JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada adresli damlacık microarrays (ADM'ler), bir damlacık array tabanlı yöntemi mutlak protein bolluk içinde tek hücreleri belirlemek mümkün mevcut. Biz heterojenite tümör baskılayıcı protein p53 bir insan kanser hücre satırı ifade derecesinin ADM'ler kapasitesini göstermek.

Özet

Sık sık hücresel davranış ve hücresel yanıt nerede birçok hücre yanıtları birlikte zengin tek hücre davranış karmaşık bir nüfus içinde maskeleme ortalama bir sonucu olarak havuza nüfus düzeyinde analiz edilir. Tek hücre proteini algılama ve miktar teknolojileri son yıllarda kayda değer bir etki yapmış. Burada bir pratik ve esnek tek hücre Analizi platform adresli damlacık microarrays üzerinde tabanlı açıklayın. Bu çalışma nasıl hedef proteinler mutlak kopya sayısına tek hücre çözünürlük ile ölçülen açıklar. Tümör baskılayıcı p53 ile toplam kanser vakalarının bir sigara sağlıklı p53 ifade deseni sergileyen % 50'den fazla insan kanseri en sık mutasyona uğramış gen var. Protokolü ile tam ifade değişkenlik belirlemek için tek molekül kararlılık içinde olan tek insan kanser hücreleri izole edilmiştir ve p53 protein kopya sayısı ölçülen 10 nL damlacıkları oluşturmak için adımları açıklar. Yöntem ilgi herhangi bir hedef proteinler mutlak kopya sayısını belirlemek için birincil malzeme dahil olmak üzere herhangi bir hücre türüne uygulanabilir.

Giriş

Bu yöntemin amacı bereket bir hedef proteinin hücre popülasyondaki özneleri, tek hücre çözünürlük varyasyon tespit etmektir. Tek hücre Analizi birçok geleneksel ensemble biyokimyasal yöntemlerle kullanılamaz avantaj sağlar. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 öncelikle, tek hücre düzeyinde çalışan nüfusunun geleneksel ensemble biyokimyasal teknikleri ile oluşan sayı ortalaması alınarak kaybeden bir hücre zengin heterojenite yakalayabilirsiniz. Genellikle yapmak gibi çoğu iş-at biyokimyasal Yöntemler ile toplu, gerektiren, milyonlarca hücre bir sonucu elde etmek için çalışır. Tabii ki, tüm hücre popülasyonlarının değerlendirme sonuçlarını bağlı bir dizi faktöre, örneğin, heterojenite protein ifadesindeki nerede bazı önemli özellikleri protein bereket dağılımı özledim. Pratik bir bakış açısından, tek hücre teknikleri gerekli hassasiyeti onları çalışmaya bile daha duyarlı toplu teknikleri için yetersiz biyolojik malzeme miktarları ile çalışma yeteneğine sahip olun. Bu anahtar bir örnek gibi tümör hücreleri (CTCs) nerede kötü prognostik outlook olan hastalar için bile 10 CTCs bir tek 7.5 mL kan mevcut olabilecek daha az çizmek dolaşan nadir hücre tipleri çalışmadır. 6 burada tek hücre proteini ölçümleri antikor tabanlı tahlil petrol şapkalı damlacıkları istihdam bir antikor Mikroarray baskılı azaltılmış bir birim için gerçekleştirmek için gereken yöntemi mevcut.

Mikrosıvısal damlacık platformlarına yüksek işlem hacmi, damlacıkları ikinci ve yetenekli yalıtma ve hatta kültür, tek hücre başına binlerce bireysel damlacıkları biyokimyasal testleri geniş bir dizi gerçekleştirmek için elde edebilecektir. Damlacık tabanlı teknikleri de tek hücre analizi,7,8,9 ile hangi büyük ölçüde gücüyle destekli DropSeq1110 ve inDrop, dahil olmak üzere önemli son örnek için uygundur güçlendirme teknikleri. Malzeme sınırlı miktarda amplifikasyon hiçbir yöntem proteinler için yapmak ve tek hücre proteomik özellikle zorlu.

Damlacıkları birkaç yöntem tarafından analiz edilecek ve floresans mikroskobu yaygın olarak kullanılmıştır. Toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi gibi tek molekül teknikleri ile eşsiz sinyal-gürültü oranı görüntülenmeyecektir floresan molekülleri sağlar. 12 fani alan üstel çürümesi nedeniyle, TIRF iyi bir strateji karmaşık bir karışımı bir hedef molekül küçük miktarlarda saptamada yapma sadece fluorophores (sırasıyla 100nm) yüzeyine yüksek birbirine heyecanlı mısın. Zaman ve karmaşıklık sınırları tahlil ve TIRF doğal optik parça gücünü de yıkama adımları önlemek için yardımcı olur. Ancak, TIRF düzlemsel yüzeyler gerektirir ve bir düzlemsel yüzeyine hangi görüntü oluşumu damlacıkları akışı uygulanan TIRF mikroskobu örnekleri içerir. 13 bu amaçla, tek hücre proteomik teknikler kez mikrosıvısal çip çevresinde yüzey immobilize yakalama ajanlar bir Mikroarray biçimde tasarlayın. 4 , 14

Damlacıkları, kendilerini, düzlemsel yüzeylerde, sözde damlacık microarrays dizilerde oluşmuş. 15 , 16 , 17 dağınık şekilde organize damlacıkları dizilerden onlara uygun dizine, kolayca zaman içinde izlenen, ayrı ayrı ele alınması ve gerekirse, alındı sağlar. Damlacık microarrays yüksek yoğunluklu mikro-reaktörler müstakil veya microwell yapıları tarafından desteklenen elemanları küçük parça başına binlerce elde edebilirsiniz. 18 , 19 , 20 oluşturdular tarafından sıvı işleme robotlar, mürekkep püskürtmeli spotters, sıralı ifade tarafından microarrayers21,22,23,24,25, iletişim 26 ya da kendi kendine bir araya superhydrophillic gibi yüzeylerde lekeler desenli bir superhydrophobic yüzeye. 27 , 28 , 29

Bunu göz önünde bulundurarak, adresli damlacık Microarrays (ADM'ler) çok yönlülük, kayma adreslenebilirliği ve damlacık microarrays düşük hacimli teminatlarının tek molekül TIRF Mikroskopi için duyarlılık ile birleştirmek için tasarlanmıştır protein bereket ölçmek. 5 daha sonra buharlaşma önlemek için yağ ile kaplıdır bir antikor Mikroarray üzerinde tek hücreleri içeren bir damlacık Mikroarray oluşturan tek hücre Analizi ADM'ler etkinleştirin. Damlacıkları hacimleri üstünde-küçük parça içinde sürekli akışı Havacilik valving tarafından elde örnek kaybını önlemek için ayrı. 30 hedef protein tek bir hücreden mutlak miktarı son derece küçüktür; Ancak, damlacıkları azaltılmış hacmi için nispeten yüksek yerel yoğunlaşması sağlar bir sandviç antikor tahlil kullanarak algılanır - antikor ayrı bir bölgede ya da nokta, hangi sırayla bağlayan protein yakalar bir yüzey üzerinde immobilize umulur ki için bir fluorescently etiketli algılama antikor damlacık hacmindeki mevcut. Bir etiket içermeyen bir yaklaşım (yani protein hedefler doğrudan etiketli gerek yok), ADM'ler işlenmiş kan gibi birincil kaynakları hücrelerinden analiz için genellikle tabidir, iyi örnekleri ve Disosiye tümör biyopsi yanı sıra kültür hücrelerden gerekir ve onların lysates.

Buna karşılık, örneğin, heterojen bir ilaç belirlemede önemlidir varyasyon protein bolluk içinde bir hücre nüfus arasında ölçme ve hücresel işlevler ve yollar, altgrupları değerlendirme sağlamada yardımcı olacak ve onların Aksi takdirde toplu yöntemlerle maskeli nadir olayları tanımlayın yanı sıra davranış. Bu iletişim kuralı üretmek ve adresli damlacık microarrays kantitatif transkripsiyon faktörü p53 insan kanser hücrelerinin içinde bolluk belirlemek için nasıl kullanılacağını açıklar ve p53 kemoterapötik ilaçlara yanıt rolünü araştırmak için kullanılabilir olur. Hedef protein yakalama ve algılama antikorları seçimi ile belirlenir ve daha fazla veya farklı hedefleri içerecek şekilde değiştirilmiş. Genel Laboratuvar sarf malzemeleri el ile yağ ile şapkalı 10 nL damlacıkları dizi için gelen eş merkezli bir meme birleştiren bir basit aparatı oluşturmak için yönergeler sağlanmıştır. Her damlacık sonra sonra lysed tek bir hücre TIRF mikroskobu kullanılarak tek molekül çözümleme ile belirlenen protein ifade dolu olan sayede tam deneysel işlemi açıklanmıştır.

Protokol

1. hazırlık

  1. Cips ve yazdırma antikor microarrays olun
    1. Bir yapışkan silikon/akrilik izolatör bir antikor Mikroarray desteklemek için functionalized bir coverslip ekleyin. Bu kozu olarak adlandırılır.
      Not: Çeşitli yüzey kimyaları adresli damlacıkları ile uygunluk için test edilmiştir. 5 yüzey kimyaları alternatif yakalama maddeleri için optimize edilmiş olması gerekir. ADM izolatörler ticari olarak kullanılabilir veya lazer kesim akrilik tarafından üretilen (CAD için bu çalışmada kullanılan izolatör bir yükleme olarak sağlanan dosya; Ek kod dosyasınabakın).
    2. Microarrayer üzerinde geçiş ve nem % 75'e ayarlayın.
      Not: bağıl nem yazdırma çözümü buharlaşma Mikroarray iğnesinden azaltır ve içi ve arası spot varyasyon azaltır.
    3. Mikrodizi PIN PIN tarafından ultrasonication temizleme solüsyonu 5 min için temiz. PIN bir yıkama şişe kullanarak ultra saf su ile durulayın ve nitrojen kullanarak kuru.
      Not: yalnızca toplu iğne ucu sokmak için PIN askıya alma. Pim tutucu aldıysanız mikroskop slayt uygun şekilde açılmış bir set delikleri ile yardımcı olacaktır.
    4. 3 × Serum sodyum sitrat (SSC) arabelleği, 1.5 M betan % 0,01 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ile desteklenen Yazdırma arabelleği oluşan 5 mL olun. 4 ° C'de süresiz olarak depolar.
    5. Yazdırma çözüm hazırlamak için anti-p53 antikor çözülme (p53/Mdm2 ELISA kiti; malzemeler tablo bakın)-80 ° C'de depolanan aliquots Yazdırma arabelleği için 0,5 mg/mL nihai bir konsantrasyon ile karıştırın 1:1. 5-10 µL bir micropipette kullanarak 384 bir şey plaka baskı çözüm yük ve microarrayer içinde yer.
    6. 1.1.1. adımda microarrayer monte cips yükleyin. Her şey İzolatör Merkezi tarafından tanımlanan koordinatları spotları yazdırmak için microarrayer program.
      Not: Microarrayers bir dizi istihdam ağırlıklı olarak, özel mülk yazılım ve okuyucu ilgili edebiyat danışmak için teşvik edilmektedir. Adım 1.1.1 eşlik eden CAD dosyasında özellikli ADM İzolatör için gerekli Mikroarray dikdörtgen öğelerini kapsar; ilgili mesafeler sağlanır.
    7. Fişleri hava geçirmez kaplarda saklayın ve folyo ile sarın. 6 haftalık 4 ° C depolama yapar.
      Not: Folyo fotoğraf zarar önlemek içindir. Depolama 4 ° C'de biomolecules ve Mikroarray etkinliğini azaltmak için hareket edebilir herhangi bir zararlı reaksiyonlar bozulma hızı sınırlar. Hava geçirmez bir kaba çip yüzeyinde şekillendirme yoğunlaşma olmadan kullanmadan önce oda sıcaklığına equilibrate için fiş sağlar. Mikrodizi yazdırma patlatır yüzey gerilimi ve yazdırma çözüm ve noktalar üretmek için baskı yüzey arasındaki yapışma başvurun. Önceden yazdırma veya kurutma normalde fazla çözüm birörnek boyutlu lekeler vermeye Mikroarray iğnesinden kaldırmak için gereklidir. Toplu iş kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir beri kurban önceden yazdırma coverslip atmayın.
  2. Şırınga, hazırlamak adresli damlacıkları dağıtımı için Borulama ve konsantrik parke bașlığı
    1. (İçin sulu damlacık) 100 µL sökmeye ve 1 mL (için kapatma yağı) Hamilton şırınga cam ve distile H2O. bölümleriyle durulama
    2. 150 µm 100 mm uzunluğunda besleme kimliği/360 µm OD erimiş silis boru 1.0 mm ID/1/16 40 mm uzunluğu ile "tarafından 2 mm dışarı çıkar kadar OD PFA boru. Bu konsantrik meme oluşturacak.
    3. 10 µL Pipet Ucu ucuna cyanoacrylate tutkal ince bir tabaka uygulayın ve 1.0 mm ID/1/16 40 mm parça içine ekle "OD PFA boru. Gerekirse, yapışkanlı setleri önce meme, 2 mm çıkıntı korumak için erimiş silis boru yeniden konumlandırın.
    4. Erimiş silis kılcal diğer ucunu 200 mm uzunluğu 0,014" kimliği/0.062 ucunu bağlayın" OD PTFE boru ve bu Hamilton şırınga % 4 Sığır serum albümin (BSA) ile dolu bir 100 µL fosfat tamponlu tuz (PBS) (PBSA Web site) bağlanın.
      Not: Protein ve diğer biyokimyasal türler özel olarak sigara yüzeylere bağlamak kaybetti ve denatüre. BSA 'non-spesifik bağlama sacrificially Bu yüzeylere bağlayarak en aza indirmek için yüzeyler engellemek için ' kullanılır.
    5. Bir mühür oluşturur kadar 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP boru 400 mm uzunluğu 200 µL pipet ucu sokun. Başka bir 200 µL pipet ucu cyanoacrylate tutkal ince bir tabaka uygulayın ve bu tüp burada düzeltmek için ilk ipucu içine itin. 1 ml Hamilton şırınga mineral yağ ile dolu 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP boru açık ucunu bağlayın.
    6. 200 µL pipet ucu derleme 10 µL pipet ucu konsantrik meme yerleştirin. Onlar bağımsız olarak ameliyat olmak ihtiyacınız olacak gibi şırıngaları ayrı şırınga pompaları yerleştirin.
    7. 100 µL şırınga %4 PBSA Web site engelleme çözüm ile doldurun. Yeniden bağlayın ve engelleme Çözümle 'sulu' boru temizleme. Toplamda 3 basması için iki kez tekrarlayın.
    8. %4 PBSA Web site ve yeniden taktığınızda boru 0,125 µg mL-1 algılama antikoru (anti-p53 antikor (-1) ile Alexa 488 etiketli) ile 100 µL şırıngaya doldur. Boru içinde engelleme Çözüm dağıtım 25 tarafından yerine µL algılama antikor çözüm.
    9. Tüm boru ve meme doldurur kadar yağ ile 'Petrol' boru mineral yağ ile yıkayın. Mineral yağ ile 1 mL şırınga dolum ve boru re-attach. XYZ manipülatör boru ve meme derlemeye güvenli.
  3. Microinjector ve micromanipulator hazırlamak
    Not: Aşağıdaki adımları microinjector ve malzemeler tablo belirtilen micromanipulator aparatı bileşenleri belirli başvuru yapmak, ancak genellikle bu tür cihazlar için geçerlidir.
    1. Microinjector basınç boru ve kapiller tutucusu ekleyerek birleştirin.
    2. Mineral yağ tamamen çizgiyi dolduracak kadar yavaş yavaş piston arama döndürün.
    3. Kapiller tutucu çeviri baş bağlama monte.
    4. Kılcal damar kılcal sahibi kavrama kafa ile düzeltmek.
    5. % 4'lük bir çözüm pipette PBSA Web site içine bir izolatör Wells.
    6. Micromanipulator kullanarak çevirmek ve kılcal ucu çözüm içine bırakın.
    7. Yavaş yavaş kılcal %4 PBSA Web site ve bırakın 10 dakikadır blok ile doldurun.
    8. Microcapillary çıkarma ve böylece derleme çipi açıktır çeviri modülü döner.

2. form adresli damlacıkları ve yük ile tek hücre

  1. Form adresli damlacıkları
    1. Belgili tanımlık küçük parça mikroskop sahne alanı'nda güvenli.
      Not: Otomatik mikroskop tek molekül TIRF yetenekli donatılmış ile ters bir floresan mikroskop olan bir kodlanmış bir XY sahne ve şarj kuplajlı cihaz kamera (EM-CCD) çarparak bir elektron.
    2. Mikroskop sahne alanı koordinatlarına her spot otomatik mikroskop kontrol yazılımı kullanarak dizi kaydedin.
    3. XYZ manipülatör mikroskop sahne alanı'nda ayarlayın. Meme 50-60 ° lik bir açıyla yerleştirin. Meme yeterli uzunlukta ve çip ulaşmak için izni olduğundan emin olun. Set 'sulu' ve 'Petrol' şırınga 10 dağıtmak için pompalar nL 100 µL/dk ve 5 µL 100 µL/dk, anılan sıraya göre.
      Not: hazırlık sırasında meme başında sulu çözüm kuru.
    4. Sıvı bir boncuk meme başında görünene kadar sulu çözüm dağıtmak. Bunu kaldırmak için toz ücretsiz temizleme işlemi ile kurulamak.
      Not: koşullar altında soruşturma sayısına bağlı olarak, kuyu rezervuar hücrelerin olarak hizmet verecek bir dizi saklıdır. Bir tek hücre satırı/türü için tek bir rezervuar yeterli olacaktır.
    5. Otomatik mikroskop kontrol yazılımı kullanarak, coverslip yüzeyinde bir antikor nokta dizi ve odak için mikroskop sahne alanı koordinatlarına ayarlayın.
    6. Dikkat et de rahatsız etmeyin XYZ manipülatör kullanarak spot, cam kapiller antikor nokta tarafına konsantrik meme hizalayın ve 10 dağıtmak nL sulu çözüm. Belgili tanımlık sahne hareket olmadan, sulu çözüm kap petrolün 5 µL dağıtmak. Yavaş yavaş damlacık açık meme büyütmek ve de geçmek.
    7. Dizideki her antikor noktalar için 2.1.6 arasındaki adımları yineleyin.
    8. 30 dakika sonra arka plan her antikor hücreleri önce yükleme spot bağlı tek moleküllerin belirlemek için otomatik mikroskop kontrol yazılımı kullanarak dizideki tüm noktalar görüntü.
  2. Yük hücreleri ile adreslenebilir damlacıkları
    1. Hücre kültür şişeler kuluçka makinesi kaldır ve tripsin/EDTA çözüm kullanarak hücreleri ayır.
      Not: Bu çalışmada BE insan kolon karsinomu hücre kültürünü kullanıldı ve Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 (v/v) fetal Sığır serum (FBS) CO2 kuluçka ile takıma DMEM) kullanarak kültürlü.
    2. Gerekirse, fluorescently hücreleri leke.
      1. Hücrelerde 0,125 μg/mL algılama antikoru (anti-p53 antikor (-1) ile Alexa 488 etiketli) çözeltisi % 10'luk resuspend FBS L-15 medya. Bir tek hücre süspansiyon emin olmak için bir 40 µm pitch hücre süzgeç aracılığıyla hücre çözümü filtre.
    3. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve seyreltik veya hücre çözümü 25-400 × 103 hücre/mL konsantrasyonu konsantre. Bu o hücreleri tortu ile rahat microcapillary işlemek için yeterli aralığı sağlar.
    4. Tek hücre micromanipulator ve microcapillary kullanarak hücre rezervuar adresli damlacıkları içine yükleyin.
      Not: Sigara yapışık hücreleri toplu micropipette içine yüklenebilir ve tek tek adresli damlacıklar halinde reçete. Yüzey engelleme tedaviye rağmen yapisan hücre hatları olmayan özellikle cam microcapillary iç duvar için sopa ve kayıp eğiliminde olacaktır.
    5. 10 × amacı istimal gözlemlemek, tek bir hücre hücre rezervuar microcapillary içine Aspire edin için microinjector kullanın.
    6. Eğer bir elektronik manipülatör sahne kullanarak micromanipulator sahne alanı koordinatlarına depolamak veya el ile z konumunu not edin.
    7. Micropipette yukarı doğru 1 mm yükseklik çipin temizlemek için çevirerek geri çek. Bu el ile oyun çubuğu veya bir elektronik manipülatör sahne alanı'nın 'Çıkar' özelliği kullanılarak otomatik olarak gerçekleştirin.
    8. Sahne adresli bir damlacık kullanarak mikroskop kontrol yazılımı otomatik olduğunu eşgüdümünü sağlar küme. 'Micropipette saklı (ya da kaydetti) z-konuma döndürerek enjekte'. Bu el ile gerçekleştirmek bir joystick ile ya da otomatik olarak bir elektronik manipülatör sahne kullanıyorsanız.
      Not: Microcapillary kapatma petrol işlemek ve adresli damlacık sulu bölümünde içinde yer.
    9. Microinjector kullanarak adresli damlacık hücreye dağıtmak. 10 nL adresli damlacık hacmi az % 1 oranında artacak.
    10. 2.2.5-2.2.9 nerede adresli damlacıkları bir hücre içeren bazı deneysel kontrol için serbest bırakarak kalan adresli damlacıkları için yineleyin.
      Not: tek hücreleri bir microcapillary ve micromanipulator kullanarak adresli damlacıkları yükleme için basit bir alternatif çözüm adım 1.2.8 algılama antikor %4 PBSA Web site içeren hücrelere 10 sırasına bir konsantrasyon, bir çözüm ile değiştirmektir 5 hücre/mL, 1 cep/10 için eşdeğer nL. Tek hücre doluluk Poissonian olacak ve hücre konsantrasyonu optimize edilmiş olması gerekir.
  3. Hücreleri ve görüntü dizi parçalayıcı
    1. Görüntü hücrelerde aydınlık alan mikroskobu, herhangi bir floresan görüntüleme dahil olmak üzere kullanarak damlacıkları.
      Not: Görüntüleme ~ 100 damlacıkları otomatik bir mikroskop kullanarak görüntü için yaklaşık 3 dakika sürer. Görüntüleme gerçekleştirmek 1,49 petrol-daldırma amacı ile 60 NA =. Hiçbir filtre Standart filtre kümeleri floresans görüntüleme için kullanılır, ancak aydınlık alan görüntüleme için gereklidir.
    2. Tek molekül TIRF mikroskobu kullanarak dizideki tüm noktalar görüntü.
      Not: Ayarları adım 2.3.1 ile özel bir TIRF kümesi filtre olarak kullanılır. Bu görüntüleri daha sonra bölümünde 3 tek moleküllerin her antikor spot lizis önce bağlı arka plan belirlemek için incelenecek. Toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi kullanarak tek molekül görüntüleme ~ 100 noktalar görüntü için yaklaşık 5 dakika sürer.
    3. Adresli bir damlacık hücrede odaklanmak. Bir tek 6 odaklanarak tam optik lizis elde ns lazer darbe (dalga boyu 1064 nm, nabız enerjileri 14,1 ± 0,3 µJ darbe başına) hücrenin konumu yakın.
      Not: Lazer darbe kadar genişleyen bir Kavitasyon kabarcık o makası hücre ayarlar ve hücresel bileşenlerinin damlacık ses özgür kılar. 4 , 31 mekanik işlemler nedeniyle lazer kaynaklı lizis düşük nabız enerjileri yağ-su arayüzü rahatsız etmeyin. Optik lizis genellikle 100 hücreleri parçalayıcı için yaklaşık 20-30 dakika sürer. Tartışma bölümünde açıklandığı gibi optik lizis kurulum mümkün değilse tek hücreleri parçalayıcı için alternatif yöntemler vardır.
    4. Nerede adresli damlacıkları un lysed bir hücre içeren 5 deneysel kontrol için özgür bırakarak tüm hücreyi içeren adresli damlacıkları için yineleyin.
    5. Hangi her hücre lysed zaman unutmayın.
      Not: Bu kez adım 3.1.9 her yerde için bireysel bağlama eğrileri düzeltmek için kullanılır. Sık sık kere ne zaman ilk ve son hücre lysed ve lizis olaylar arasında yeterince tutarlı bir zaman varsayarak dinlenme tahmin Not yeterlidir.
    6. Tek molekül görüntüleri ilk 30 dk sonra her 20 dk daha fazla 60 dakika için tüm noktalar her 10 min TIRF mikroskobu kullanarak elde. Equilibrium'da bağlı protein miktarı ilgilenen yalnızca, tüm noktalar küçük parça için oda sıcaklığında 90 dk kuluçka sonra görüntü.
      Not: damlacık hacmi ve tahlil kullanılan antikor benzeşim denge ulaşmak için zaman bağlı olacaktır. TIRF mikroskobu bir lazer uyarma kaynağı kullanarak gerçekleştirilir, 488 = nm ve bir optik güç metre kullanarak arka diyafram açıklığında ölçülen 1,5 mW güç. Satın alma ayarlarını 900 ms satın alma süresi, 16-bit sayısallaştırma 1 MHz okuma oranı EM-CCD kamera ayarlayarak tek molekül görüntüleri elde ve bir EM kazanç faktörü 10. İzolatör dikkatle coverslip kaldırarak yeniden kullanılabilir.

3. veri analizi

  1. Tek molekül (yığılması/dijital olmayan rejimi) sayma
    1. Fiji (veya Matlab) için herhangi bir antikor sıkışık olmayan nokta kullanarak lysis (arka plan, BKD) daha önce alınan resim yükleyin.
      Not: Aşağıdaki adımlarda operasyonlar delikanlı Fiji görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Bir kullanma kılavuzu aşağıdaki bağlantı https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html bulunabilir.
    2. Fiji'de, BKD görüntüyü seçin. "Görüntü" menüsü altında "Yinelenen" yinelenen BKD için seçin. Yinelenen görüntü seçin ve "işlem > filtreler altında", "Gaussian Blur" seçeneğini belirleyin ve 50 piksel yarıçapı belirtin.
    3. Böylece uyarma ışık kaynağı etkili Tekdüzen yoğunluk dağılımı BKD_FLAT üreten bulanık BKD görüntü tarafından BKD görüntü bölerek BKD Görüntüyü Düzleştir.
      1. Altında "Süreci" select "görüntü hesap makinesi...", "Böl", operasyon görüntüleri gerekli, belirtme ve kutuları "Oluştur yeni pencere" ve "32-bit (float) sonuç." seçerek
    4. Resimdeki her piksele 1 tarafından çıkarma ("işlem > Matematik", "Çıkarmak..." seçeneğini seçin ve 1 değerini belirtin). Ortalama piksel yoğunluğu 0 olmalıdır.
      Not: düzleştirme alanını seçin ve düzleştirilmiş arka plan resimleri kolayca tüm pikseller toplamı 0 olmalıdır ve kalan herhangi bir sapma daha delikanlı için telafi edilebilir beri kontrol.
    5. 50 piksel × 50 piksel alanını BKD_FLAT görüntü 4 köşe birini seçin. Piksel yoğunluğu Standart sapma (σ) "Analiz" ve "Ölçü" seçerek ölçmek.
      Not: Özet istatistikler seçimin sonuçları penceresinde sunulacak. Bu off-spot arka plan belirler tek moleküllerin yüksek yoğunluklu olması pek mümkün olduğu. Ölçülecek alan el ile varsayılan menü seçim araçlarını kullanarak seçilebilir veya makroyu çalıştırarak kodu "makeRectangle (x, y, genişlik, yükseklik)"; Bu dikdörtgen bir seçim oluşturur nerede x ve y bağımsız değişkenler sol üst koordinatlarını (piksel cinsinden).
    6. 3σ için görüntü eşik ayarlayın ve ikili resim SM_MASK oluşturun.
      1. "Görüntü > ayarı", altında "Eşik..." seçeneğini seçin ve 3σ için alt eşik düzeyini ayarlayabilirsiniz.
        Not: piksel değeri vardır eşiğin altına sıfır olarak ayarlanır ve eşiği aşan piksel 1 olarak küme. Eşik ile thresholded piksel için tek bir molekül ait güven belirleyecek.
    7. Kesimli resimdeki SM_MASK, set pixel yoğunluk değerleri sıfır bir Döngüsellik 0,5 - ve 4-9 pixel2 boyutu var mı herhangi bir nesne için "Analiz moleküller tarafından" 1 "Analiz" seçerek ardından ve boyutu ve ürün reçetesinde döngü belirtme.
      Not: Piksel boyutu diğer fluorophores ve mikroskop kümesi için optimize edilmiş olması gerekebilir ups. Kamera gürültü türü nedeniyle tek piksel bu eşiğin olabilir ve tek molekülleri olmama rağmen atılmak değil. Piksel boyutu ölçütü doğru böyle piksel iptal edecektir. Şeklinde genellikle dairesel tek moleküllerdir. Değeri 0 yaklaşıyor giderek uzun bir şekil gösterir, ancak tam bir daire 1 Döngüsellik değeri gösterir. Kalan nesneleri tek moleküllerdir ve sayılır. Bir maske nokta üzerinde ayırımcılık için yer alan ayırma için ayarlanmış olabilir ve nokta kapalı çerçeve başına sayar. Bu, daha sonraki zamanlarda alınan çerçeveleri için kolaydır sonra önceki kare için uygulanabilir bir yeterli sinyal nokta üzerinde olduğunda.
    8. Aynı sıkışık olmayan antikor nokta için yük ve bir zaman çözüldü serisi sonrası lizis alınan adımları 3.1.1 - 3.1.7 tüm görüntü kareleri için yakalanan tekrarlayın. 2.3.5. adımda kaydetti lizis kez kullanın. herhangi bir bağlama eğrileri düzeltmek için.
  2. Tek molekül (yığılması/analog rejimi) sayma
    1. Devam etmeden önce tek bir molekül ortalama yoğunluğunu hesaplamak için adımları 3.1.1 - 3.1.8 yineleyin.
    2. BKD_FLAT ve SM_MASK sayede sıfır piksel değerlerini tek molekülleri ile ilişkili bir görüntü üretmek için görüntüleri çarpın.
      1. Bu, "Süreci" menüsü altında gerçekleştirmek için "... görüntü hesap makinesi" seçin, "Multiply" işlemi ve gerekli görüntüleri belirtin ve seçin kutuları "Oluştur yeni pencere" ve "32-bit (float) sonuç."
    3. "Analiz" ve sonra "Ölçü"; seçerek tüm piksel yoğunluğu değerlerin toplamı Özet istatistikler seçimin sonuçları penceresinde sunulacak. Adım tek molekül başına ortalama yoğunluğu hesaplamak için 3.1.8 başı olarak sayılan tek molekül sayısı bölün.
    4. Herhangi bir kalabalık antikor spot için elde görüntüsü sonrası lizis yüklemek ve bir arka plan bulanık görüntü adım 3.1.2 ve 3.1.3 göre ile düzleştirin.
    5. Düzleştirilmiş resimdeki her piksele 1 tarafından çıkarma ("işlem > Matematik", "Çıkarmak..." seçeneğini seçin ve 1 değerini belirtin)
    6. Görüntü 4 köşe hiçbirinde 50 piksel × 50 piksel alanını seçin ve piksel yoğunluğu Standart sapma (σ) ölçmek. Adım 3.1.5 Ayrıntılar için bkz.
    7. 3σ için görüntü eşik ayarlayarak bir ikili görüntü maskesi oluşturma ve 4 piksel2herhangi bir nesne boyutu sıfır pixel yoğunluk değerleri ayarlayın. Bu, "Analiz" menüsü altında gerçekleştirmek için "analiz" seçen ve Döngüsellik ve boyutu belirtin.
    8. Düzleştirilmiş sıkışık antikor nokta görüntü ikili görüntü maskesi tarafından çarpın.
      1. Bu, "Süreci" menüsü altında gerçekleştirmek için "... görüntü hesap makinesi" seçin, "Multiply" işlemi ve gerekli görüntüleri belirtin ve seçin kutuları "Oluştur yeni pencere" ve "32-bit (float) sonuç."
    9. "Analiz" seçerek kalan piksel yoğunluklarda toplamı takip "Ölçü"; Özet istatistikler seçimin sonuçları penceresinde sunulacak.
    10. Piksel yoğunluklarda tek molekülleri sıkışık noktanın üzerine bağlı sayısını hesaplamak için Ortalama tek molekül yoğunluğu tarafından toplamı bölün.
  3. Kalibrasyon eğrisi için mutlak miktar
    1. Bölüm 1 ve 2 10 nL adresli damlacıkları algılama antikor ile bilinen konsantrasyon Rekombinant protein ile çivili %4 PBSA Web site çözüm oluşturmak için yineleyin.
    2. 10 konsantrasyon dizi yapmak2- 107 rekombinant proteinler tarafından bilinen konsantrasyon Rekombinant protein çözümü eklendi değişen damlacık başına. Bu proteinler ayarlı tek hücre veri basit yapmak için damlacık başına sayısı açısından iş için tavsiye edilir.
    3. Protein bereket damlacık başına ve uzantısı protein bereket tek hücre başına tarafından noktaya başına verilerini adımda 3.3.2 herhangi bir tek molekül kalibre sayar konsantrasyon serisi kullanmak.

Sonuçlar

P53 mutlak bazal protein kopya sayısı bir insan kolon kanseri hücre kültürünü, BE hücreleri tek hücre çözünürlük ile tespit edilmiştir. Biz nasıl p53 ifade büyüklükte birkaç emir üzerinde değişir ve hücre boyutu ve protein kopya sayısı içinde dinlenme BE hücre nüfus arasında bir zayıf pozitif korelasyon göstermek göstermek.

Sulu damlacıkları antikor spot yerlerde reçete ve yağ ile şapkalı a...

Tartışmalar

Adresli damlacık Microarrays kantitatif tek bir hücrede bulunan protein mutlak kopya sayısını belirlemek için hassas ve genişletilebilir bir yöntemdir.

Non-spesifik bağlama düzeyini sınırlama (NSB) bir sınır tespiti mümkün olduğunca düşük olarak ulaşmak için iletişim kuralına önemlidir. Protein ve diğer biyokimyasal türler özellikle sigara bağlamak için arabirimler damlacıkları içinde mevcut bir dizi — coverslip yüzey, antikor nokta ve yağ/su arabirimi. Pro...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

ASR deneyleri, protokolleri tasarlanıp geliştirildi veri analiz. SC ve PS hücre boyutu deneyleri yürüttü. ASR ve OC el yazması yazdı. Yazarlar minnetle Prof. David R. Klug destek ekipman erişim sağlamak için kabul etmek istiyorum. Yazarlar Imperial College gelişmiş Hackspace imalat ve prototip oluşturma özellikleri erişim için teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Life Technologies10010015
DMEM high glucoseSigmaD6429
Foetal Bovine Serum (FBS)BiochromS0115
cell culture flasksCorningSIAL0639
Trypsin/EDTABiochromL2153
NameCompanyCatalog NumberComments
Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab, UKOmniGrid Micro
Microcontact pinArrayIt, USA946MP2
Coverslips (Nexterion)Schott, Europe1098523Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibodyEnzoADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelledSanta Cruzsc-126stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate bufferGibco15557-044
BetaineSigma61962
Sodium dodecyl sulphateSigmaL3771
384 well plate (low volume)SigmaCLS4511
Nitrogen gas cylinderBOCIndustrial grade, oxygen-free
NameCompanyCatalog NumberComments
Droplets
MicromanipulatorEppendorfPatchman NP2
Manual MicroinjectorEppendorfCellTram Vario
MicropipetteOrigio, DenmarkMBB-FP-L-0
Syringe pumpsKD ScientificKDS-210
100 μL syringeHamilton81020Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringeHamilton81327Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolatorGrace Bio-LabsJTR24R-A-0.56x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutterVersaLASEVLS2.30 CO2 Laser 3Wfor laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheetWeatherall-UKClarex Precision Sheet 001for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet3Mused to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glueLoctiteLOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubingIDEXFS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubingIDEX1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubingKinesis008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubingIDEX1673
Bovine Serum Albumen (BSA)Fisher ScientificBP9700100
Mineral oilSigmaM5904
Ultra-pure waterMillipore, GermanyMilliQ
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stageNikon, JapanNikon Ti-E
EM-CCDAndor Technologies, IrelandIXON DU-897E
Laser excitation sourceVortran, USAStradus 488-50
Optical lysis laser sourceContinuum, USASurelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRFChroma, USAz488bp
Microscope filter cube for Optical LysisLaser 2000, UKLPD01-532R-25
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
FijiOpen SourceImage analysis software
MatlabMathworksversion 7.14 or higherImage analysis software

Referanslar

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarsay 137damlac k havaciliktek h cre proteini analizheterojenlikhavacilikdamlac klarmutlak miktarp53h cre boyutu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır