JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm)、単一セルの絶対蛋白質量を決定できる液滴アレイ ・ ベース メソッドをご紹介します。ひと癌細胞における癌抑制タンパク質 p53 の発現の多様性を特徴付けるための Adm の機能を紹介します。

要約

しばしば細胞挙動と細胞応答は多くの細胞の応答が複雑な人口の内で豊富な単一のセル動作をマスキング平均結果として一緒にプール、人口レベルで分析しました。単細胞タンパク質検出と定量化技術は、近年顕著な影響を与えたが。ここでアドレス指定可能な液滴マイクロ アレイに基づく実用的で柔軟な単一細胞解析プラットフォームをについて説明します。本研究では、ターゲット蛋白質の絶対コピー数が単一セルの解像度を測定する方法について説明します。腫瘍抑制因子 p53 は、非正常な p53 表現パターンを示す総癌の 50% 以上のひと癌の最も一般的変異遺伝子です。プロトコルでは、発現の変動を正確に判断する単一分子分解能 10 nL 液滴内 1 つのひと癌細胞は隔離され、p53 蛋白のコピー数の測定を作成する手順について説明します。メソッドは、任意のセル型主原料を含む興味の任意のターゲット蛋白質の絶対コピー数を決定するために適用可能性があります。

概要

このメソッドの目的は、単一セルの解像度を持つセル人口のターゲット蛋白質の豊富さで変化を決定することです。単一細胞解析は、いくつかの伝統的なアンサンブル生化学的方法では利用できない利点を提供します。1,2,3,4,5まず、単一セルのレベルで働く伝統的なアンサンブル生化学的手法で発生するそれ以外の場合、平均することによって失われるだろう細胞集団の豊富な多様性をキャプチャできます。仕事馬の生化学的方法の大半を連れた、必要とされる職務とは多くの場合、結果を生成する細胞の数百万。もちろん、全体細胞集団の評価の結果によって異なりますいくつかの要因、たとえば、不均質構造タンパク質発現蛋白質量分布のいくつかの重要な機能を見逃す可能性があります。実用的な観点から単一のセル技術の必要な感度させる機能により敏感の一括技術も十分ではない生物学的材料の量を操作することができます。このキーの例は珍しいセルなどの循環癌細胞 (Ctc) 描画単一 7.5 mL の血液に存在する 10 の Ctc より予後見通しで貧しい患者のためにもどこの研究です。6ここでオイル キャップの液滴を用いた抗体アッセイは抗体のマイクロ アレイの印刷量を削減を用いた単一細胞蛋白質測定の実行に必要な方法論を紹介します。

マイクロ液滴プラットフォームは、高スループット、生化学的アッセイの広い配列を実行する個々 のしぶきの滴/秒との分離、及びも培養の単一セルの対応の数千を生成することです。液滴ベースの技術は、単一細胞解析、大幅の力によって支援されています DropSeq10 inDrop11を含む顕著な最近例の7,8,9に最適増幅テクニック。材料の限られた量、蛋白質のための増幅のメソッドは、単一細胞プロテオミクスを特に挑戦的なの作るに。

液滴はメソッドの数によって分析される可能性があり、蛍光顕微鏡が用いられています。全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡などの単一分子技術により蛍光分子信号対雑音比の比類のない可視化することができます。12によるエバネッ セント場の指数関数的減衰、高 (100 nm オーダー) 表面近傍でのみ fluorophores が付いて興奮している複雑な混合物に少量の標的分子を検出するに全反射の良い戦略を作るします。全反射の光学セクショニング強さまた洗浄手順を避けるために、制限時間と複雑さの分析できます。全反射平面サーフェスを必要とし、流における液滴に適用される全反射型顕微鏡の例を含むイメージを平面の形成。13この目的のために単一細胞プロテオミクス技術設計マイクロ流体チップ マイクロ アレイ フォーマットでキャプチャの表面固定化エージェント周り。4,14

