JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים מיקרו droplet למיעון-מערכים (עיוותים), שיטה מערך מבוסס droplet מסוגל לקבוע חלבון מוחלטת שפע תאים בודדים. נדגים את היכולת של ארכיון דיגיטלי כדי לאפיין את הטרוגניות בביטוי של p53 חלבון משתיק קול גידול בקו תאים סרטניים אנושיים.

Abstract

לעיתים קרובות הסלולר התנהגות ותגובות הסלולר מנותחים ברמת האוכלוסייה שם התגובות של תאים רבים הם איחדו יחד בתור תוצאה הממוצע מטשטשים את אופן הפעולה של תא בודד עשיר בתוך אוכלוסיה מורכבת. טכנולוגיות זיהוי, כימות של חלבון תא בודד הפכו את השפעה מדהימה בשנים האחרונות. כאן נתאר פלטפורמה ניתוח תא בודד פרקטי ומודולרי המבוסס על מיקרו-מערכים למיעון droplet. מחקר זה מתאר כיצד ניתן למדוד את המספרים העתקה מוחלטת של חלבונים היעד ברזולוציה של תא בודד. P53 משתיק קול גידול הוא גן שעבר מוטציה הנפוצות ב סרטן אנושי, עם יותר מ- 50% של מקרי סרטן הכולל מפגין דפוס ביטוי p53 שאינם בריאים. הפרוטוקול מתאר את השלבים ליצירת 10 טיפות nL שבתוכו תאים סרטניים אנושיים יחיד מבודדים, המספר עותק של החלבון p53 נמדדת ברזולוציה של מולקולה בודדת כדי לקבוע במדויק ההשתנות בביטוי. ניתן להחיל את השיטה לכל סוג התא כולל חומר ראשוני כדי לקבוע את המספר המוחלט עותק של חלבונים היעד בכל עניין.

Introduction

המטרה של שיטה זו היא לקבוע את הווריאציה בשפע של חלבון המטרה באוכלוסיה תא ברזולוציה של תא בודד. ניתוח תא בודד מספק מספר יתרונות שאינם זמינים עם שיטות ביוכימיות הרכב המסורתי. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . ראשית, עבודה ברמה תא בודד יכול ללכוד את הטרוגניות עשיר של אוכלוסיית תאים אחרת אהיה אבודה על ידי חישוב ממוצע המתרחשת עם טכניקות הביוכימי הרכב המסורתי. רוב שיטות ביוכימיות סוס עבודה לעבוד עם הנפח, המחייב, כמו שעושים בדרך כלל, מיליוני תאים כדי לקבל תוצאה. כמובן, ההשלכות של הערכת אוכלוסיות התא כולו תלוי במספר גורמים, לדוגמה, את הטרוגניות בביטוי חלבונים בו כמה תכונות חשובות של ההתפלגות של חלבון שפע עשויים לפספס. מנקודת מבט מעשית, הרגישות הדרושה של תא בודד טכניקות להפוך אותם מסוגלים לעבוד עם כמויות של חומר ביולוגי אינו מספיק אפילו טכניקות בכמות גדולה יותר רגיש לתפקד. דוגמה מפתח היא המחקר של סוגי תאים נדירים כגון מחזורי תאים סרטניים (CTCs) שבו גם עבור חולים עם השקפה prognostic מסכן פחות מ 10 CTCs עשוי להיות נוכח דם בודדת 7.5 mL לצייר. 6 . נציג המתודולוגיה הדרושים לביצוע מדידות חלבון תא בודד באמצעות אמצעי אחסון מופחת נוגדן מבוססי assay העסקת טיפות שמן הכתיר מודפס על microarray נוגדן.

Microfluidic droplet פלטפורמות הם תפוקה גבוהה, מסוגל לייצר אלפי טיפות לכל השנייה, יכולת אנליטית, אפילו culturing, תאים בודדים טיפות בודדות כדי לבצע מגוון רחב של מבחני הביוכימי. טכניקות מבוססות droplet מתאימים היטב לניתוח תא בודד,7,8,,9 , עם דוגמאות הבולטים האחרונים כולל DropSeq10 ו- inDrop11, אשר יש בגילויים באופן משמעותי בכוח טכניקות הגברה. את כמות מוגבלת של חומר ושיטות אין של הגברה חלבונים להפוך לתא בודד פרוטאומיקס מאתגר במיוחד.

טיפות עשוי להיות מנותח על ידי מספר שיטות, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות כבר בשימוש נרחב. מולקולה בודדת טכניקות כגון מיקרוסקופ גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF) מאפשר מולקולות פלורסנט, ניתן לאבחן עם יחס אות לרעש ללא תחרות. 12 עקב דעיכה מעריכית השדה evanescent, רק fluorophores בסמיכות גבוהה על פני השטח (סדר 100nm) נרגשים ביצוע TIRF אסטרטגיה טובה מזהה כמויות קטנות של מולקולה היעד תערובת מורכבת. החוזק הפנימי אופטים אופטי של TIRF גם מסייעת להימנע שטיפת מדרגות, וזמינותו מגבלות הזמן והמורכבות. עם זאת, TIRF דורש משטחים מישוריים, דוגמאות של מיקרוסקופ TIRF חלה על טיפות בזרימת לערב היווצרות של משטח מישורי אשר לתמונה. 13 למטרה זו, תא בודד פרוטיאומיה מבנית טכניקות לעיתים קרובות עיצוב microfluidic צ'יפס סביב סוכני השטח. מרותק למיטה לכידה בפורמט microarray. 4 , 14

טיפות, עצמם, עשוי להיווצר מערכים על משטחים מישוריים, מיקרו-מערכים droplet כביכול. 15 , 16 , 17 במרחב ארגון טיפות לתוך מערכי מאפשר להם להיות נוח ליצור אינדקס, בקלות במעקב לאורך זמן, באופן אינדיבידואלי התייחס ולאחזר, במידת הצורך. מיקרו-מערכים droplet ניתן להשיג צפיפות גבוהה של מיקרו-כורים עם אלפי רכיבים לכל שבב שעמד חופשי או נתמך על-ידי microwell מבנים. 18 , 19 , 20 . הם עשויים להיווצר על ידי התצהיר רציפים ע י טיפול בנוזלים רובוטים, הזרקת דיו יבחינו פנה microarrayers21,22,23,24,25, 26 , או שהם יכולים להרכיב עצמית על משטחים כגון superhydrophillic כתמים בדוגמת על משטח superhydrophobic. 27 , 28 , 29

עם שיקולים אלה בחשבון, Droplet למיעון מיקרו-מערכים (עיוותים) תוכננו כדי לשלב את צדדיות, מיעון המרחבי ואמצעי אחסון מופחת של מיקרו-מערכים droplet עם הרגישות של מולקולה בודדת מיקרוסקופ TIRF כדי באופן כמותי למדוד חלבון שפע. 5 ארכיון דיגיטלי מאפשרים ניתוח תא בודד ויוצרים microarray droplet המכיל תאים בודדים מעל microarray נוגדנים, אשר הוא אז הכתיר בשמן כדי למנוע אידוי. נפחי טיפות הם נפרדים כדי למנוע הפסד דגימה אחרת תושג ע י על שבב valving ב מיקרופלואידיקה זרימה רציפה. 30 כמות חלבון המטרה של תא בודד המוחלט הוא קטן מאוד; עם זאת, נפח מופחת טיפות מאפשר ריכוז מקומי גבוה יחסית כדי בכך שהם מזוהים באמצעות assay נוגדן של כריך - נוגדן הוא משותק באזור ברורים, או נקודה, על משטח אשר לוכדת חלבון אשר בתורו מאגד כדי fluorescently עם תוויות ברורות זיהוי נוגדנים נוכח האחסון droplet. כמו ללא תווית בגישה (כלומר חלבון מטרות לא צריך להיות מתויג ישירות), ארכיון דיגיטלי הם חלים באופן כללי על ניתוח תאים ממקורות ראשוניים, כגון דם מעובד, בסדר צריך aspirates הפומבית הגידול ביופסיות, כמו גם תאים מתרבות, lysates שלהם.

מדידת וריאציית בשפע חלבון לרוחב אוכלוסיה תא חשוב בקביעת את הטרוגניות בתגובה, לדוגמה, את הסם, יסייעו במתן תובנה תאיים מסלולים, הערכת subpopulations שלהם התנהגות כמו גם לזהות אירועים נדירים אחרת להיות רעולי פנים על ידי שיטות בצובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפיק ולהשתמש מיקרו-מערכים למיעון droplet כדי לקבוע באופן כמותי של השפע p53 פקטור שעתוק בתאים סרטניים אנושיים, עשוי לשמש כדי לחקור את התפקיד של p53 בתגובה תרופות כימותרפיות. חלבון המטרה נקבעת על-ידי הבחירה של נוגדנים לכידת וזיהוי, עשוי להיות שונה כדי לכלול יעדים שונים או יותר. ההוראות מסופקות כדי לבנות מנגנון פשוט שילוב זרבובית קונצנטריים מ ציוד מעבדה כללי כדי באופן ידני מערך 10 טיפות nL כתרים עם שמן. התהליך הניסויי מלא מתואר לפיה לכל droplet ואז נטען עם תא בודד, אשר לאחר מכן lysed, הביטוי של חלבונים נקבע עם רזולוציה מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Protocol

1. הכנה

  1. להפוך את שבבי מיקרו-מערכים נוגדן הדפסה
    1. לצרף של דבק סיליקון/אקריליק isolator coverslip functionalized כדי לתמוך microarray של נוגדן. זה נקרא את השבב.
      הערה: בדיקות משטח שונים, הביוכימיה נבדקו להתאמתם עם טיפות למיעון. 5 בדיקות משטח, הביוכימיה ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור לכידת חלופי סוכנים. ADM קתודית זמינים מסחרית או יכול להיות מיוצר על ידי חיתוך לייזר אקריליק (CAD קובץ עבור isolator נעשה שימוש בעבודה זו ניתנת להורדה; ראה קובץ קוד משלים).
    2. . הפעילי את microarrayer ולהגדיר את הלחות 75%.
      הערה: לחות יחסית מצמצמת אידוי של פתרון הדפסה מ מהמוט microarray והקטנת וריאציה אינטרה - ולא בין - spot.
    3. לנקות את הסיכה microarray ב- pin ניקוי פתרון עבור 5 דקות על-ידי ultrasonication. לשטוף את ה-pin עם מים אולטרא טהורים באמצעות בקבוק לשטוף, לייבש בעזרת חנקן.
      הערה: להשעות את ה-pin באשר רק לטבול את הטיפ pin. שקופית מיקרוסקופ עם קבוצה כראוי קדיחת חורים יעזור אם אין אפשרות להשיג בעל פין.
    4. להפוך 5 מ של מאגר ההדפסה הכוללת 3 × תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) מאגר, betaine 1.5 M בתוספת 0.01% נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות). לאחסן ב 4 ° C ללא הגבלת זמן.
    5. כדי להכין פתרון ההדפסה, להפשיר נוגדן anti-p53 (p53/Mdm2 אליסה קיט; לראות את הטבלה של החומרים) aliquots המאוחסן ב- 80 ° C מערבבים את זה 1:1 עם מאגר ההדפסה כדי ריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל. לטעון µL 5-10 של פתרון הדפסה בצלחת 384 טוב-שימוש micropipette ולמקם microarrayer.
    6. לטעון צ'יפס בשלב 1.1.1 לצרפן את microarrayer. לתכנת את microarrayer כדי להדפיס כתמים בנקודות הציון שהוגדרו על-ידי המרכז של כל טוב של isolator.
      הערה: Microarrayers להעסיק מגוון, בעיקר, תוכנה קניינית הקורא הוא מומלץ להתייעץ עם הספרות הרלוונטית. Microarray הדרושות את isolator ADM נבחרים בקובץ CAD הנלווה בשלב 1.1.1 כוללת של אלמנטים מלבניים; המרחקים הרלוונטיים הינם מסופקים.
    7. לאחסן את האסימונים במיכלים אטום, לעטוף בנייר כסף. לאחסן ב 4 ° C עד 6 שבועות.
      הערה: רדיד האלומיניום היא כדי למנוע נזק צילום. אחסון ב 4 ° C מגביל את קצב השפלה של מולקולות ותגובות ברישול כלשהו כי רשאית לפעול כדי לצמצם את פעילות microarray. אטום לאוויר מאפשר השבבים equilibrate לטמפרטורת החדר לפני השימוש ללא עיבוי ויוצרים על פני שבב. צור קשר עם מתח הפנים של תוכנות המנצלות לרעה את ההדפסה microarray והצמדות בין הפתרון הדפסה מצע ההדפסה כדי לייצר נקודות. טרום הדפסה או סופג נדרש בדרך כלל כדי להסיר עודפי פתרון ה-pin microarray להניב מקומות ושקעים בגודל. אל תמחק את coverslip מראש ההדפסה ההקרבה מאז זה יכול לשמש כדי להעריך את איכות אצווה.
  2. הכנת מזרקים, tubing ו קונצנטריים זרבובית עבור dispensing למיעון טיפות
    1. לפרק µL 100 (עבור ה-droplet מימית) ו 1 מ"ל (עבור הנפט הגבלת התכיפות) זכוכית המילטון מזרקים ולשטוף חלקים עם מזוקקים H2O.
    2. להאכיל 100 מ מ אורך 150 מיקרומטר מזהה/360 מיקרומטר OD התמזגו סיליקה אבובים דרך באורך 40 מ מ של 1.0 מ מ ID/1/16 "OD מחברים לצנרת עד זה בולט על ידי 2 מ מ. זה יהוו הזרבובית קונצנטריים.
    3. למרוח שכבה דקה של דבק מגע דבק לסוף טיפ פיפטה 10 µL ולהוסיף לתוך פיסת 40 מ מ 1.0 מ מ ID/1/16 "OD מחברים לצנרת. אם נדרש, למקם מחדש את הצנרור fused סיליקה כדי לשמור על בליטה 2 מ מ- הצינור לפני הצילומים דבק.
    4. להכניס את הקצה השני של סיליקה fused נימי בסוף באורך 200 מ מ של 0.014" מזהה/0.062" כמנת PTFE אבובים, להתחבר זה µL 100 המילטון מזרק מלא עם 4% אלבומין בסרום שור (BSA) בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) (PBSA).
      הערה: חלבונים ו מינים אחרים הביוכימי עלול להיקשר הלא ספציפית משטחים, יכול להיות אבד או שפגע בסימני. BSA משמש "לחסום" את משטחי כדי למזער מחייב שאינם ספציפיים על-ידי איגוד sacrificially שמשטחים אלה.
    5. הכנס אורך 400 מ 1.0 מ מ ID/2.0 מ מ OD FEP אבובים טיפ פיפטה 200 µL עד להיווצרות גושפנקה. למרוח שכבה דקה של דבק מגע דבק עוד 200 µL קצה פיפטה, לדחוף את זה לתוך הטיפ הראשון לתקן את הצנרת במקום. חבר את הקצה הפתוח של הצנרת OD FEP 1.0 מ מ מ מ ID/2.0 1 מ"ל המילטון מזרק מלא שמן מינרלי.
    6. הכנס את מכלול עצה פיפטה µL 200 10 µL פיפטה קצה הזרבובית קונצנטריים. מקום של המזרקים משאבות מזרק נפרד כפי שהם יצטרכו להיות מופעל באופן עצמאי.
    7. למלא את המזרק 100 µL PBSA 4% פתרון חסימה. לצרף ותורידי את הצנרור 'מימית' עם הפתרון חסימה. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של ריקונים 3.
    8. למלא את המזרק 100 µL 0.125 µg מ ל-1 זיהוי נוגדנים (anti-p53 נוגדנים (דו-1) עם אלקסה 488) ב 4% PBSA, אבובים לצרף מחדש. החלפת פתרון חסימה באבובים על-ידי 25 שחולק µL זיהוי נוגדנים פתרון.
    9. לרוקן את הצנרור 'שמן' עם שמן מינרלי עד אבובים כל הצינור ממלא עם שמן. למלא את המזרק 1 מ"ל עם שמן מינרלי וצרף מחדש אבובים. המאבטחים את מכלול אבובים ו זרבובית מניפולטור XYZ.
  3. להכין microinjector micromanipulator
    הערה: השלבים להלן התייחסות ספציפית רכיבים של microinjector ו- micromanipulator מכשיר המצוין בטבלה של החומרים, אך הם חלים באופן כללי על כל מכשיר כזה.
    1. להרכיב את microinjector על-ידי הצמדת לאורך צינור לחץ, בעל נימי.
    2. לאט סובב את החוגה בוכנה עד שמן מינרלי לחלוטין ממלא את הקו.
    3. הר בעל נימי לתוך הר הראש התרגום.
    4. לתקן את נימי בעל נימי עם ראש אחיזה.
    5. Pipette פתרון של 4% PBSA באחת הבארות של isolator.
    6. לתרגם באמצעות את micromanipulator, לטבול את קצה נים אל הפתרון.
    7. לאט לאט למלא את נימי 4% PBSA ולהשאיר לחסום למשך 10 דקות.
    8. הוצא את microcapillary, המסתובב המודול תרגום כך ההרכבה היא ברורה של השבב.

2. יוצרים טיפות למיעון ו'טען עם תאים בודדים

  1. טיפות למיעון טופס
    1. אבטח את השבב על הבמה מיקרוסקופ.
      הערה: המיקרוסקופ הנו זריחה הפוך אוטומטית מיקרוסקופ המסוגל מולקולה בודדת TIRF מצויד שלב XY מקודד של אלקטרון הכפלת תשלום מצמידים מכשיר המצלמה (EM-CCD).
    2. להקליט את נקודות הציון של מיקרוסקופ הבמה של כל מקום במערך באמצעות התוכנה שליטה אוטומטית מיקרוסקופ.
    3. הגדר XYZ manipulator על הבמה מיקרוסקופ. המקום הזרבובית בזווית של 50-60 מעלות. ודא כי הצינור יש אורך מספיק אישור כדי להגיע את השבב. הגדר 'מימית' ואת 'שמן' מזרק משאבות כדי לוותר על 10 nL-µL 100/min ו- µL 5 ב 100 µL/דקה, בהתאמה.
      הערה: במהלך ההכנה, הפתרון מימית בראש הצינור עשוי יבש.
    4. לוותר על תמיסה מימית עד חרוז של נוזל יהיה גלוי על ראש הזרבובית. Dab עם אבק חינם לנגב כדי להסיר אותו.
      הערה: בהתאם למספר תנאים תחת חקירה, שומרים במספר בארות כדי לשמש מאגרים עבור תאים. קו/סוג של תא בודד מאגר יחיד יהיה מספיק.
    5. באמצעות תוכנת שליטה במיקרוסקופ אוטומטי, הגדר הקואורדינטות הבמה מיקרוסקופ נקודת נוגדנים ב- array ופוקוס על פני השטח coverslip.
    6. תיזהר שלא להפריע במקום, באמצעות XYZ manipulator, יישר את זכוכית נימי קצה הזרבובית קונצנטריים לצד של המקום נוגדן, לוותר על 10 nL של תמיסה מימית. מבלי להזיז את השלבים, לוותר על 5 µL של שמן וחוץ של תמיסה מימית. לאט לאט להעלות את הזרבובית ברורה של ה-droplet, מעבר לשני טוב.
    7. חזור על צעד 2.1.6 כל המקומות הנוגדן במערך.
    8. לאחר 30 דקות, תמונה כל נקודות במערך באמצעות התוכנה שליטה אוטומטית מיקרוסקופ כדי לקבוע את הרקע של מולקולות יחיד חייב כל נוגדן ספוט לפני טעינת תאים.
  2. לטעון למיעון טיפות עם תאים
    1. להסיר את המבחנות תרבות תא החממה ולנתק תאים באמצעות פתרון טריפסין/EDTA.
      הערה: במחקר זה, להיות האדם הגס קרצינומה של תא הקו שימש ותרבותית באמצעות של Dulbecco ששינה נשרים בינוני (DMEM) בתוספת 10% (v/v) בהריונות שור סרום (FBS) בחממה2 CO.
    2. אם נדרש, fluorescently כתם תאים.
      1. Resuspend התאים בפתרון של 0.125 μg/mL זיהוי נוגדנים (anti-p53 נוגדנים (דו-1) עם אלקסה 488) ב 10% FBS בתקשורת L-15. כדי להבטיח השעיה תא בודד, לסנן את הפתרון הסלולרי דרך מסננת תא גובה 40 µm.
    3. לספור תאים באמצעות hemocytometer לדלל או להתרכז הפתרון תא ריכוז של 25-400 × 103 תאים/mL.... דבר זה מבטיח את המשקע תאים עם מרווח מספיק כדי לתפעל בנוחות את microcapillary.
    4. לטעון תאים בודדים לתוך טיפות למיעון מן המאגר תא שימוש micromanipulator ו- microcapillary.
      הערה: התאים שאינם מחסידי עשוי להיות טעון בכמויות לתוך micropipette, בגליל אחד אחד לתוך טיפות למיעון. למרות הטיפול בחסימת משטח, נוטים שורות תאים חסיד הלא ספציפית להיצמד לקיר פנימי של microcapillary זכוכית. ולהיות אבוד.
    5. באמצעות מטרה × 10 כדי להתבונן, להשתמש microinjector את האחות תא בודד לתוך microcapillary מן המאגר התא.
    6. לאחסן את הקואורדינטות הבמה micromanipulator אם משתמש שלב מניפולטור אלקטרונית או לציין באופן ידני את z-מיקום.
    7. משכי את micropipette על ידי מתרגם את זה כלפי מעלה כדי לנקות את גובה 1 מ"מ של השבב. לבצע זאת באופן ידני עם ג'ויסטיק או באופן אוטומטי באמצעות התכונה 'הוצאה' של שלב מניפולטור אלקטרונית.
    8. מערכת שהבמה מרכזת כדי כי של droplet למיעון באמצעות אוטומטית תוכנות שליטה מיקרוסקופ. 'להחדיר' את micropipette על ידי להחזירו למצב מאוחסנות (או ציין) z. לבצע פעולה זו באופן ידני עם ג'ויסטיק או באופן אוטומטי אם משתמש שלב מניפולטור אלקטרונית.
      הערה: microcapillary לנקב את השמן הגבלת התכיפות, להיות ממוקם בתוך החלק מימית של ה-droplet למיעון.
    9. לוותר על התא ה-droplet למיעון באמצעות את microinjector. הנפח של droplet למיעון nL 10 יגדל ב- פחות מ 1%.
    10. חזור על 2.2.5-2.2.9 טיפות למיעון הנותר עוזב חלק בחינם עבור הפקד ניסיוני כאשר טיפות למיעון אינה מכילה תא.
      הערה: אלטרנטיבה פשוטה loading תאים בודדים טיפות למיעון באמצעות microcapillary micromanipulator היא להחליף את הפתרון בשלב 1.2.8 עם פתרון של זיהוי נוגדנים ב 4% PBSA תאים המכילים על ריכוז גודל 10 5 תאים למ"ל, שווה ערך ל תא 1/10 nL. תפוסה של תא בודד יהיה Poissonian, הריכוז התא יהיה צורך ניתן למטב.
  3. Lyse תאים ומערך תמונה
    1. התמונה בתאים טיפות באמצעות מיקרוסקופ brightfield, כולל כל הדמיה זריחה.
      הערה: הדמיה לוקח כ 3 דקות לשיקוף ~ 100 טיפות שימוש במיקרוסקופ אוטומטי. לבצע הדמיה עם נה 60 = 1.49 שמן-טבילה אובייקטיבי. אין מסננים נדרשים עבור brightfield imaging ואילו מערכות סינון סטנדרטי משמשים עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה.
    2. תמונה כל נקודות במערך באמצעות מיקרוסקופ TIRF מולקולה בודדת.
      הערה: ההגדרות משמשים כמו בשלב 2.3.1 עם TIRF מיוחדים לסנן סט. תמונות אלה ינותחו בהמשך בסעיף 3 כדי לקבוע את הרקע של מולקולות יחיד חייב בכל מקום נוגדנים לפני פירוק. מולקולה בודדת הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה לוקח כ 5 דקות לשיקוף ~ 100 נקודות.
    3. מתמקדים תא droplet למיעון. להשיג פירוק אופטי מלא על ידי התמקדות 6 יחיד ns בלייזר דופק (באורך גל 1064 ננומטר, הדופק אנרגיות 14.1 ± 0.3 µJ לפי הדופק) סמוך למקום של התא.
      הערה: הדופק לייזר מגדיר בועת קוויטציה ולהרחיב את המזמרה התא, משחררת הסלולר המרכיבים לתוך האחסון droplet. 4 , 31 התהליכים מכני עקב פירוק לייזר המושרה לא להפריע הממשק שמן מים-דופק נמוך אנרגיות. פירוק אופטי בדרך כלל לוקח כ- 20-30 דקות כדי lyse תאים 100. כפי שפורט בסעיף הדיון, ישנן מספר שיטות אלטרנטיביות למניעת lyse תאים בודדים אם פירוק אופטי ההתקנה אינה אפשרית.
    4. חזור על כל התאים המכילים למיעון טיפות עוזב 5 חינם עבור הפקד ניסיוני כאשר טיפות למיעון מכילה תא lysed האו ם.
    5. הערה בפעם שבו כל תא הוא lysed.
      הערה: בזמנים אלה ישמש כדי לתקן מחייב בודדים עיקולים על כל מקום בשלב 3.1.9. לעתים קרובות זה מספיק לציין את הזמנים כאשר התאים הראשונים והאחרונים הם lysed, מעריכים את השאר בהנחה תקופה מספקת עקביות בין אירועי פירוק.
    6. לרכוש תמונות מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ TIRF של כל נקודות בכל 10 דקות עבור הראשון 30 דקות ואז כל 20 דקות במשך 60 דקות נוספות. אם רק מעוניינים בכמות החלבון מאוגדים ב שיווי משקל, תמונה כל נקודות לאחר המקננת השבב במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: הזמן להגיע שיווי משקל תלוי droplet ונפח את הזיקות של הנוגדנים בשימוש וזמינותו. מיקרוסקופ TIRF מתבצעת באמצעות מקור עירור לייזר ב = 488 ננומטר ו 1.5 mW הספק כפי שנמדד על הפתח האחורי באמצעות מד הכוח האופטי של. מולקולה בודדת תמונות נרכשים על-ידי הגדרת ההגדרות רכישת המצלמה EM-CCD 900 ms רכישת זמן, 16-bit דיגיטציה בקצב readout 1 מגה-הרץ ולהשיג EM פקטור של 10. Isolator ניתן להשתמש מחדש על-ידי הסרת בקפידה את coverslip.

3. ניתוח נתונים

  1. מולקולה בודדת סופר (משטר שאינו דחוס/דיגיטליים)
    1. באמצעות פיג'י (או Matlab), מכל מקום שאינו דחוס נוגדן, לטעון את התמונה רכשה לפני פירוק (רקע, BKD).
      הערה: הפעולות בשלבים הבאים אבר המין הגברי מתבצעות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה פיג'י. מדריך למשתמש יכול להימצא ב https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html הבא הקישור.
    2. ב פיג'י, בחר את התמונה BKD. תחת תפריט "תמונה" בחר "כפולים" כדי BKD כפולים. בחר את התמונה כפולים, תחת 'תהליך > המסננים', בחר 'טשטוש לפי עקומת גאוס' וציין ברדיוס של 50 פיקסלים.
    3. לשטח את התמונה BKD, שהוא הפצה יעילה בעוצמה אחידה של מקור האור עירור חלוקת התמונה BKD לפי תמונה מטושטשת BKD, הפקת BKD_FLAT.
      1. תחת "תהליך" בחר "תמונת מחשבון...", המציין את הפעולה "לחלק", הדימויים נדרש, ולאחר בחירת תיבות "יצירת חלון חדש" ו- "32-bit (float) תוצאת."
    4. לחסר כל פיקסל בתמונה 1 ("תהליך > מתמטיקה", בחר "לחסר...", ציין ערך של 1). עוצמת הפיקסלים הממוצע צריך להיות 0.
      הערה: שדה שיטוח, תמונות רקע שעברו שיטוח ניתנים לבדיקה בקלות מאז הסכום של כל הפיקסלים צריך להיות 0 ואת כל היסט הנותרים עשויים להיות מתוגמלים יותר אבר המין הגברי בגין.
    5. בחר אזור פיקסל פיקסל 50 × 50 בכל אחד 4 הפינות של תמונת BKD_FLAT. למדוד את סטיית תקן עוצמת פיקסל (σ) על-ידי בחירת 'נתח' ו "מדידה".
      הערה: נתוני סיכום סטטיסטיים של הבחירה יוצגו בחלון תוצאות. אפשרות זו קובעת את נקודת הרקע שבו יש סביר צפיפות גבוהה של מולקולות יחיד. האזור שברצונך למדוד ייתכן באופן ידני נבחרה באמצעות כלי הבחירה תפריט ברירת המחדל או על-ידי הפעלת המאקרו קוד "makeRectangle (x, y, רוחב, גובה)"; זה יוצר בחירה מלבנית, שבו x ו- y הם הקואורדינטות (בפיקסלים) של הפינה השמאלית העליונה.
    6. להגדיר את הסף תמונה 3σ וליצור תמונה בינארית SM_MASK.
      1. תחת "תמונה > להתאים", בחר "הסף..." ולהגדיר את רמת הסף התחתון 3σ.
        הערה: פיקסלים שערכו הם מתחת לסף מוגדרים לאפס ומוגדרים 1 פיקסלים העולה על הסף. הסף יקבע את הביטחון שבה פיקסלים thresholded שייכים מולקולה בודדת.
    7. בתמונה מקוטע SM_MASK, פיקסל להגדיר ערכי העוצמה לאפס של כל האובייקטים שאינם בעלי גודל של 4-9 פיקסל2 ו של מעגליות של 0.5 - 1 על-ידי בחירה "לנתח" ואחריו 'חלקיקים לנתח' וציון מעגליות וגודל.
      הערה: גודל פיקסל ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור אחרים fluorophores ו מיקרוסקופ סט ups. בשל הסוג של רעש המצלמה פיקסלים בודדים עשוי להיות מעל לגודל הסף הזה, לא להיות מושלך למרות שאינו מולקולות יחיד. הקריטריון גודל פיקסל ימחק כראוי כזה פיקסלים. מולקולות יחיד הם בדרך כלל מעגלית בכושר. הערך מעגליות 1 מציין עיגול מושלם בעוד ערך מתקרב 0 מציין צורה מוארכת יותר ויותר. האובייקטים שנותרו מולקולות יחיד, אולי אפשר לסמוך. ניתן להגדיר מסיכת לתיחום האזור של הנקודה להפלות עמדות וסופרת את נקודת לכל מסגרת. זה קל עבור מסגרות רכשה ובזמנים מאוחרים כאשר יש אות מספיק עמדות אשר יכול להיות מיושם על מסגרות קודמות.
    8. על אותו מקום שאינו דחוס נוגדן, לטעון וחזור על שלבים 3.1.1 - 3.1.7 עבור כל תמונה מסגרות שנלכדו כפי סדרה זמן לפתור שנרכשה פוסט פירוק. השתמש את הזמנים פירוק שרשמת בשלב 2.3.5. כדי לתקן כל עקומות מחייב.
  2. מולקולה בודדת סופר (המשטר דחוס/אנלוגי)
    1. על מנת לחשב את העוצמה הממוצעת של מולקולה בודדת, לפני שתמשיך, חזור על שלבים 3.1.1 - 3.1.8.
    2. הכפל את התמונות BKD_FLAT ו- SM_MASK להפקת תמונה לפיה ערכי אפס פיקסלים משויכים מולקולות יחיד.
      1. כדי לבצע זאת, תחת תפריט "תהליך", בחר תמונת מחשבון...", ציין את הפעולה"להכפיל"ואת התמונות הנדרשות, בחר את תיבות"יצירת חלון חדש"ואת"32-bit (float) תוצאת."
    3. סכום כל ערכי הפיקסלים בעוצמה על-ידי בחירת 'נתח', ולאחר מכן "מידה"; נתוני סיכום סטטיסטיים של הבחירה יוצגו בחלון תוצאות. מחלקים את מספר מולקולות יחיד שנספרו לפי שלב 3.1.8 כדי לחשב את העוצמה הממוצעת לכל מולקולה בודדת.
    4. עבור כל נוגדן גדוש ספוט, לטעון את התמונה רכשה שלאחר פירוק ולשטח עם תמונת רקע מטושטש לפי שלבים 3.1.2 ו- 3.1.3.
    5. לחסר כל פיקסל בתמונה שעברו שיטוח ב- 1 ("תהליך > מתמטיקה", בחר "לחסר...", ציין ערך של 1)
    6. בחר אזור פיקסל פיקסל 50 × 50 בכל אחד 4 הפינות של התמונה ולמדוד את סטיית תקן עוצמת פיקסל (σ). ראה שלב 3.1.5 לפרטים.
    7. ליצירת מסיכה ותמונה בינארית על-ידי הגדרת סף התמונה 3σ, ערכי העוצמה פיקסל מוגדר כאפס של אובייקטי עם גודל פיקסל פחות מ 42. כדי לבצע זאת, תחת התפריט 'נתח', בחר 'חלקיקים לנתח' וציין את גודל ואת מעגליות.
    8. הכפל את התמונה ספוט נוגדן גדוש שעברו שיטוח על-ידי המסכה תמונה בינארי.
      1. כדי לבצע זאת, תחת תפריט "תהליך", בחר תמונת מחשבון...", ציין את הפעולה"להכפיל"ואת התמונות הנדרשות, בחר את תיבות"יצירת חלון חדש"ואת"32-bit (float) תוצאת."
    9. סכום של עוצמות פיקסל הנותרים על-ידי בחירה "לנתח" ואחריו "מידה"; נתוני סיכום סטטיסטיים של הבחירה יוצגו בחלון תוצאות.
    10. לחלק את הסכום של פיקסל עוצמות מאת העוצמה הממוצעת מולקולה בודדת כדי לחשב את מספר מולקולות יחיד חייב המקום גדוש.
  3. עקומת כיול על כימות מוחלטת
    1. חזור על סעיפים 1 ו- 2 כדי ליצור 10 טיפות למיעון nL עם הנוגדן זיהוי בפתרון PBSA 4% עם חלבון רקומביננטי הריכוז הידוע.
    2. לבצע סדרה ריכוז של 102- 107 חומרים לכל droplet על ידי שינוי הריכוז הידוע של חלבון רקומביננטי הוסיף את הפתרון. מומלץ לעבוד מבחינת מספר חלבונים לכל droplet כדי להפוך את הנתונים תא בודד וכיול פשוטה.
    3. השתמש הסדרה ריכוז הנתונים בשלב 3.3.2 לכיול לכל מולקולה בודדת נחשב לכל מקום לשפע חלבון לכל droplet ועל -ידי סיומת שפע חלבון לכל תא ותא.

תוצאות

המספר עותק חלבון הבזליים מוחלטת של p53 נקבע עם רזולוציה תא בודד בקו תא סרטן המעי הגס האנושי, להיות תאים. נדגים כיצד הביטוי p53 יכול המשתנים במספר סדרי גודל ולהראות מתאם חיובי חלש בין תא גודל וחלבון עותק מספר בתוך האוכלוסייה התא להיות מנוחתו.

?...

Discussion

מיקרו-מערכים Droplet למיעון הם שיטה רגישה וניתן להרחבה לקביעת באופן כמותי את המספר המוחלט עותק של חלבונים בתוך תא בודד.

הגבלת הרמה של איגוד שאינם ספציפיים (נאצית) חיוני בתוך הפרוטוקול להשגת כמו נמוך מגבלה של זיהוי ככל האפשר. חלבונים ו מינים אחרים הביוכימי הלא ספציפית עלול להיקש...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

ASR תוכנן ניסויים, פיתח פרוטוקולים, ניתחו נתונים. SC ו PS ביצע ניסויים גודל התא. ASR ו OC כתב היד. המחברים מאחלים לאשר בתודה את התמיכה של פרופסור דוד ר קלוג למתן גישה לציוד. המחברים רוצים להודות את אימפריאל קולג מתקדם Hackspace לגישה פבריקציה נוספת ומתקני טיפוס.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Life Technologies10010015
DMEM high glucoseSigmaD6429
Foetal Bovine Serum (FBS)BiochromS0115
cell culture flasksCorningSIAL0639
Trypsin/EDTABiochromL2153
NameCompanyCatalog NumberComments
Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab, UKOmniGrid Micro
Microcontact pinArrayIt, USA946MP2
Coverslips (Nexterion)Schott, Europe1098523Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibodyEnzoADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelledSanta Cruzsc-126stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate bufferGibco15557-044
BetaineSigma61962
Sodium dodecyl sulphateSigmaL3771
384 well plate (low volume)SigmaCLS4511
Nitrogen gas cylinderBOCIndustrial grade, oxygen-free
NameCompanyCatalog NumberComments
Droplets
MicromanipulatorEppendorfPatchman NP2
Manual MicroinjectorEppendorfCellTram Vario
MicropipetteOrigio, DenmarkMBB-FP-L-0
Syringe pumpsKD ScientificKDS-210
100 μL syringeHamilton81020Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringeHamilton81327Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolatorGrace Bio-LabsJTR24R-A-0.56x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutterVersaLASEVLS2.30 CO2 Laser 3Wfor laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheetWeatherall-UKClarex Precision Sheet 001for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet3Mused to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glueLoctiteLOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubingIDEXFS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubingIDEX1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubingKinesis008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubingIDEX1673
Bovine Serum Albumen (BSA)Fisher ScientificBP9700100
Mineral oilSigmaM5904
Ultra-pure waterMillipore, GermanyMilliQ
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stageNikon, JapanNikon Ti-E
EM-CCDAndor Technologies, IrelandIXON DU-897E
Laser excitation sourceVortran, USAStradus 488-50
Optical lysis laser sourceContinuum, USASurelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRFChroma, USAz488bp
Microscope filter cube for Optical LysisLaser 2000, UKLPD01-532R-25
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
FijiOpen SourceImage analysis software
MatlabMathworksversion 7.14 or higherImage analysis software

References

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137Dropletp53

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved