 수천을 생성할 수 있습니다. 드롭릿 기반 기술을 단일 세포 분석, 크게의 힘에 의해 주 었는 DropSeq10 와 inDrop11를 포함 하 여 주목할 만한 최근의 예제와 함께7,,89 증폭 기술입니다. 제한 된 양의 재료와 단백질에 대 한 증폭의 아무 방법 단일 셀 proteomics 특히 어려운 게.

방울 다양 한 방법으로 분석할 수 있습니다 그리고 형광 현미경 검사 법은 널리 사용 되 고 있다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 같은 단일 분자 기술을 형광 분자를를 탁월한 신호 대 잡음 비율을 시각화할 수 있습니다. 12 사라져 필드의 지 수 감퇴 때문만 fluorophores 높은 표면 (100nm의 순서 대로)에 흥분 TIRF에 만드는 복잡 한 혼합물에서 대상 분자의 소량을 검출에 좋은 전략. TIRF의 고유의 광학 단면 강도 또한 세척 단계를 방지 하는 데 도움이 하 고 시험 시간 및 복잡성의 한계. 그러나, TIRF 평면 서피스를 요구 하 고 TIRF 현미경 흐름에 작은 방울에 적용의 예 포함 이미지를 평면 표면 형성. 13 이 단일 셀 proteomic 기술을 종종 디자인 표면 움직일 캡처 에이전트 microarray 형태로 주위 미세 칩. 4 , 14

방울, 평면 표면, 소위 드롭릿 microarrays에 배열에서 형성 될지도 모른다. 15 , 16 , 17 편리 하 게 인덱스, 쉽게 시간이 지남에 모니터링, 개별적으로 다루어야 하 고, 필요한 경우 검색 하면 공간적 배열에 방울을 조직. 드롭릿 microarrays는 독립형 또는 microwell 구조에 의해 지원 되는 칩 당 요소 수천 마이크로 반응 기의 높은 밀도 얻을 수 있습니다. 18 , 19 , 20 그들은 형성 될지도 모른다 액체 처리 로봇, 잉크젯 관측 병, 순차적 증 착에 의해 microarrayers21,22,23,,2425, 문의 26 또는 그들은 superhydrophillic와 같은 표면에 자기 조립 수 명소 superhydrophobic 표면에 무늬. 27 , 28 , 29

염두에 두고 이러한 고려 하 여 지정 드롭릿 Microarrays (Adm) 양적 다양성, 공간적 접근성 및 드롭릿 microarrays의 감소 볼륨을 단일 분자 TIRF 현미경의 감도와 결합 하도록 설계 되었습니다. 단백질 풍부를 측정 합니다. 5 Adm 다음 증발을 방지 하기 위해 기름으로 출장 하는 항 체 microarray에 단일 셀을 포함 하는 작은 물방울 microarray를 형성 하는 단일 세포 분석 가능 작은 물방울의 볼륨은 온 칩 valving 연속 흐름 마이크로에 의해 그렇지 않으면 달성 될 것 이다 샘플 손실을 방지 하기 위해 개별. 30 단일 셀에서 대상 단백질의 절대 크기가 매우 작습니다. 그러나, 작은 물방울의 감소 볼륨 수 있습니다 상대적으로 높은 지역 농도 샌드위치 항 체 분석 결과 사용 하 여 검색-뚜렷한 지역에서 또는 표면에 묶는 단백질을 캡처에 자리 항 체 움직일 수 에 붙일 이라는 탐지 항 체 방울 볼륨에 존재. 레이블 없는 접근 방식으로 (즉 단백질 대상 직접 표시 될 필요가 없습니다), Adm 처리 혈액 등의 기본 소스에서 세포 분석에 일반적으로 적용 되는, 잘 문화에서 셀 뿐만 아니라 aspirates와 해리 종양 생 검 필요 하 고 그들의 lysates입니다.

약물에 응답, 예를 들어에 결정에 중요 하다 단백질 풍부에서 셀 인구 변화 측정 및 세포 기능 및 통로, 평가 부분 모집단에 대 한 통찰력을 제공 하는 데 도움이 됩니다 및 그들의 행동 뿐만 아니라, 그렇지 않으면 대량 방법으로 마스크는 드문 이벤트를 식별. 이 프로토콜 생산 주소 드롭릿 microarrays를 사용 하 여 양적 인간 암 세포에서 전사 인자 p53의 풍부를 결정 하는 방법을 설명 하 고 p53 화학요법 약물에 대 한 응답에서의 역할을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 대상 단백질 캡처 및 탐지 항 체의 선택에 의해 결정 되 고 더 또는 다른 목표를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 기름으로 뒤덮인 10 nL 방울 수동으로 배열 하 일반 실험실 소모품에서 동심 노즐 통합 간단한 장치를 구축 안내 됩니다. 전체 실험 과정은 각 방울 lysed 다음 단일 셀와 단일 분자 해상도 TIRF 현미경을 사용 하 여 결정 하는 단백질의 표현 로드 그것에 의하여 설명 합니다.

프로토콜

1입니다. 준비

  1. 칩 및 인쇄 항 체 microarrays
    1. 항 체 microarray를 지원 하기 위해 기능성된 coverslip를 접착 실리콘/아크릴 아이 솔 레이 터를 연결 합니다. 이 칩을 이라고 합니다.
      참고: 다양 한 표면 화학 주소 방울과 그들의 적합성에 대 한 테스트 되었습니다. 5 표면 화학 대체 캡처 에이전트 최적화 할 수 있습니다. ADM 절연체 상업적으로 사용할 수 있습니다 또는 레이저 커팅 아크릴에 의해 생성 될 수 있습니다 (CAD 파일 아이 솔 레이 터가이 작품에 사용 되는 다운로드로 제공, 추가 코드 파일을 참조).
    2. microarrayer에 스위치와 습도 75%로 설정.
      참고: 상대 습도 microarray 핀에서 인쇄 솔루션의 증발을 감소 하 고 내 고 남북 spot 변이 감소 시킨다.
    3. Ultrasonication 여 5 분에 대 한 솔루션을 청소 하는 핀에 microarray 핀을 청소 하십시오. 매우 순수한 물 세척 병을 사용 하 여 핀을 헹 구 고 건조 한 질소를 사용 하 여.
      참고:만 담가 핀 끝으로 핀을 일시 중단 합니다. 구멍의 적절 하 게 드릴된 세트와 현미경 슬라이드 핀 홀더를 얻을 수 없는 경우 도움이 됩니다.
    4. 인쇄 버퍼 3 × 염-나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼, 1.5 M betaine 0.01% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 보완의 구성의 5 mL을 확인 합니다. 4 ° C에서 불명확 하 게 저장 합니다.
    5. 인쇄 솔루션을 준비, 안티-p53 항 체를 녹여 (p53/Mdm2 ELISA 키트, 재료의 표 참조) aliquots-80 ° c.에 저장 된 그것은 1:1 믹스 0.5 mg/mL의 최종 농도에 인쇄 버퍼. 384 잘 플레이트는 micropipette를 사용 하 여 인쇄 솔루션의 5-10 µ L을 로드 하 고는 microarrayer에.
    6. 부하 칩은 microarrayer에 단계 1.1.1에서에서 조립. 관광 명소는 아이 솔 레이 터의 각각의 센터에 의해 정의 된 좌표에 인쇄 microarrayer 프로그램.
      참고: Microarrayers 사용 범위, 주로, 독점 소프트웨어는 사용자가 관련 된 문학을 상담 하는 것이 좋습니다 그래서. Microarray 단계 1.1.1에서에서 동반 CAD 파일에 등장 하는 ADM 아이 솔 레이 터에 필요한 구성 요소의 사각형; 관련 거리 제공 됩니다.
    7. 밀폐 용기에 칩을 저장 하 고 호 일로 포장. 6 주까지 4 ° C에를 저장할.
      참고: 사진-손해를 방지 하기 위해 호 일이입니다. 4 ° C에서 저장 생체 및 microarray 활동을 감소 시키기 위하여 행동 할지도 모른다 어떤 해로운 반응의 저하 속도 제한 합니다. 밀폐 용기에는 칩을을 칩 표면에 형성 하는 결로 없이 사용 하기 전에 실내 온도에 equilibrate 수 있습니다. 연락처 microarray 인쇄 표면 장력 및 인쇄 솔루션 및 관광 명소를 생산 하는 인쇄 기판 사이의 접착을 이용 한다. 사전 인쇄 또는 blotting는 일반적으로 균일 하 게 크기의 관광 명소를 microarray 핀에서 과잉 솔루션을 제거 해야 합니다. 희생 미리 인쇄 coverslip 일괄 품질을 평가 하기 위해 사용할 수 있기 때문에 버리지 마십시오.
  2. 주사기, 준비 주소 방울 분배 배관 및 동심 노즐
    1. (대 한 수성 방울) 100 µ L를 분해 및 1 mL (상한 석유)에 대 한 해밀턴 주사기 유리 부품 증류수 H2o. 린스
    2. 150 µ m의 100 m m 길이 피드 ID/360 µ m OD 융합 1.0 m m ID/1/16의 40 m m 길이 통해 실리 카 튜브 "OD PFA 튜브 2 m m 돌출 될 때까지. 이 동심 노즐을 형성할 것 이다.
    3. 10 µ L 피 펫 팁의 끝에 cyanoacrylate 접착제의 얇은 층을 적용 하 고 1.0 m m ID/1/16의 40 m m 조각으로 삽입 "OD PFA 튜브. 필요한 경우, 접착제 세트 전에 노즐에서 2mm 돌출을 유지 하기 위해 융합 된 실리 카 튜브를 재조 정할.
    4. 용융 실리 카 모 세관의 다른 쪽 끝의 0.014"ID/0.062 200mm 길이의 끝에 삽입" PTFE 튜빙 마약 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (PBSA)이 4% 소 혈 청 배 젖 (BSA) 채워진 해밀턴 주사기 100 µ L를 연결.
      참고: 단백질과 다른 생 화 확 적인 종 표면에 비 특히 묶는 수 고 하거나 수 있습니다 수 손실 변성. BSA는 '차단' 표면 sacrificially 그 표면에 바인딩하여 일반적인 바인딩 최소화 하는 데 사용 됩니다.
    5. 그것은 물개를 형성 될 때까지 200 µ L 피 펫 팁에 1.0 m m ID/2.0 m m OD FEP 튜브의 400 m m 길이 삽입 합니다. 또 다른 200 µ L 피 펫 팁을 cyanoacrylate 접착제의 얇은 층을 적용 하 고이 자리에는 튜브를 해결 하기 위해 첫 번째 팁으로 밀어. 미네랄 오일으로 채워진 해밀턴 주사기 1ml에 1.0 m m ID/2.0 m m OD FEP 튜브의 열린 끝을 연결 합니다.
    6. 동심 노즐의 10 µ L 피 펫 팁에 200 µ L 피 펫 팁 어셈블리를 삽입 합니다. 별도 주사기 펌프에 주사기를 장소 그들은 독립적으로 운영 될 필요가 있을 것 이다.
    7. 4 %PBSA 차단 솔루션으로 100 µ L 주사기를 채우십시오. 다시 연결 하 고 차단 솔루션 '수성' 튜브를 플러시. 총 3 플러시를 두 번 반복 합니다.
    8. 4 %PBSA 다시 연결 튜브에서 0.125 µ g mL-1 탐지 항 체 (안티-p53 항 체 (마-1) 알 렉 사 488로 분류)로 100 µ L 주사기를 채우십시오. 펜스 25 튜브에 차단 솔루션 대체 µ L 탐지 항 체 솔루션.
    9. 모든 튜브와 노즐 기름으로 채우고 때까지 미네랄 오일 '석유' 튜브를 플러시. 미네랄 오일 1 mL 주사기를 리필 하 고 다시 연결 하는 튜브. 튜브와 노즐 어셈블리는 XYZ 조작자를 보안 합니다.
  3. Microinjector 및 micromanipulator 준비
    참고: 아래 단계 microinjector와 micromanipulator 기구 자료 테이블에에서 지정 된 구성 요소에 특정 참조를 확인 하지만 일반적으로 이러한 장치에 적용 되는.
    1. microinjector 압력 관과 모 세관 홀더를 연결 하 여 조립.
    2. 미네랄 오일 완전히 라인을 채우고 때까지 천천히 피스톤 다이얼을 돌립니다.
    3. 번역 헤드 마운트에 모 세관 홀더를 탑재 합니다.
    4. 모 세관 홀더 그립 헤드와 모 세관을 수정 했다.
    5. 4%의 솔루션을 플라스틱 PBSA는 아이 솔 레이 터의 우물 중 하나에.
    6. micromanipulator를 사용 하 여 번역 하십시오 하 고 솔루션으로 모 세관의 끝을 젖어.
    7. 천천히 4 %PBSA 떠나 10 분 동안 차단 하는 모 세관을 채우십시오.
    8. microcapillary을 추출 하 고 어셈블리는 칩의 명확한 번역 모듈을 회전.

2. 양식 주소 방울 및 부하 단일 셀

  1. 양식 주소 방울
    1. 현미경 단계에 칩을 보호 합니다.
      참고: 현미경은 자동된 현미경 단일 분자 TIRF의 장착 거꾸로 형광은 인코딩된 XY 스테이지 및 전자 전 하 결합 소자 카메라 (EM-CCD) 멀티.
    2. 자동된 현미경 제어 소프트웨어를 사용 하 여 배열에 있는 각 명소의 현미경 스테이지 좌표를 기록 합니다.
    3. 현미경 단계에 XYZ 조작자를 설정 합니다. 50-60 °의 각도에서 노즐을 배치 합니다. 노즐에 충분 한 길이 칩 도달 클리어런스 확인 합니다. '수성'과 '기름' 주사기 펌프 10 분배 설정 100 µ L/min과 100 µ L/분, 5 µ L에서 nL 각각.
      참고: 준비, 동안 노즐의 머리에서 수성 해결책 수 있습니다 건조 됩니다.
    4. 액체의 구슬 노즐의 머리에 표시 될 때까지 용액을 분배. 그것을 제거 하는 먼지 무료 지우기와 소량.
      참고: 조사 조건 수에 따라 다양 한 웰 스 셀에 대 한 저수지 역할을 보유 합니다. 단일 셀 라인/형식에 대 한 단일 저수지 충분 합니다.
    5. 자동된 현미경 제어 소프트웨어를 사용 하 여 배열 및 초점에서 항 체 자리에 coverslip 표면에 현미경 스테이지 좌표 설정.
    6. 방해 하지 않도록 주의 자리, XYZ 조작자를 사용 하 여 항 체의 측면에는 동심의 유리 모 세관 끝 및 10 분배 수성 해결책의 nL. 단계를 이동 하지 않고 수성 해결책을 뚜껑에 기름의 5 µ L를 분배 합니다. 천천히 노즐은 물방울의 명확한 올리고 잘 다음 이동.
    7. 배열에 있는 모든 항 체 관광 명소 2.1.6 단계를 반복 합니다.
    8. 30 분 후 각 항 체 세포를 로드 하기 전에 자리에 바인딩된 단일 분자의 배경을 자동된 현미경 제어 소프트웨어를 사용 하 여 배열에 있는 모든 관광 명소 이미지.
  2. 로드 셀 주소 지정이 가능한 방울
    1. 인큐베이터에서 세포 배양 플라스 크를 제거 하 고 트립 신/EDTA 솔루션을 사용 하 여 셀을 분리.
      참고:이 연구 될 인간 결 장 암 세포 라인 그리고 사용 Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) CO2 배양 기에서 보충을 사용 하 여 양식.
    2. 필요한 경우 셀 얼룩 놓여있는지.
      1. 10%에서 0.125 μ g/mL 탐지 항 체 (안티-p53 항 체 (마-1) 알 렉 사 488로 분류)의 솔루션에 셀 resuspend FBS L-15 미디어에서. 단일 세포 현 탁 액을 위해 40 µ m 피치 셀 스 트레이너를 통해 셀 솔루션을 필터링 합니다.
    3. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 희석 또는 25-400 × 103 셀/mL의 농도에 셀 솔루션을 집중. 그러면 그 셀 앙금 편안 하 게는 microcapillary 조작에 충분 한 간격으로.
    4. 단일 셀 micromanipulator microcapillary를 사용 하 여 셀 저수지에서 주소 지정이 가능한 작은 물방울으로 로드 합니다.
      참고: 비 부착 한 세포는 micropipette에 대량에서 로드할 수 있습니다 및 주소 지정이 가능한 작은 물방울으로 하나 하나를 적절 하 게. 표면 차단 치료에도 불구 하 고 부착 세포는 비 특히 유리 microcapillary 안 벽에 충실 하 여 손실 될 경향이 있습니다.
    5. 10 × 목표를 사용 하 여 관찰 하는 microinjector를 사용 하 여 단일 셀을 셀 저수지에서 microcapillary로 발음.
    6. 전자 조작 단계를 사용 하 여 경우 micromanipulator 무대 좌표를 저장 하거나 수동으로 z 위치를 참고.
    7. 칩의 1 m m 높이를 위쪽으로 그것을 번역 하 여는 micropipette 철회. 조이스틱이 나 전자 조작 무대의 '꺼내기' 기능을 사용 하 여 자동으로 이것을 수동으로 수행 합니다.
    8. 그는 주소 지정이 가능한 작은 물방울의 사용 현미경 제어 소프트웨어 자동 스테이지 좌표를 설정 합니다. ' 주사 '는 micropipette 저장 (또는 언급) z 위치를 반환 하 여. 조이스틱 또는 자동으로이 수동으로 수행 전자 조작 단계를 사용 하는 경우.
      참고: microcapillary는 상한 기름 피어스 되며 주소 지정이 가능한 작은 물방울의 수성 부분 내에서 찾을 수 있습니다.
    9. 분배는 microinjector를 사용 하 여 주소 지정이 가능한 작은 물방울에 셀. 10 nL 주소 지정이 가능한 작은 물방울의 볼륨 1% 미만 증가 합니다.
    10. 어디 주소 방울 셀을 포함 하지 않는 일부 실험 제어에 대 한 무료 두고 나머지 주소 방울에 대 한 2.2.5-2.2.9를 반복 합니다.
      참고: 주소 지정이 가능한 방울 micromanipulator를 microcapillary를 사용 하 여 단일 셀 로드 간단한 대안 농도 10의 순서에 4 %PBSA 포함 세포 항 체 검출의 솔루션으로 단계 1.2.8에서에서 솔루션을 대체 하는 5 셀/mL, 1 셀/10에 해당 nL. 단일 셀 인 Poissonian 되며 셀 농도 최적화 될 필요가 있을 것 이다.
  3. Lyse 세포 및 이미지 배열
    1. 모든 형광 이미지를 포함 하 여 명시 야 현미경을 사용 하 여 작은 물방울에 이미지 셀.
      참고: 영상 ~ 100 방울 자동된 현미경을 사용 하 여 이미지를 약 3 분 걸립니다. 이미지를 수행 60 나 = 1.49 기름 침수 목표. 아니 필터는 명시 이미징 반면 형광 이미징에 사용 되는 표준 필터 집합 필요 합니다.
    2. 단일 분자 TIRF 현미경을 사용 하 여 배열에 있는 모든 관광 명소 이미지.
      참고: 특수 TIRF 2.3.1 단계에서 필터 집합 설정이 사용 됩니다. 이러한 이미지 세포 전 각 항 체 자리에 바인딩된 단일 분자의 배경을 결정 하는 3 절의 이후에 분석 됩니다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용 하 여 단일 분자 이미징 이미지 ~ 100 관광 명소를 약 5 분 걸립니다.
    3. 셀 주소 지정이 가능한 작은 물방울에 초점. 단일 6 초점을 맞춤 으로써 완전 한 광 세포 달성 ns 레이저 펄스 (파장 1064 nm, 펄스 당 펄스 에너지 14.1 ± 0.3 µJ)는 셀의 위치에 가까운.
      참고: 레이저 펄스 확대 공동 현상 거품을 그가 위 셀 설정 하 고 세포 성분 물방울 볼륨으로 줘 라. 4 , 31 레이저 유도 세포로 인해 기계적 프로세스 낮은 펄스 에너지에서 오일-물 인터페이스를 방해 하지 마십시오. 광 세포는 일반적으로 100 세포를 lyse 약 20-30 분 걸립니다. 토론 섹션에서 설명 했 듯이, 광 세포 설치 가능 하지 않은 경우 단일 세포를 lyse 대체 방법 수가 있습니다.
    4. 모든 포함 하는 셀 주소 지정이 가능한 방울 떠나 5 실험 제어에 대 한 무료 주소 방울 취소 lysed 세포를 포함 하는 어디에 대 한 반복 합니다.
    5. 참고는 각 셀이 lysed 시간.
      참고:이 시간 단계 3.1.9에서에서 각 명소에 대 한 개별 바인딩 곡선을 해결 하기 위해 사용 됩니다. 종종 주의 시간 때 첫 번째 및 마지막 셀 lysed는 나머지 가정 세포 이벤트 사이 적절 하 게 일관 된 시간을 추정 하는 충분 하다.
    6. 첫 번째 30 분 후 추가 60 분 마다 20 분 마다 10 분의 모든 관광 명소의 TIRF 현미경을 사용 하 여 단일 분자 이미지를 취득 합니다. 평형에 바인딩된 단백질 양에 관심만 실 온에서 90 분 동안 칩 잠복기 후 모든 관광 명소를 이미지.
      참고: 평형에 도달 하는 시간 방울 볼륨 및 분석 결과에서 사용 하는 항 체의 친 화력에 따라 달라 집니다. TIRF 현미경 레이저 여기 소스를 사용 하 여 수행 됩니다 = 488 nm와 1.5 mW 파워 광 파워 미터를 사용 하 여 다시 조리개에서 측정 되. 단일 분자 이미지 900 수집 시간, 1 MHz 판독 속도에서 16-비트 디지털화를 안에 CCD 카메라에 수집 설정을 설정 하 여 인수 하 고 그들 10 얻을. 아이 솔 레이 터는 coverslip 신중 하 게 제거 하 여 다시 사용할 수 있습니다.

3. 데이터 분석

  1. 단일 분자 (비-정체/디지털 정권)을 계산
    1. 피지 (Matlab), 어떤 혼잡 비 항 체 자리에 대 한 using, 세포 (배경, BKD) 전에 취득 하는 이미지를 로드 합니다.
      참고: 다음 단계에서 작업 straightforwardly 수행 됩니다 피지 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여. 사용자 가이드 다음 링크 https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html에서 찾을 수 있습니다.
    2. 피지에서 BKD 이미지를 선택 합니다. "이미지" 메뉴에서 "중복" 중복 BKD를 선택 합니다. 중복 이미지 선택 및 "과정 > 필터"에서 "가우스 덩어리 죠" 하는 것을 선택 하 고 50 픽셀 반경을 지정.
    3. BKD 이미지 흐리게 BKD 이미지를 생산 하는 BKD_FLAT에 의해 나누어 여기 광원의 효과적인 균일 강도 분포 되도록 BKD 이미지를 평평.
      1. "프로세스" 선택 "이미지 계산기...", 이미지 필요한 작업 "나누기"를 지정 하 고 선택 상자 "만들기 새 창"와 "32-비트 (부동) 결과."
    4. 1 이미지에서 각 픽셀을 뺍니다 ("과정 > 수학", "빼기..."를 선택 하 고 값 1 지정). 평균 픽셀 강도 0 이어야 합니다.
      참고: 병합 필드 하 고 이후 모든 픽셀의 합계 0 이어야 하 고 모든 나머지 오프셋 수 있습니다 더 straightforwardly 보상 평면화 된 배경 이미지를 쉽게 확인할 수 있습니다.
    5. BKD_FLAT 이미지의 4 모서리에 50 픽셀 × 50 픽셀 영역을 선택 합니다. "분석"과 "측정"을 선택 하 여 픽셀 강도 표준 편차 (σ)를 측정 합니다.
      참고: 선택 영역 요약 통계 결과 창에 표시 됩니다. 이 자리에서 배경 결정 단일 분자의 높은 밀도 될 것입니다. 기본 메뉴 선택 도구를 사용 하 여 측정 위치를 수동으로 선택할 수 있습니다 하거나 실행 매크로 코드 "makeRectangle (x, y, 너비, 높이)"; 이 사각형 선택 영역을 만듭니다 어디 x 및 y 좌표 (픽셀)의 왼쪽된 위 모퉁이 인수.
    6. 3σ로 이미지 임계값을 설정 하 고 SM_MASK 이진 이미지를 만듭니다.
      1. "이미지 > 조정" 아래 "임계값..."를 선택 하 고 3σ로 더 낮은 임계값을 설정 합니다.
        참고: 픽셀 임계값 값은 0으로 설정 되 고 임계값을 초과 하는 픽셀을 1로 설정 됩니다. 임계값은 thresholded 픽셀 단일 분자에 속하는 자신감을 결정할 것입니다.
    7. 세그먼트 이미지 SM_MASK, 4-9 픽셀2 의 크기 및 0.5-순환 하는 개체의 0 설정된 픽셀 휘도 값에에서 1 "분석"을 선택 하 여 다음 분석 입자 크기와 원형 지정.
      참고: 픽셀 크기 다른 fluorophores 및 현미경 세트에 대 한 최적화를 할 수 있습니다 ups. 카메라 노이즈 유형 때문 단일 픽셀이이 임계값 이상 있을 수 있으며 단일 분자 되지에 불구 하 고 폐기 하지. 픽셀 크기 기준 올바르게 이러한 픽셀을 삭제 것입니다. 단일 분자는 일반적으로 모양에서 원형. 반면 값이 0에 접근 이면 점점 더 길쭉한 모양을 진원도 값 1 완벽 한 원을 나타냅니다. 나머지 개체는 단일 분자 고 계산 될 수 있습니다. 자리에 자리 를 차별의 영역을 구분 하는 마스크를 설정할 수 있습니다 고 자리에서 프레임 당 계산. 이것은 최신 시간에서 획득 하는 프레임에 대 한 쉽게 이전 프레임에 적용할 수 있는 충분 한 신호 자리에 있을 때.
    8. 같은 비 혼잡 항 체 자리에 대 한 로드 하 고 단계 3.1.1-모든 이미지 프레임 3.1.7 캡처한 시간 해결 시리즈 인수 게시물 세포로 반복 합니다. 2.3.5 단계에 세포의 용 해 시간을 사용 합니다. 모든 바인딩 곡선 수정
  2. 단일 분자 (정체/아날로그 정권)을 계산
    1. 계속 하기 전에 단일 분자의 평균 강도 계산 하려면 단계 3.1.1-3.1.8 반복 합니다.
    2. BKD_FLAT 및 SM_MASK에 의하여 0이 아닌 픽셀 값은 단일 분자와 관련 있는 이미지 생성 이미지를 곱하면 됩니다.
      1. 을 수행 하려면, "프로세스" 메뉴에서 "이미지 계산기...", "곱하기" 운영과 필수, 이미지 지정 선택한 상자 "만들기 새 창"와 "32-비트 (부동) 결과."
    3. "분석" 그리고 "측정";를 선택 하 여 모든 픽셀의 강도 값 합계 선택 항목의 요약 통계 결과 창에 표시 됩니다. 단계 단일 분자 당 평균 강도 계산 하는 3.1.8에 의하여 계산된 단일 분자의 수로 나눕니다.
    4. 어떤 혼잡 한 항 체 자리에 대 한 로드 이미지 획득 후 세포 평평 하 게 단계 3.1.2와 3.1.3에 의하여 흐린된 배경 이미지와 함께.
    5. 1에 의해 병합 된 이미지에서 각 픽셀을 빼기 ("과정 > 수학", "빼기..."를 선택 하 고 값 1 지정)
    6. 이미지의 4 모서리에 50 픽셀 × 50 픽셀 영역을 선택 하 고 픽셀 강도 표준 편차 (σ)를 측정. 3.1.5 자세한 단계를 참조 하십시오.
    7. 3σ에 이미지 임계값을 설정 하 여 바이너리 이미지 마스크를 만들고 크기와 개체의 0 미만 4 픽셀2픽셀 강도 값을 설정 합니다. 을 수행 하려면, "분석" 메뉴에서 "입자 분석"을 선택 하 고 크기 및 원형 지정.
    8. 병합 된 혼잡 한 항 체 자리 이미지를 바이너리 이미지 마스크에 곱하십시오.
      1. 을 수행 하려면, "프로세스" 메뉴에서 "이미지 계산기...", "곱하기" 운영과 필수, 이미지 지정 선택한 상자 "만들기 새 창"와 "32-비트 (부동) 결과."
    9. "분석"을 선택 하 여 나머지 픽셀 농도의 합계 다음 "측정"; 선택 항목의 요약 통계 결과 창에 표시 됩니다.
    10. 혼잡 한 자리에 바인딩된 단일 분자의 수를 계산 하기 위해 평균 단일 분자 강도 의해 픽셀 농도의 합계를 나눕니다.
  3. 절대 정량화에 대 한 교정 곡선
    1. 섹션 1과 알려진된 농도 재조합 단백질으로 아군 4 %PBSA 솔루션에서 10 nL 주소 방울 탐지 항 체를 형성 하는 2를 반복 합니다.
    2. 수행 하는 10의 농도 시리즈2-솔루션에 추가 하는 재조합 형 단백질의 알려진된 농도 변화 하 여 방울 당 107 재조합 단백질. 보정 단일 셀 데이터 간단 있도록 드롭릿 당 단백질의 수 작업 하는 것이 좋습니다.
    3. 3.3.2 어떤 단 하나 분자를 보정 단계에서 데이터 계산 농도 시리즈를 사용 하 여 자리 단백질 풍부한 방울 당 고 단일 셀 당 확장 단백질 풍부 하 당.

결과

P53의 절대 기저 단백질 복사본 수 인간 결 장 암 세포 선, 될 셀에에서 단일 셀 해상도로 결정 되었다. 어떻게 p53 식 여러 자릿수로 동안 다를 수 있으며 휴식 될 세포 인구 내에서 셀 크기와 단백질 복사 번호 약하게 긍정적인 상관관계를 보여 보여 줍니다.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 수성 방울 항 체 자리 위치에서 적...

토론

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays는 양적 단일 세포 내 단백질의 절대 복사본 수를 결정 하는 과민 하 고 확장 가능한 방법.

일반적인 바인딩 수준을 제한 (NSB)이 낮은 가능한 탐지의 한계를 달성 하는 프로토콜 내에서 중요 합니다. 단백질 및 다른 생 화 확 적인 종 방울 내의 인터페이스의 수에 비 특히 묶는 수 있습니다-coverslip 표면, 항 체 자리와 기름/물 인터페이스. 단백...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

ASR는 실험 설계, 프로토콜을 개발 하 고 데이터를 분석. SC와 PS 셀 크기 실험을 수행. ASR와 OC는 원고를 썼다. 저자는 기꺼이 인정 하는 교수 데이비드 R. Klug의 지원 장비에 대 한 액세스를 제공 하고자 합니다. 저자는 제국 대학 고급 Hackspace 제조 및 프로토타이핑 시설에 대 한 액세스를 감사 하 고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Life Technologies10010015
DMEM high glucoseSigmaD6429
Foetal Bovine Serum (FBS)BiochromS0115
cell culture flasksCorningSIAL0639
Trypsin/EDTABiochromL2153
NameCompanyCatalog NumberComments
Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab, UKOmniGrid Micro
Microcontact pinArrayIt, USA946MP2
Coverslips (Nexterion)Schott, Europe1098523Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibodyEnzoADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelledSanta Cruzsc-126stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate bufferGibco15557-044
BetaineSigma61962
Sodium dodecyl sulphateSigmaL3771
384 well plate (low volume)SigmaCLS4511
Nitrogen gas cylinderBOCIndustrial grade, oxygen-free
NameCompanyCatalog NumberComments
Droplets
MicromanipulatorEppendorfPatchman NP2
Manual MicroinjectorEppendorfCellTram Vario
MicropipetteOrigio, DenmarkMBB-FP-L-0
Syringe pumpsKD ScientificKDS-210
100 μL syringeHamilton81020Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringeHamilton81327Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolatorGrace Bio-LabsJTR24R-A-0.56x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutterVersaLASEVLS2.30 CO2 Laser 3Wfor laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheetWeatherall-UKClarex Precision Sheet 001for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet3Mused to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glueLoctiteLOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubingIDEXFS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubingIDEX1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubingKinesis008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubingIDEX1673
Bovine Serum Albumen (BSA)Fisher ScientificBP9700100
Mineral oilSigmaM5904
Ultra-pure waterMillipore, GermanyMilliQ
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stageNikon, JapanNikon Ti-E
EM-CCDAndor Technologies, IrelandIXON DU-897E
Laser excitation sourceVortran, USAStradus 488-50
Optical lysis laser sourceContinuum, USASurelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRFChroma, USAz488bp
Microscope filter cube for Optical LysisLaser 2000, UKLPD01-532R-25
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
FijiOpen SourceImage analysis software
MatlabMathworksversion 7.14 or higherImage analysis software

참고문헌

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).

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