自分自身、液滴を形成して、平坦なサーフェス、いわゆる液滴マイクロ アレイでよい。15,16,17空間的配列に液滴を整理する便利なインデックス、簡単に時間をかけて監視、個別に対処して、必要な場合、取得することができます。液滴マイクロ アレイは、フリースタンディングまたはマイクロウェル構造体でサポートされている、チップあたりの要素の何千もの超小型原子炉の高密度を実現できます。18,19,形成することができる20液体ハンドリング ロボット、インク ジェット マニアによって順次蒸着によって先生方、院生21,22,23,24,25にお問い合わせください 26または彼らは自己 superhydrophillic などの面で組み立てることができるスポットは、超撥水表面のパターンします。27,28,29

念頭に置いてこれらの考慮点は、アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm) 定量的に単一分子全反射型顕微鏡の感度と汎用性、空間のアドレッシング機能により、液滴マイクロ アレイのボリュームを減少を結合する設計されていたタンパク質の量を測定します。5 Adm は、蒸発を防ぐためにオイルの蓋は、抗体マイクロ アレイを単一細胞を含む液滴マイクロ アレイを形成する単一細胞分析を有効にします。液滴のボリュームは、オンチップ マイクロ流体連続フローで弁体によって達成されるそれ以外の場合サンプル損失を防ぐ離散。30単一のセルからのターゲット蛋白質の絶対量が非常に小さいです。しかし、水滴の量の削減により比較的高い濃度のため、順序では、彼らはサンドイッチ抗体アッセイを使用して検出されます - 抗体を固定化すると、異なる地域や順番を結合する蛋白質をキャプチャする表面上のスポット蛍光標識検出の抗体, 液滴体積中に存在。ADMs が処理血液などの主要な情報源からの細胞の分析に一般的に適用されるラベル無料アプローチ (すなわちタンパク質のターゲットを直接にラベル付けする必要はありません)、として、うまく吸引解離腫瘍生検と培養細胞を必要とその溶解液。

薬に応答して、たとえば、不均一性を左右する重要な細胞集団全体蛋白質量の変化を測定と細胞機能と経路、集団の評価に洞察力を提供するのに役立つだろう、動作と同様一括方法によってマスクされるまれな事象を識別します。このプロトコルは、生産し、アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイを使用して定量的ひとがん細胞における転写因子 p53 の豊かさを確認する方法について説明し、化学療法薬への応答における p53 の役割を調査するために使用可能性があります。ターゲット蛋白質はキャプチャと検出抗体の選択によって決定され、詳細、または別のターゲットを含めるように変更することがあります。手順は、手動でオイルを上限 10 nL 液滴を配列する一般的なラボ消耗品から同心円状のノズルを組み込んだシンプルな装置を構築する提供されます。各液滴分離するか、単一のセル、全反射顕微鏡を用いた 1 分子分解能で決定したタンパク質の発現とロードされるという完全実験のプロセスを説明します。

プロトコル

1. 準備

  1. チップとプリントの抗体のマイクロ アレイ
    1. 抗体のマイクロ アレイをサポートする官能基化 coverslip に接着剤シリコーン/アクリル アイソレータを取り付けます。これをチップと呼びます。
      注: さまざまな表面化学は、アドレス指定可能な液滴とその適合性についてテストされています。5表面の化学的性質は、代替の捕獲のエージェント用に最適化する必要があります。ADM アイソレータ、商業的に利用可能なまたはアクリル レーザー切断によって生成される (CAD ファイルのダウンロードとしてこの作業で使用する免震装置を提供;補足コード ファイルを参照してください)。
    2. Microarrayer に切り替え、湿度を 75% に設定します。
      注: 相対湿度はマイクロ アレイ端子から印刷の溶液の蒸発を低減し、イントラ間 spot 変化を減少します。
    3. 5 分間超音波処理による洗浄ピンのマイクロ アレイ ピンを清掃します。超純水洗浄ボトルを使用してくださいピンをすすいで乾燥窒素を使用してください。
      注: のみピン先端を浸すようピンを中断します。適切なドリル穴セットを顕微鏡スライドはピン ホルダーを取得できない場合に役立ちます。
    4. 5 mL の 0.01% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を添加した 1.5 M のベタイン 3 × クエン酸塩ナトリウム (SSC) バッファーの印刷バッファーを構成するを確認します。無期限に 4 ° C で保存します。
    5. 印刷ソリューションを準備する抗 p53 抗体を解凍 (p53/Mdm2 ELISA キット; 材料の表を参照してください) 因数-80 ° C で保存それは 1:1 を最終濃度 0.5 mg/mL の印刷バッファーでミックスします。384 ウェル プレートのマイクロ ピペットを使用しての印刷ソリューションの 5-10 μ L をロードし、microarrayer に配置します。
    6. 1.1.1 のステップで、microarrayer に組み込まれたチップを読み込みます。アイソレータの各ウェルの中心によって定義された座標にスポットを印刷する microarrayer をプログラムします。
      注: 先生方、院生採用の範囲主に、独自のソフトウェアなどの関連文献を参考にお勧め。1.1.1 のステップに付随する CAD ファイルで紹介 ADM アイソレータで長方形要素の構成に必要なマイクロ アレイ関連する距離を提供しています。
    7. 気密の容器でチップを格納し、アルミホイルで包みます。6 週間 4 ° C で保存します。
      注: 箔写真損害を防ぐためです。4 ° C で保存生体分子とマイクロ アレイ活動を軽減する作用があります任意の有害反応の分解速度を制限します。気密の容器では、チップ表面の結露せず使用する前に室温に平衡にチップをことができます。コンタクト マイクロ アレイの印刷は、表面張力と印刷ソリューションとスポットを生成するプリント基板との密着性を悪用します。印刷前処理またはしみが付くことは、通常均一に大きさで分類されたスポットを生成するマイクロ アレイ端子から余分なソリューションを削除する必要です。バッチの品質を評価するために使用できるので、いけにえの事前印刷 coverslip は捨てないでください。
  2. 注射器を準備アドレスの液滴を吐出用チューブと同心のノズル
    1. (水溶液液滴) を 100 μ L を分解し、1 mL (キャップのオイル) のガラス製注射筒ハミルトンと蒸留 H2O を持つ部品をすすいでください。
    2. 150 μ m の 100 mm をフィード ID/360 μ m OD 溶融シリカ チューブ 40 mm 長さ 1.0 mm ID/1/16 のを通して「OD PFA チューブ 2 mm 突出それまで。これは、同心円状のノズルが形成されます。
    3. 10 μ L ピペット チップの端にシアノアクリ レート系接着剤の薄層を適用し、1.0 ミリメートル ID/1/16 の 40 mm の部分に挿入"OD PFA チューブ。必要な場合、接着剤が沈む前にノズルで 2 mm の突起を維持するために石英管の位置を変更します。
    4. 0.014"ID/0.062 の 200 mm の終わりに石英キャピラリーのもう一方の端を挿入"PTFE チューブの外径し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (PBSA) で 4% ウシ血清蛋白 (BSA) 満ちているハミルトン シリンジ 100 μ L に接続します。
      注意: 蛋白質および他の生化学的な種表面に非特異結合可能性がありますとが紛失したり変性します。BSA は、'ブロック' 表面献身的これらのサーフェスにバインドすることにより非特異的結合を最小限に抑えるために使用されます。
    5. それは、シールを形成するまで 200 μ L ピペット チップに 400 mm 1.0 mm ID/2.0 mm 外径 FEP チューブを挿入します。別 200 μ L ピペット チップにシアノアクリ レート系接着剤の薄層を適用し、場所にチューブを修正するための最初のヒントにこれをプッシュします。鉱物油で満たされたハミルトン シリンジ 1 mL に 1.0 mm ID/2.0 mm 外径 FEP 管の開放端を接続します。
    6. 同心円状のノズルの 10 μ L ピペット チップに、200 μ L ピペット チップ ・ アセンブリを挿入します。独立して運営する必要があります、別のシリンジ ポンプに注射器を配置します。
    7. 4 %pbsa ブロッキング溶液を 100 μ L のシリンジを入力します。接続し直し、ブロッキング液で '水' チューブをフラッシュします。3 フラッシュの合計に 2 回繰り返します。
    8. 4 %pbsa と再アタッチ チューブを 0.125 μ g mL-1検出の抗体 (抗 p53 抗体 (か 1) アレクサ 488 付け) を 100 μ L のシリンジを入力します。調剤 25 チューブでブロッキング ソリューションを置き換える μ L 検出抗体溶液。
    9. すべてのチューブとノズルがオイルでいっぱいになるまでは、鉱油と '油' チューブをフラッシュします。ミネラル オイルを 1 mL の注射器を補充し、チューブを再アタッチします。XYZ マニピュレーターにチューブとノズルのアセンブリを固定します。
  3. マイクロインジェクターおよびマイクロマニピュレーターを準備します。
    注: 以下の手順マイクロインジェクターと材料表で指定したマイクロマニピュレーター装置のコンポーネントに特定の参照を作るなどの装置に一般的に適用されます。
    1. ガラスシリンジをアセンブルするには、圧力管、キャピラリーのホルダーを取り付けます。
    2. 鉱物油が完全に行を塗りつぶすまでゆっくりとピストンのダイヤルを回転させます。
    3. 翻訳のヘッド マウントに毛細血管のホルダーをマウントします。
    4. グリップの頭で毛細血管のホルダーにキャピラリーを固定します。
    5. 4% の溶液をピペット PBSA アイソレータの井戸の 1 つに。
    6. 翻訳マニピュレーターを使用して、ソリューションに毛細血管の先端を浸します。
    7. ゆっくりと 4 %pbsa と 10 分のためにブロックを残す毛細血管を入力します。
    8. マイクロキャピ ラリーを取り出し、アセンブリがチップの明確になるので、変換モジュールを回転します。

2. 負荷とアドレス指定可能な液滴を形成する単セルで

  1. フォーム アドレス滴
    1. 顕微鏡ステージ上には、チップを固定します。
      注: 顕微鏡は単一分子全反射できる自動顕微鏡装備倒立蛍光、エンコードされた XY ステージと電子電荷結合素子 (ccd 年 EM-) を乗算します。
    2. 自動顕微鏡制御ソフトウェアを使用して配列の各スポットの顕微鏡ステージ座標を記録します。
    3. XYZ マニピュレーターを顕微鏡ステージに設定します。50-60 ° の角度でノズルを配置します。ノズルは十分な長さとクリアランス チップに到達することを確認します。'水' と '石油' 注射器 10 分配するポンプ セット 100 μ L/min で 5 μ L、100 μ L/分、nL それぞれ。
      注: の準備時にノズルのヘッドで水溶液が乾燥があります。
    4. 流体のビーズがノズルの先頭に表示されるまでは、水溶液を調剤します。それを削除するほこり無料ワイプで軽くたたきます。
      注: 調査中の条件の数によって、細胞の貯蔵所として機能する井戸の数を有します。単一のセルのライン/タイプ単一タンクで十分です。
    5. 自動顕微鏡制御ソフトウェアを使用して、coverslip 表面に配列とフォーカス抗体場所に顕微鏡ステージ座標を設定します。
    6. 邪魔しないように注意スポット、XYZ マニピュレーターを用いた抗体スポットの側に同心円状のノズルのガラス キャピラリー先端を合わせ、調剤 10 水溶液の nL。ステージを移動することがなく水溶液をキャップにオイルの 5 μ L を分配します。ゆっくりとノズルの液滴のクリアをあげても次に移動します。
    7. ステップ 2.1.6 配列ですべての抗体のスポットに対して繰り返します。
    8. 30 分後、各抗体細胞をロードする前にスポットにバインドされている単一の分子の背景を特定する自動顕微鏡制御ソフトウェアを使用して、配列内のすべてのスポットを画像します。
  2. アドレス指定可能な液滴セルを読み込む
    1. インキュベーターから細胞培養フラスコを削除し、/トリプシン EDTA 溶液を使用してセルをデタッチします。
      注: この研究では、BE ひと大腸癌細胞株が使用され、ダルベッコ変更イーグルス媒体 (DMEM) 10% (v/v) 胎児血清 (FBS) CO2インキュベーターでの培養します。
    2. 必要な場合、蛍光染色細胞。
      1. 10% で 0.125 μ g/mL 検出抗体 (抗 p53 抗体 (か 1) アレクサ 488 付け) の溶液中の細胞を再懸濁します FB L-15 メディアの。単一細胞懸濁液を確保するため、40 μ m ピッチ携帯こし器を通って細胞液をフィルターします。
    3. 診断を使用してセルを数えると希釈または 25 400 × 103セル/mL の濃度に細胞のソリューションを集中します。これにより、マイクロキャピ ラリーを快適に操作するための十分な間隔とそのセルの堆積物です。
    4. 単一細胞をマイクロマニピュレーターおよびマイクロキャピ ラリーを使用して細胞の貯蔵所からのアドレス指定可能な液滴に読み込みます。
      注: 非付着性のセル内挿した一括で読み込まれます、アドレス指定可能な液滴に一つずつ分配されます。表面のブロック治療にもかかわらず付着性のセルラインが非具体的ガラス マイクロキャピ ラリー内壁に固執し、失われる傾向があります。
    5. 10 × 目的を使用して、観察、ガラスシリンジを使用して細胞の貯蔵所からマイクロキャピ ラリーに単一細胞を吸引します。
    6. 電子マニピュレーター ステージを使用して場合、マイクロマニピュレーター ステージ座標を格納または手動で z 位置に注意してください。
    7. チップの高さ 1 mm のクリアを上方向に変換することで、ピペットを撤回します。ジョイスティックまたは電子マニピュレーター段階の 'Eject' 機能を使用して自動的に手動で実行します。
    8. ステージ座標にアドレス指定可能な液滴を自動顕微鏡制御ソフトウェアを使用して設定します。'挿入' マイクロ ピペット ストアド (または注意) の z 位置にそれを返すことによって。ジョイスティックまたは自動的に、手動でこれを行う場合は電子マニピュレーター ステージを使用して。
      注: マイクロキャピ ラリーにキャップのオイル穴を開ける、アドレス指定可能な液滴の水性部分内に位置します。
    9. ガラスシリンジを使用してアドレス指定可能な液滴のセルを調剤します。10 nL のアドレス指定可能な液滴の体積増 1% 未満。
    10. アドレス指定可能な液滴がセルを含まない実験のコントロールのいくつかの無料残して残りのアドレス指定可能な液滴に 2.2.5-2.2.9 を繰り返します。
      注: マイクロキャピ ラリーとマイクロマニピュレーターを使用してアドレス指定可能な液滴への単一セルの読み込みの簡潔な代替 10 濃度 4 %pbsa 含む細胞の検出の抗体の溶液で 1.2.8 の手順でソリューションを置き換えるには5セル/mL、1 セル/10 に相当 nL。単一のセル占有率は 27ayf-3 ポワソンなり、細胞濃度を最適化する必要があります。
  3. セルとイメージ配列を溶解させます。
    1. 任意の蛍光イメージングなど明視野顕微鏡を用いた液滴の画像セルします。
      注: 画像は、自動顕微鏡を用いた 〜 100 滴のイメージを約 3 分かかります。イメージングを実行 60 NA = 1.49 油浸対物レンズ。フィルターが明視野イメージング蛍光標準フィルターのセットが使われるに対し必要ないです。
    2. 単一分子の全反射型顕微鏡を使用して配列内のすべてのスポットをイメージします。
      注: 特殊な全反射を 2.3.1 手順でセットのフィルター設定が使用されます。これらの画像はその後溶解前に各抗体スポットにバインドされている単一の分子の背景を特定する 3 のセクションで分析します。全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡を用いた単一分子イメージングは、〜 100 点のイメージを約 5 分かかります。
    3. アドレス指定可能な液滴のセルに焦点を当てます。シングル 6 に焦点を当て、完全な光の換散を達成するナノ秒レーザー パルス (波長 1064 nm、パルス当たりのパルス エネルギー 14.1 ± 0.3 μ J) セルの場所の近くにあります。
      注: レーザー パルス設定拡大のキャビテーション気泡をセル、, 液滴体積に細胞成分を解放します。4,31換散のレーザー誘起による機械的なプロセスは低パルス エネルギー油水界面を妨げない。光散 100 セルを示した約 20-30 分をとります。議論の部で説明したように単一細胞を溶解光溶解セットアップができない場合の代替手段の数があります。
    4. セルを含むすべてのアドレス指定可能なアドレス指定可能な液滴が非分離セルを含む 5 実験的制御のために自由を残して液滴に繰り返します。
    5. 各セルを分離するか、時間に注意してください。
      注: これらの時間は、ステップ 3.1.9 内の各スポットの個々 のバインド曲線を修正する使用されます。多くの場合、回最初と最後のセルが分離、換散イベントの間十分に一貫した時間と仮定すると残りの部分を推定であるとに注意します。
    6. さらに 60 分間、20 分ごとに、最初の 30 分間すべてのスポット 10 分毎の全反射蛍光顕微鏡を用いた単一分子画像を取得します。平衡結合蛋白質の量に興味を持って、だけの場合は、室温で 90 分のチップをインキュベート後すべてのスポットをイメージします。
      注:, 液滴体積の試金で使用される抗体の親和性平衡に到達する時間によって異なります。レーザー励起源を用いた全反射型顕微鏡を実行 = 488 nm および 1.5 mW の発電光パワーメータを使用してバック絞りにて測定。900 ms のアクイジション時間, 1 MHz の読み出しレートで 16 ビット デジタル化する EM CCD カメラの取得設定を設定による単一分子画像と、EM ゲイン 10 倍です。アイソレータは、coverslip を慎重に外して再使用する可能性があります。

3. データ分析

  1. 単一分子 (非混雑/デジタル政権) を数える
    1. フィジー (または Matlab) を用いた非輻輳抗体の任意の場所、換散 (背景、BKD) 前に取得したイメージを読み込みます。
      注: 以下の手順で操作は、素直フィジー画像解析ソフトウェアを使用しています。ユーザー ガイドは、次のリンクの https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html で見つけることが。
    2. フィジー、BKD イメージを選択します。「イメージ」メニューの下には、重複した BKD に「重複した」を選択します。重複する画像を選択し「プロセス > フィルター」の下で「ガウスぼかし」を選択し 50 ピクセル半径を指定します。
    3. BKD 画像で BKD_FLAT を生産、ぼやけの BKD イメージを分割して励起光源の効果的な均一な強度分布がある、BKD のイメージを平らにします。
      1. 「プロセス」の下で選択「画像電卓...」、画像が必要な操作の「われ」を指定するとボックス「を作成する新しいウィンドウ」と「32 ビット (浮動小数点) 結果」を選択
    4. 1、イメージの各ピクセルを減算 (「プロセス > 数学」、「減算...」を選択し 1 値を指定)。平均輝度は 0 にする必要があります。
      注: フィールドの平坦化と、すべてのピクセルの合計は 0 にする必要があります、任意の残りのオフセットにより素直の補償される場合がありますので、フラットな背景画像を簡単にチェックすることがあります。
    5. BKD_FLAT 画像の 4隅のいずれかで 50 ピクセル × 50 ピクセル領域を選択します。「分析」と「測定」を選択してピクセル強度の標準偏差 (σ) を測定します。
      注: 結果ウィンドウで選択範囲の集計値が表示します。これは、スポットを背景を決定しますある単一分子の高密度をする可能性があります。測定する領域はデフォルト メニューの選択ツールを使用して手動で選択可能性がありますまたは実行するマクロ コード"makeRectangle (x、y、幅、高さ)";これは矩形の選択範囲を作成し、x と y 引数が左上隅の座標を (ピクセル) で。
    6. 3 σ にイメージしきい値を設定し、SM_MASK のバイナリ イメージを作成します。
      1. 「イメージ > 調整」、の下で「しきい値...」を選択し、3 σ に低いしきい値レベルを設定します。
        注: 値がしきい値を下回っているピクセルが 0 に設定し、しきい値を超えるピクセルは 1 に設定されます。しきい値は、どちらられるピクセルは、単一分子に属する信頼を決定します。
    7. 分割画像 SM_MASK、4-9 ピクセルの2サイズ、0.5 - の真円度を持たないオブジェクトのゼロに設定されているピクセル強度値で「分析」を選択して 1 に続いて「分析粒子」サイズと真円度を指定します。
      注: ピクセル サイズ可能性がありますその他のフルオロおよび顕微鏡セットの最適化が必要な ups。カメラのノイズのタイプのため単一のピクセルはこのしきい値を超える可能性があり、ない単一分子であるにもかかわらずは破棄されません。ピクセル サイズの基準は、このようなピクセルを正しく破棄されます。単一分子形で一般に循環しています。1 の真の値は、値 0 に近づいて徐々 に引き延ばされた形に対し完璧な円を示します。残りのオブジェクトは単一の分子であり、カウントがあります。マスクがスポット上を差別するスポットの領域を区別するため、スポットをフレームごとに 1 カウントします。フレーム後に取得が簡単です、十分な信号場で以前のフレームに、適用することができます。
    8. 同じ抗体の非混雑スポット ロードし、手順 3.1.1 - すべての画像フレームの 3.1.7 キャプチャ時間分解シリーズ取得ポスト換散を繰り返します。2.3.5 の手順に記載されている溶解時間を使用します。バインディングの任意の曲線を修正しました。
  2. 単一分子 (混雑/アナログ政権) を数える
    1. 次に進む前に、単一の分子の平均強度を計算するために手順 3.1.1 - 3.1.8 を繰り返します。
    2. 0 以外のピクセル値が単一分子に関連付けられてであるというイメージを生成する BKD_FLAT と SM_MASK の画像を乗算します。
      1. 「プロセス」メニューの下これを実行、"イメージ計算..."を選択、「乗算」操作と、必要なイメージを指定、ボックス"を作成する新しいウィンドウ」と「32 ビット (浮動小数点) 結果」を選択するには
    3. 「分析」と、「測定」; を選択してすべてのピクセルの輝度の値を合計します。選択範囲の集計値は、結果ウィンドウに表示されます。ステップ 1 分子あたりの平均強度を計算する 3.1.8 に従ってカウントの単一分子の数で除算します。
    4. 混雑した抗体スポット、イメージ取得後換散を読み込むし、平ら 3.1.2、3.1.3 の手順に従って背景をぼかし画像で。
    5. 1 によって平坦化されたイメージの各ピクセルを減算 (「プロセス > 数学」、「減算...」を選択し 1 値を指定)
    6. 画像の 4隅のいずれかで 50 ピクセル × 50 ピクセル領域を選択し、ピクセル強度の標準偏差 (σ) を測定します。手順 3.1.5 詳細を参照してください。
    7. 3 σ にイメージのしきい値を設定することによってバイナリ イメージ マスクを作成し、未満 4 ピクセルの2サイズの任意のオブジェクトのゼロにピクセルの明度の値を設定します。「解析」メニューの下で、これを実行、「粒子の分析」を選択し、サイズ、真円度を指定します。
    8. バイナリ イメージ マスクをフラットな混雑している抗体スポット像を掛けます。
      1. 「プロセス」メニューの下これを実行、"イメージ計算..."を選択、「乗算」操作と、必要なイメージを指定、ボックス"を作成する新しいウィンドウ」と「32 ビット (浮動小数点) 結果」を選択するには
    9. 「分析」を選択して残りのピクセル強度の合計は続いて「測定」;選択範囲の集計値は、結果ウィンドウに表示されます。
    10. 混雑した場所にバインドされている単一の分子の数を計算する平均単一分子強度によってピクセル強度の合計を除算します。
  3. 絶対定量のための検
    1. セクション 1 および 4 %pbsa 溶液濃度既知遺伝子組換えタンパク質をスパイクで 10 nL アドレス指定可能な液滴検出の抗体を形成する 2 を繰り返します。
    2. 10 の一連の濃度の実行2- 10 ソリューションに追加組換え蛋白質の既知濃度を変化させることで液滴あたり7遺伝子組換え蛋白質。キャリブレーションの 1 つのセルのデータを簡単に液滴あたり蛋白質の数の面で動作するようにそれをお勧めします。
    3. タンパク質豊富な単一セルごと延長蛋白質量、液滴あたりにスポットあたり一連の濃度の任意の単一の分子を調整 3.3.2 の手順でデータ カウントを使用します。

結果

P53 の絶対根元タンパク質コピー数は、ひと大腸癌細胞株、ある細胞の単一セルの解像度が定められました。P53 桁違いに異なり、休憩する細胞集団内のセル サイズとタンパク質コピー数の間弱く肯定的な相関関係を示す方法を紹介しています。

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイは、水滴は抗体の場所にスポットで?...

ディスカッション

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイは、単一細胞内でタンパク質の絶対コピー数を決定する定量的敏感かつ拡張可能な方法です。

非特異的結合のレベルを制限すること (NSB) は、低として可能な限り検出限界を達成するためにプロトコル内で重要です。蛋白質および他の生化学的な種がありますバインド インターフェイス液滴内に存在の数非具体的-coverslip 表面、ス...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

ASR は、実験を設計プロトコルを開発し、データを分析しました。SC と PS は、セル サイズの実験を行った。ASR では、OC は、原稿を書いていた。著者は機器へのアクセスを提供するため教授デビッド r. Klug のサポートを感謝したいです。著者作製と試作設備にアクセスするために帝国大学高度な Hackspace を感謝したいです。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Life Technologies10010015
DMEM high glucoseSigmaD6429
Foetal Bovine Serum (FBS)BiochromS0115
cell culture flasksCorningSIAL0639
Trypsin/EDTABiochromL2153
NameCompanyCatalog NumberComments
Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab, UKOmniGrid Micro
Microcontact pinArrayIt, USA946MP2
Coverslips (Nexterion)Schott, Europe1098523Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibodyEnzoADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelledSanta Cruzsc-126stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate bufferGibco15557-044
BetaineSigma61962
Sodium dodecyl sulphateSigmaL3771
384 well plate (low volume)SigmaCLS4511
Nitrogen gas cylinderBOCIndustrial grade, oxygen-free
NameCompanyCatalog NumberComments
Droplets
MicromanipulatorEppendorfPatchman NP2
Manual MicroinjectorEppendorfCellTram Vario
MicropipetteOrigio, DenmarkMBB-FP-L-0
Syringe pumpsKD ScientificKDS-210
100 μL syringeHamilton81020Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringeHamilton81327Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolatorGrace Bio-LabsJTR24R-A-0.56x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutterVersaLASEVLS2.30 CO2 Laser 3Wfor laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheetWeatherall-UKClarex Precision Sheet 001for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet3Mused to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glueLoctiteLOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubingIDEXFS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubingIDEX1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubingKinesis008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubingIDEX1673
Bovine Serum Albumen (BSA)Fisher ScientificBP9700100
Mineral oilSigmaM5904
Ultra-pure waterMillipore, GermanyMilliQ
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stageNikon, JapanNikon Ti-E
EM-CCDAndor Technologies, IrelandIXON DU-897E
Laser excitation sourceVortran, USAStradus 488-50
Optical lysis laser sourceContinuum, USASurelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRFChroma, USAz488bp
Microscope filter cube for Optical LysisLaser 2000, UKLPD01-532R-25
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
FijiOpen SourceImage analysis software
MatlabMathworksversion 7.14 or higherImage analysis software

参考文献

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

137 p53

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved