Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Resumo

Aqui nós apresentamos gotículas endereçável microarrays (ADMs), um método de matriz com base gota capaz de determinar a abundância absoluta de proteínas em células únicas. Podemos demonstrar a capacidade de ADMs caracterizam a heterogeneidade na expressão do tumor supressor p53 de proteína em uma linhagem de células cancerosas humanas.

Resumo

Muitas vezes celular comportamento e respostas celulares são analisadas a nível de população onde as respostas de muitas células são agrupadas como um resultado médio, mascarando o comportamento de ricos única célula dentro de uma população de complexo. Tecnologias de deteção e quantificação de proteínas de célula única têm feito um impacto notável nos últimos anos. Aqui nós descrevemos uma plataforma de análise de prático e flexível única célula baseada em microarrays endereçável da gota. Este estudo descreve como o número de cópias absoluta de proteínas do alvo pode ser medido com resolução de célula única. O tumor supressor p53 é o gene mais comumente mutado em câncer humano, com mais de 50% dos casos de câncer total, exibindo um padrão de expressão de p53 não-saudável. O protocolo descreve as etapas para criar 10 gotas de nL, dentro do qual as células de câncer humano único são isoladas e o número de cópia da proteína p53 é medido com resolução única molécula determinar com precisão a variabilidade na expressão. O método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula incluindo material primário para determinar o número de cópia absoluta de qualquer proteínas alvo de interesse.

Introdução

O objetivo desse método é determinar a variação em abundância de uma proteína do alvo em uma população celular com resolução de célula única. Análise única célula fornece uma série de benefícios que não estão disponíveis com métodos bioquímicos tradicionais ensemble. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} em primeiro lugar, trabalhando no nível da célula única pode capturar a heterogeneidade rica de uma população de células que seria perdida caso contrário calculando a média do que ocorre com técnicas bioquímicas ensemble tradicional. A maioria dos métodos bioquímicos de cavalo de trabalho funciona com a maior parte, exigindo, como muitas vezes, milhões de células para produzir um resultado. Claro, as consequências da avaliação das populações de célula inteira depende de uma série de fatores, por exemplo, a heterogeneidade na expressão da proteína, onde algumas características importantes da distribuição de abundância de proteína podem ser perdidas. Do ponto de vista prática, a sensibilidade necessária de técnicas única célula torná-los capazes de trabalhar com quantidades de material biológico que é insuficiente para nem as técnicas em massa mais sensíveis funcionar. Um exemplo chave é o estudo dos tipos de células raras como circulantes de células de tumor (CTC) onde menos de 10 CTC pode estar presentes no sangue único 7,5 mL desenhar mesmo para pacientes com uma perspectiva de prognóstico pobre. ⁶ aqui apresentamos a metodologia necessária para realizar as medições de proteína de célula única usando um volume reduzido, ensaio baseado em anticorpos empregando gotículas de óleo-tampado impresso em um microarray do anticorpo.

Plataformas de gotículas microfluídicos são alto throughput, capaz de gerar milhares de gotas por segundo e capaz de isolar e até mesmo cultivo, células únicas em gotículas individuais para executar uma ampla gama de ensaios bioquímicos. Técnicas baseadas em gotículas são adequadas para a análise da única célula,^7,8,9 com notáveis exemplos recentes incluindo DropSeq¹⁰ e inDrop¹¹, que tem sido grandemente ajudado pelo poder de técnicas de amplificação. A quantidade limitada de material e não métodos de amplificação para proteínas tornam única célula proteomics especialmente desafiador.

As gotas podem ser analisadas por um número de métodos e microscopia de fluorescência tem sido amplamente utilizada. Técnicas de molécula como a microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total permite moléculas fluorescentes ser visualizado com incomparável relação sinal-ruído. ¹² devido ao decaimento exponencial do campo evanescente, apenas fluorophores alta próximo à superfície (ordem de 100nm) são excitadas fazendo TIRF uma boa estratégia na detecção de pequenas quantidades de uma molécula-alvo em uma mistura complexa. A força de corte óptica inerente de TIRF também ajuda a evitar as etapas de lavagem e ensaio de limites de tempo e complexidade. No entanto, TIRF requer superfícies planas e exemplos de microscopia TIRF aplicado em gotículas no fluxo envolvem a formação de uma superfície plana, de que a imagem. ¹³ para este fim, técnicas de proteomic única célula frequentemente projetar chips microfluídicos em torno de agentes de superfície-imobilizado captura em um formato de microarray. ^{4 , 14}

As gotas, eles mesmos, podem ser formadas em matrizes em superfícies planas, chamados gotículas microarrays. ^{15 , 16 , 17} organizar espacialmente gotículas em matrizes permite-lhes ser convenientemente indexados, facilmente monitorados ao longo do tempo, individualmente abordados e, se necessário, obtida. Microarrays da gota pode alcançar uma elevada densidade de microreatores com milhares de elementos por chip que são free-standing ou suportadas por estruturas de microplacas. ^{18 , 19 , 20} eles podem ser formados pela deposição sequencial por robôs de manipulação de líquidos, observadores de jato de tinta, entre em contato com microarrayers^{21,22,23,24,25, 26} , ou eles podem montar auto em superfícies como superhydrophillic pontos estampados em uma superfície de superhydrophobic. ^{27 , 28 , 29}

Com estas considerações em mente, endereçável Droplet Microarrays (ADMs) foram projetados para combinar a versatilidade, capacidade de endereçamento espacial e volumes reduzidos de microarrays da gota com a sensibilidade de microscopia TIRF única molécula para quantitativamente medir a abundância de proteínas. ⁵ ADMs permitem análise única célula formando um microarray de gotículas contendo células únicas sobre um microarray do anticorpo, que é então coberto com óleo para evitar a evaporação. Os volumes das gotas são discretos para evitar perda de amostra, que caso contrário seria alcançada em-microplaqueta válvulas em microfluídica de fluxo contínuo. ³⁰ a quantidade absoluta de proteína do alvo de uma única célula é extremamente pequena; no entanto, o reduzido volume de gotas permite a concentração local relativamente alta a fim de que eles são detectados usando um sanduíche ensaio de anticorpo - anticorpo é imobilizada em uma região distinta, ou local, sobre uma superfície que capta a proteína, que por sua vez vincula para um anticorpo de detecção fluorescente etiquetado presente no volume da gota. Como uma rótulo abordagem livre (ou seja, proteínas alvos não precisa ser rotulado diretamente), ADMs são geralmente aplicável ao analisar células a partir de fontes primárias, tais como o sangue processado, bem preciso aspirados e biópsias de tumor dissociadas, bem como células de cultura e os lisados.

Medindo a variação em abundância de proteínas através de uma população celular é importante na determinação da heterogeneidade na resposta, por exemplo, para uma droga e vai ajudar no fornecimento de insight funções celulares e vias, avaliando subpopulações e seus comportamento, bem como identificar eventos raros que caso contrário poderia ser mascarados por métodos em massa. Este protocolo descreve como produzir e usar gota endereçável microarrays para determinar quantitativamente a abundância do fator de transcrição p53 em células cancerosas humanas e pode ser usado para investigar o papel de p53 em resposta a quimioterápicos. A proteína alvo é determinada pela escolha dos anticorpos de captura e deteção e pode ser modificada para incluir mais ou diferentes destinos. As instruções são fornecidas para construir um aparato simples, incorporando um bocal concêntrico de consumíveis de laboratório geral de matriz manualmente 10 gotas de nL tampadas com óleo. O processo completo experimental é descrito por meio de que cada gota é então carregada com uma única célula, que é então lysed e a expressão da proteína, determinada com resolução única molécula usando microscopia TIRF.

Protocolo

1. preparação

1. Fazer fichas e Microarrays do anticorpo de impressão
   1. Anexe um isolador de silicone adesiva acrílica para uma lamela acrescida para apoiar um microarray do anticorpo. Isto é referido como o chip.
      Nota: Vários produtos químicos superficiais foram testados para sua adequação com gotículas endereçáveis. ⁵ superfície químicas podem precisar de ser otimizado para agentes de captura alternativos. Isoladores ADM estão disponíveis comercialmente, ou podem ser produzidas por acrílico de corte do laser (CAD para isolador usado neste trabalho é fornecido como um download de arquivo; consulte o Arquivo de código suplementar).
   2. Ligue o microarrayer e definir a umidade de 75%.
      Nota: umidade relativa reduz a evaporação da solução de impressão do pino de microarray e reduz a variação intra e inter spot.
   3. Limpe o pino de microarray pino de limpeza solução por 5 min por ultrasonication. Enxaguar o pino com água ultra-pura usando uma garrafa de lavar e secar usando nitrogênio.
      Nota: Suspenda o pino quanto apenas mergulhe a ponta do pino. Uma lâmina de microscópio com um conjunto adequadamente perfurado de furos ajudará se um titular de pin não pode ser obtido.
   4. Fazer 5 mL de tampão de impressão composta de 3 × buffer de solução salina-citrato de sódio (SSC), betaína de 1,5 M, suplementada com 0.01% sulfato dodecyl de sódio (SDS). Armazenar a 4 ° C indefinidamente.
   5. Para preparar uma solução de impressão, descongelar o anticorpo anti-p53 (p53/Mdm2 ELISA kit; Consulte a tabela de materiais) alíquotas armazenadas a-80 ° C. Mistura 1:1 com buffer de impressão para uma concentração final de 0,5 mg/mL. Carregar 5-10 µ l de solução de impressão em um 384-placa usando uma micropipeta e coloque o microarrayer.
   6. Fichas de carga montado na etapa 1.1.1 para o microarrayer. Programe o microarrayer para imprimir pontos em coordenadas definidas pelo centro de cada poço do isolador.
      Nota: Microarrayers empregam uma variedade de, predominantemente, software proprietário e para que o leitor é encorajado a consultar a literatura pertinente. O microarray necessário para o isolador ADM destaque no arquivo CAD que acompanha na etapa 1.1.1 é composta por elementos retangulares; as distâncias relevantes são fornecidas.
   7. Armazenar as fichas em recipientes hermeticamente fechados e embrulhe com papel alumínio. Armazenar a 4 ° C até 6 semanas.
      Nota: A folha é para não danificar qualquer foto. Armazenamento a 4 ° C limita a taxa de degradação de biomoléculas e quaisquer reacções deletérias que podem agir para reduzir a atividade de microarray. Um recipiente hermético permite chips para equilibrar a temperatura ambiente antes do uso sem condensação formando na superfície do chip. Impressão de contato microarray explora a tensão superficial e a adesão entre a solução de impressão e o substrato de impressão para produzir spots. Pré-impressão ou mancha é normalmente exigido para remover o excesso solução do pino de microarray para produzir manchas de tamanhos uniforme. Não jogue fora a lamela de pre-impressão sacrifício desde que pode ser usada para avaliar a qualidade do lote.
2. Preparar as seringas, tubos e concêntrico bocal para dosear o endereçáveis gotículas
   1. Desmontar a 100 µ l (para a gota aquosa) e 1 mL (para o óleo tampando) Hamilton seringas de vidro e enxagúe as peças com água destilada H₂O.
   2. Alimentar um comprimento de 100 mm de 150 µm ID/360 µm OD fundido tubo de sílica através de um comprimento de 40 mm de 1,0 mm ID/1/16 "tubo OD PFA até que sobressaia por 2 mm. Isto irá formar o bocal concêntrico.
   3. Aplique uma camada fina de cola de cianoacrilato para o fim de uma ponta de pipeta de 10 µ l e insira a peça de 40 mm de 1,0 mm ID/1/16 "tubo OD PFA. Se necessário, reposicione o tubo de sílica fundida para manter uma protrusão de 2mm no bico antes dos conjuntos de adesivo.
   4. Insira a outra extremidade da capilar de sílica fundida na extremidade de um comprimento de 200 mm de 0,014" ID/0,062" OD tubo de PTFE e ligar isto a um 100 µ l Hamilton seringa cheia com 4% de albumina de soro bovino (BSA) em tampão fosfato salino (PBS) (PBSA).
      Nota: Proteínas e outras espécies bioquímicas não especìfica pode vincular a superfícies e podem ser perdidos ou desnaturados. BSA é usado para 'Bloquear' superfícies para minimizar inespecificas vinculando sacrificialmente para essas superfícies.
   5. Inserir um comprimento de 400 mm do tubo de FEP OD 1,0 mm ID/2.0 mm em uma ponta da pipeta 200 µ l até formar um selo. Aplique uma camada fina de cola de cianoacrilato para a outra ponta da pipeta 200 µ l e empurrar isso para a primeira dica para fixar o tubo no lugar. Conecte a extremidade aberta do tubo de FEP OD 1,0 mm ID/2.0 mm para um 1 mL seringa Hamilton preenchida com óleo mineral.
   6. Insira a ponta de pipeta 10 µ l do bocal concêntrico Assembleia 200 µ l pipeta ponta. Coloque as seringas em bombas de seringa separada como eles terão de ser operados de forma independente.
   7. Encha a seringa de 100 µ l com uma solução de bloqueio de PBSA 4%. Reconecte e irrigue o tubo 'aquoso' com a solução de bloqueio. Repita duas vezes para um total de 3 flushes.
   8. Encha a seringa de 100 µ l com 0,125 µ g mL^-1 anticorpo da deteção (anticorpo anti-p53 (DO-1) rotulado com Alexa 488) em 4% PBSA e volte a colocar a tubulação. Substituir a solução de bloqueio na tubulação por 25 aplicadora solução de anticorpo de deteção µ l.
   9. Irrigue o tubo de 'petróleo' com óleo mineral até toda a tubulação e o bocal enche de óleo. Encher a seringa de 1 mL com óleo mineral e re-anexar o tubo. Fixe o conjunto de tubulação e o bocal de um manipulador XYZ.
3. Preparar microinjector e micromanipulador
   Nota: Passos abaixo fazem referência específica aos componentes dos aparelhos de micromanipulador especificados na tabela de materiais e microinjector, mas são geralmente aplicáveis a qualquer desses aparelhos.
   1. Monte o microinjector, anexando o tubo de pressão e o titular capilar.
   2. Lentamente, gire o dial de pistão até o óleo mineral preenche completamente a linha.
   3. Monte o titular capilar para a montagem de cabeça de tradução.
   4. Corrigi o capilar no suporte do capilar com a cabeça de aperto.
   5. Pipetar uma solução de 4% PBSA em um dos poços do isolador.
   6. Definição da palavra usando o micromanipulador e mergulhe a ponta do capilar para a solução.
   7. Encha lentamente o capilar com 4% PBSA e deixar de bloquear por 10 min.
   8. Ejete a conta e incline o módulo de tradução para que o assembly é claro do chip.

2. formar gotículas endereçáveis e carga com células únicas

1. Forma de gotículas endereçáveis
   1. Fixe o chip no palco microscópio.
      Nota: O microscópio é uma fluorescência invertido microscópio automatizado capaz de única molécula TIRF equipado com uma fase XY codificada e um elétron multiplicando a câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD) EM-.
   2. Grave as coordenadas de palco do microscópio de cada ponto na matriz usando o software de controle automatizado de microscópio.
   3. Defina o manipulador XYZ no palco microscópio. Coloque o bico em um ângulo de 50-60°. Certifique-se de que o bocal tem comprimento suficiente e autorização para alcançar o chip. Conjunto o 'aquosa' e 'petróleo' seringa bombas para dispensar 10 nL em 100 µ l/min e 5 µ l em 100 µ l/min, respectivamente.
      Nota: Durante a preparação, a solução aquosa à frente do bocal pode secar.
   4. Dispense a solução aquosa até que uma gota de líquido é visível à frente do bocal. Pincele com uma limpeza livre de poeira para removê-lo.
      Nota: Dependendo do número de condições sob investigação, reserve um número de poços para servir como reservatórios para as células. Para um única célula linha/tipo basta um único reservatório.
   5. Usando o software de controle automatizado de microscópio, defina as coordenadas de palco de microscópio para um local de anticorpo na matriz e foco na superfície da lamela.
   6. Cuidado para não perturbar o local, usando o manipulador XYZ, alinhe a ponta capilar de vidro do bocal para o lado do anticorpo ponto concêntrico e dispensar 10 nL de solução aquosa. Sem mover os estágios, dispense 5 µ l de óleo para tampar a solução aquosa. Lentamente, levantar o bocal claro de gota e mover para o próximo bem.
   7. Repita a etapa 2.1.6 para todos os pontos de anticorpo na matriz.
   8. Após 30 min, todos os pontos na matriz usando o software de controle automatizado de microscópio para determinar o plano de fundo de moléculas simples vinculado a cada anticorpo local antes de carregar as células da imagem.
2. Endereçáveis gotas com células de carga
   1. Remover os frascos de cultura de células de incubadora e separar as células usando a solução de tripsina/EDTA.
      Nota: Neste estudo, a BE humana cólon carcinoma celular linha foi usada e cultivadas usando modificado águias médio (DMEM de Dulbecco) suplementado com 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS) numa incubadora de CO₂ .
   2. Se necessário, mancha fluorescente de células.
      1. Ressuspender as células em uma solução de anticorpo de detecção 0.125 μg/mL (anticorpo anti-p53 (DO-1) rotulado com Alexa 488) em 10% FBS na mídia L-15. Para garantir uma suspensão de célula única, filtre a solução da célula através de um filtro de célula de arremesso de 40 µm.
   3. Contar as células usando um hemocytometer e diluir ou concentrar a solução de célula para uma concentração de 25-400 × 10³ células/mL. Isso garante que sedimentos de células com espaçamento suficiente para manipular confortavelmente a conta.
   4. Carrega células únicas em gotículas endereçáveis do reservatório de célula usando o micromanipulador e a conta.
      Nota: As células não-aderentes podem ser carregadas em massa para a micropipeta e dispensado um por um em gotas endereçáveis. Apesar do tratamento de superfície de bloqueio, linhas de células aderentes tendem a não especìfica furar a parede interna vidro conta e perder-se.
   5. Usando um objectivo × 10 para observar, use o microinjector para aspirar a uma única célula para a conta do reservatório de célula.
   6. Armazenar as coordenadas do palco micromanipulador se usando uma fase manipulador eletrônico ou manualmente, observe a posição de z.
   7. Retrai a micropipeta, traduzindo-o para cima para limpar a altura de 1 mm do chip. Fazer isso manualmente com um joystick ou automaticamente usando o recurso de 'Eject' do palco manipulador eletrônico.
   8. Conjunto que o palco coordenadas para que de uma gotícula endereçável o uso automatizado de software de controle de microscópio. 'Injete' a micropipeta por devolvê-lo para a posição de z armazenada (ou notável). Fazer isso manualmente com um joystick ou automaticamente se usando uma fase manipulador eletrônico.
      Nota: A conta irá perfurar o óleo tampando e situar-se dentro a parte aquosa da gota endereçável.
   9. Dispense a célula no endereçável droplet usando o microinjector. O volume de uma gota de endereçável 10 nL aumentará em menos de 1%.
   10. Repita o 2.2.5-2.2.9 para as restantes gotas endereçáveis deixando alguns livres para o controle experimental onde endereçáveis gotas não contém uma célula.
       Nota: Uma alternativa mais simples para carregar células únicas em gotículas endereçáveis usando uma conta e micromanipulador é substituir a solução na etapa 1.2.8 com uma solução de anticorpo de detecção em 4% contendo as células PBSA numa concentração da ordem de 10 ⁵ células/mL, equivalente a 1 célula/10 nL. Ocupação única célula será Poissonian e a concentração da célula precisa ser otimizado.
3. Lisar células e matriz de imagem
   1. Células de imagem em gotículas usando microscopia brightfield, incluindo quaisquer imagens de fluorescência.
      Nota: Imagem leva cerca de 3 min para ~ 100 gotas usando um microscópio automatizado de imagem. Executar a imagem com um at 60 = 1.49 objectivo de imersão de óleo. Sem filtros são requeridos para brightfield imagem Considerando que conjuntos de filtro padrão são usados para a imagem latente de fluorescência.
   2. Imagem de todos os pontos na matriz usando microscopia de TIRF única molécula.
      Nota: As configurações são usadas como no passo 2.3.1 com um especializados TIRF filtrar o conjunto. Essas imagens serão posteriormente analisadas na seção 3 para determinar o plano de fundo de moléculas simples ligado a cada ponto de anticorpo antes da lise. Imagem de molécula usando microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total leva cerca de 5 min de ~ 100 pontos de imagem.
   3. Concentre-se em uma célula em uma gota endereçável. Alcançar a completa lise óptica centrando-se um único 6 ns do laser de pulso (comprimento de onda de 1064 nm, pulso energias 14,1 ± 0,3 µ j por impulso) perto do local da célula.
      Nota: O pulso de laser configura uma bolha de cavitação em expansão que tesouras da célula e libera constituintes celulares dentro do volume da gota. ^{4 , 31} os processos mecânicos devido a Lise induzida por laser não perturbe a interface óleo-água em energias de pulso baixo. Lise óptica normalmente demora aproximadamente 20-30 min para lyse 100 células. Conforme discutido na seção de discussão, há um número de métodos alternativos para lisar células únicas se lise óptico instalação não é possível.
   4. Repita para todas as gotículas endereçáveis que contém a célula, deixando 5 grátis para o controle experimental onde endereçáveis gotículas contêm um un-lisados celulares.
   5. Observe o tempo em que cada célula é lysed.
      Nota: Estes tempos serão usados para corrigir as curvas de vinculação individual para cada ponto na etapa 3.1.9. Muitas vezes é suficiente para observar os momentos em que as células primeiras e últimas lysed e estimam o resto assumindo uma vez adequadamente consistente entre os eventos de Lise.
   6. Adquira imagens de molécula usando microscopia TIRF de todos os pontos de cada 10 min para o primeiro 30 min depois a cada 20 min para um mais 60 min. Se apenas interessado na quantidade de proteína vinculada no estado de equilíbrio, imagem todos os pontos depois de incubarem o chip para 90 min à temperatura ambiente.
      Nota: O tempo para atingir o equilíbrio dependerá do volume da gota e as afinidades dos anticorpos usados no ensaio. Microscopia TIRF é executada usando uma fonte de excitação do laser no = 488 nm e 1.5 mW de potência medida na abertura traseira usando um medidor de potência óptica. Única molécula imagens são adquiridas, definindo as configurações de aquisição da câmera do EM-CCD para 900 ms tempo de aquisição, digitalização de 16 bits, a taxa de leitura de 1 MHz e EM um ganho de fator de 10. O isolador pode ser reutilizado, removendo cuidadosamente a lamela.

3. análise de dados

1. Única molécula contando (regime de não-congestionado/digital)
   1. Usando Fiji (ou Matlab), para qualquer local de anticorpo não-congestionado, carrega a imagem adquirida antes de lise (fundo, BKD).
      Nota: As operações nas etapas a seguir direta são executadas usando software de análise de imagem de Fiji. Um guia de usuário pode ser encontrado no seguinte link https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html.
   2. Em Fiji, selecione a imagem BKD. Sob o menu "Imagem", selecione "Duplicado" para BKD duplicado. Selecione a imagem duplicada e sob o "processo > filtros", selecione "Gaussian Blur" e especificar um raio de 50 pixels.
   3. Achate a imagem BKD para que haja uma distribuição uniforme de intensidade efetiva da fonte de luz de excitação, dividindo a imagem BKD pela imagem borrada BKD, produzindo BKD_FLAT.
      1. Sob o "Processo", selecione "imagem calculadora...", especificando a operação "Fosso", as imagens necessárias e selecionando as caixas "Criar nova janela" e "resultado de 32-bit (flutuar)."
   4. Subtrair de cada pixel na imagem por 1 ("processo > matemática", selecione "Subtrair..." e especifique um valor de 1). A intensidade média do pixel deve ser 0.
      Nota: Campo achatamento e imagens de fundo achatado, podem ser controladas facilmente desde que a soma de todos os pixels deve ser 0 e qualquer deslocamento restante pode ser compensado mais direta.
   5. Selecione uma área de pixel pixel de 50 × 50 em qualquer um dos 4 cantos da imagem BKD_FLAT. Medir o desvio de padrão de intensidade do pixel (σ), selecionando "Analisar" e "Medida".
      Nota: As estatísticas de resumo da seleção serão apresentadas em uma janela de resultados. Isto determina o fundo do local onde há pouco provável que seja uma alta densidade de moléculas simples. A área a ser medida pode ser seleccionada manualmente usando as ferramentas de seleção de menu padrão ou executando a macro código "makeRectangle (x, y, largura, altura)"; Isso cria uma seleção retangular, onde x e y argumentos são as coordenadas (em pixels) do canto superior esquerdo.
   6. Definir o limite de imagem para 3σ e criar uma imagem binária SM_MASK.
      1. Em "Imagem > ajustar", selecione "Limiar..." e defina o nível de limiar inferior de 3σ.
         Nota: Pixels cujo valor está abaixo do limiar são definidas como zero e pixels exceder o limite são definidos como 1. O limite irá determinar a confiança com que thresholded pixéis pertencem a uma única molécula.
   7. Na imagem segmentada SM_MASK, pixel conjunto valores de intensidade para zero de quaisquer objetos que não têm um tamanho de pixel de 4-9² e uma circularidade de 0,5 - 1, selecionando "Analisar" seguido de "Analisar partículas" e especificando o tamanho e a forma circular.
      Nota: O tamanho do pixel pode precisar de ser otimizado para outro conjunto de fluorophores e microscópio altos. Devido ao tipo de ruído da câmera única pixels podem ser acima desse limite e não ser descartadas apesar de não serem moléculas simples. O critério de tamanho de pixel corretamente irá descartar esses pixels. Moléculas simples são geralmente circulares em forma. Um valor de circularidade de 1 indica um círculo perfeito, enquanto um valor aproximando 0 indica uma forma cada vez mais alongada. Os objetos restantes são moléculas simples e podem ser contados. Uma máscara pode ser definida para demarcar a área da mancha para discriminar no local e fora local conta por quadro. Isso é mais fácil para quadros adquiridos posteriormente quando há um sinal suficiente no local, que pode então ser aplicado aos quadros anteriores.
   8. Para o mesmo lugar de anticorpo não-congestionada, carregar e repita etapas 3.1.1 - 3.1.7 para todos os quadros de imagem capturaram como uma série de tempo-resolvido adquiriu post Lise. Use os tempos de Lise anotados no passo 2.3.5. para corrigir as curvas de ligação.
2. Única molécula contando (regime de congestionado/analógico)
   1. Para calcular a intensidade média de uma única molécula, antes de prosseguir, repita as etapas 3.1.1 - 3.1.8.
   2. Multiplica as imagens BKD_FLAT e SM_MASK para produzir uma imagem no qual valores de pixel não-zero estão associados a moléculas simples.
      1. Para realizar isto, sob o menu "Processo", selecione "Calculadora de imagem...", especifique a operação "Multiplicar" e as imagens necessárias e marque as caixas "Criar nova janela" e "resultado de 32-bit (flutuar)."
   3. Soma todos os valores de intensidade de pixel, selecionando "Analisar" e, em seguida, "Medida"; as estatísticas de resumo da seleção serão apresentadas em uma janela de resultados. Divida pelo número de moléculas simples contados conforme passo 3.1.8 para calcular a intensidade média por molécula.
   4. Para qualquer ponto de anticorpo congestionado, carregar a pós-lise imagem adquirida e alise com uma imagem de fundo desfocado conforme as etapas 3.1.2 e 3.1.3.
   5. Subtrair de cada pixel na imagem achatada por 1 ("processo > matemática", selecione "Subtrair..." e especifique um valor de 1)
   6. Selecione uma área de pixel pixel de 50 × 50 em qualquer um dos 4 cantos da imagem e medir o desvio de padrão de intensidade do pixel (σ). Consulte a etapa 3.1.5 para obter detalhes.
   7. Criar uma máscara de imagem binária, definindo o limite da imagem para 3σ e definir valores de intensidade do pixel a zero de qualquer objetos com um tamanho inferior a 4 pixel². Para realizar isto, sob o menu de "Analisar", selecione "Analisar partículas" e especifique o tamanho e a forma circular.
   8. Multiplique a imagem local achatada anticorpo congestionada pela máscara de imagem binária.
      1. Para realizar isto, sob o menu "Processo", selecione "Calculadora de imagem...", especifique a operação "Multiplicar" e as imagens necessárias e marque as caixas "Criar nova janela" e "resultado de 32-bit (flutuar)."
   9. Soma das intensidades pixel restantes selecionando "Analisar" seguido por "Medida"; as estatísticas de resumo da seleção serão apresentadas em uma janela de resultados.
   10. Divida a soma das intensidades de pixel pela intensidade média única molécula para calcular o número de moléculas único limite para o sitio congestionado.
3. Curva de calibração para quantificação absoluta
   1. Repita os pontos 1 e 2 para formar 10 gotas endereçável de nL com o anticorpo da deteção em solução a 4% PBSA cravada com uma proteína recombinante de concentração conhecida.
   2. Realizar uma série de concentração de 10²- 10⁷ proteínas recombinantes por gotículas, variando a concentração conhecida de proteína recombinante adicionada à solução. É recomendável trabalhar em termos de número de proteínas por gotículas tornar calibração única célula de dados simples.
   3. Use a série de concentração dados na etapa 3.3.2 para calibrar qualquer molécula conta por local de abundância de proteína por gotículas e pela abundância de proteína de extensão por uma única célula.

Resultados

O número de cópia absoluta proteína basal de p53 foi determinado com resolução única célula em uma linhagem de células de câncer de cólon humano, células BE. Demonstramos como expressão de p53 pode variar ao longo de várias ordens de grandeza e mostrar uma correlação positiva fraca entre número de cópia tamanho e proteína celular dentro da população de célula BE descanso.

Endereçável Droplet Microarrays fo...

Discussão

Endereçáveis da gota de Microarrays são um método sensível e extensível para determinar quantitativamente o número absoluto de cópia da proteína dentro de uma única célula.

Limitar o nível de ligação não-específica (NSB) é fundamental no âmbito do protocolo para alcançar tão baixo limite de detecção como possível. Proteínas e outras espécies bioquímicas não especìfica podem ligar para um número de interfaces presentes dentro das gotas — a superfície de lamela, o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Life Technologies	10010015
DMEM high glucose	Sigma	D6429
Foetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom	S0115
cell culture flasks	Corning	SIAL0639
Trypsin/EDTA	Biochrom	L2153
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microarray
Microcontact Arrayer	DigiLab, UK	OmniGrid Micro
Microcontact pin	ArrayIt, USA	946MP2
Coverslips (Nexterion)	Schott, Europe	1098523	Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibody	Enzo	ADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled	Santa Cruz	sc-126	stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate buffer	Gibco	15557-044
Betaine	Sigma	61962
Sodium dodecyl sulphate	Sigma	L3771
384 well plate (low volume)	Sigma	CLS4511
Nitrogen gas cylinder	BOC	Industrial grade, oxygen-free
Name	Company	Catalog Number	Comments
Droplets
Micromanipulator	Eppendorf	Patchman NP2
Manual Microinjector	Eppendorf	CellTram Vario
Micropipette	Origio, Denmark	MBB-FP-L-0
Syringe pumps	KD Scientific	KDS-210
100 μL syringe	Hamilton	81020	Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringe	Hamilton	81327	Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolator	Grace Bio-Labs	JTR24R-A-0.5	6x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutter	VersaLASE	VLS2.30 CO2 Laser 3W	for laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheet	Weatherall-UK	Clarex Precision Sheet 001	for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet	3M		used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glue	Loctite	LOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing	IDEX	FS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing	IDEX	1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing	Kinesis	008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing	IDEX	1673
Bovine Serum Albumen (BSA)	Fisher Scientific	BP9700100
Mineral oil	Sigma	M5904
Ultra-pure water	Millipore, Germany	MilliQ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stage	Nikon, Japan	Nikon Ti-E
EM-CCD	Andor Technologies, Ireland	IXON DU-897E
Laser excitation source	Vortran, USA	Stradus 488-50
Optical lysis laser source	Continuum, USA	Surelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRF	Chroma, USA	z488bp
Microscope filter cube for Optical Lysis	Laser 2000, UK	LPD01-532R-25
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Fiji	Open Source		Image analysis software
Matlab	Mathworks	version 7.14 or higher	Image analysis software