JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للحث على التهاب الشلل وأوبتيكوسبينال بنقل أكوابورين-4 (AQP4)-خلايا T معينة من AQP4--/-- الفئران في وزن الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، نحن توضح كيفية استخدام التصوير المقطعي التماسك البصري التسلسلي لرصد الخلل في النظام المرئي.

Abstract

في حين أن من المسلم به أن أكوابورين-4 (AQP4)-محددة من خلايا تي والأجسام المضادة للمشاركة في الآلية المرضية المياليني البصري (نمو)، ومرض دملينتينغ الذاتية البشرية الجهاز العصبي المركزي (CNS)، إنشاء نموذج AQP4 التي تستهدف على حد سواء وقد ثبت المظاهر السريرية ونسيجية للجهاز العصبي المركزي المناعة الذاتية تحديا. تحصين فئران البرية من نوع (WT) مع الببتيدات AQP4 آثار انتشار الخلايا T، على الرغم من أن تلك الخلايا T لا تستطيع نقل المرض إلى الفئران المستفيدة من السذاجة. في الآونة الأخيرة، تم تحديد رواية اثنين [ابيتوبس] خلية AQP4 T والببتيد (ف) 135-153 و p201-220، عند دراسة الاستجابات المناعية ل AQP4 في الفئران تعاني من نقص AQP4 (AQP4--/--)، مما يوحي بمفاعليه خلية T لهذه [ابيتوبس] يتم التحكم عادة بالغدة الصعترية الانتقاء السلبي. AQP4--/-- Th17 الاستقطاب خلايا تي جاهزة إلى p135 153 أو p201-220 المستحث شلل في المتلقي WT الفئران، التي كانت مرتبطة بالغالب ليبتومينينجيل التهاب الحبل الشوكي والأعصاب البصرية. التهاب الأعصاب البصرية المحيطة بها ومشاركة طبقات الشبكية الداخلية (أيرلندا) ظهرت تغيرات في التصوير المقطعي التماسك البصري التسلسلي (OCT). وهنا، نحن لتوضيح النهج المستخدمة لإنشاء هذا في فيفو النموذج الجديد للجهاز العصبي المركزي استهدفت AQP4 المناعة الذاتية (ATCA)، التي يمكن أن تستخدم الآن لدراسة الآليات التي تسمح بتطوير خلايا تي الخاصة AQP4 المسببة للأمراض، وكيف أنها قد تتعاون مع ب الخلايا في نمو المرضية.

Introduction

المياليني البصري (نمو) مرض الجهاز العصبي المركزي (CNS) الذاتية التهاب دملينتينغ تؤدي الحلقات المتكررة من الشلل وفقدان البصرية مما يؤدي إلى العجز الدائم العصبية1. ويعتبر نمو حاليا أساسا أن يكون أمراض المناعة الذاتية خلطيه2 كما أنه يرتبط مع الأجسام المضادة (Igs) استهداف أكوابورين-4 (AQP4)، قناة مياه أعرب عن وفرة في أستروسيتيس3،4. ومع ذلك، التهاب الجهاز العصبي المركزي شرط أساسي لدخول الجهاز العصبي المركزي AQP4 Ig5،6. وهكذا، لم المحتملة وضع نموذج لنمو بنقل Igs AQP4 المضادة وحدها. النتائج التي توصل إليها أن Igs AQP4 على حدة (1) المسببة للأمراض في نمو المرضى هي IgG11،2، Ig خلية T-تعتمد على تحديد خلايا تي7 (2) فئة فرعية في نمو الآفات8،9 (3) نمو مرتبط مع بعض الجينات الثاني MHC (مثلاً هلا-DR17 (DRB1 * 0301))10، و proinflammatory (4) الدكتور AQP4 المتفاعلة-Th17 المقيدة هي توسيع نطاق الخلايا في نمو مرضى11،12 جميع تشير إلى أن خلايا تي AQP4 الخاصة بدور رئيسي في نمو المرضية. وبالتالي، من المهم وضع نماذج حيوانية لتحديد كيفية الخلايا T AQP4 محددة قد تسهم في نمو المرضية.

منذ عدة سنوات، حددت [ابيتوبس] خلية AQP4 T متعددة في البرية من نوع (WT) الفئران13،14 والجرذان15. وفي حين لوحظ أن خلايا تي AQP4--رد الفعل يمكن أن تحفز التهاب أوبتيكوسبينال في السذاجة الفئران المستفيدة15،16، لم تراع علامات سريرية كبيرة من أمراض الجهاز العصبي المركزي. وبالمثل، مباشرة تحصين الفئران WT مع الببتيدات المحتوية على AQP4 تي خلية [ابيتوبس]14،17، أو نقل خلايا proinflammatory تي تستهدف تلك المحددات17، ولم تتسبب في علامات سريرية أو نسيجية أدلة على الجهاز العصبي المركزي المناعة الذاتية.

مؤخرا، فإنه لوحظ أن تحصين الفئران C57BL/6 AQP4-ناقص (AQP4--/--) مع AQP4 الببتيد (ف) 135-153 أو p201-220، المحددات اثنين وتوقع لربط الثاني MHC (-أب) مع تقارب عالية18، أثارت CD4 قوية + خلية T الردود17. في المقابل، أثارت هذه الببتيدات اثنين فقط من الردود التكاثري متواضعة في الفئران WT. علاوة على ذلك، كان مرجع الخلية تي مستقبلات (تكر) المستخدمة للتعرف على هذه المحددات بخلايا تي من الفئران--/-- AQP4 فريدة من نوعها. جماعياً، تشير هذه النتائج إلى أن الاعتراف بخلية T AQP4 ينظم الغدة الصعترية الانتقاء السلبي. AQP4 p135-153-أو p201-220-الخاصة بخلايا Th17 من AQP4--/-- الفئران المانحين الناجمة عن الشلل الذي أصاب قرابة 100 في المائة من السذاجة الفئران WT المتلقية؛ وهذا كان مرتبطاً أوبتيكوسبينال تتسرب من خلايا T وخلايا ب ووحيدات. أوبتيكوسبينال التسلسلي التماسك التصوير المقطعي (OCT) أظهرت مشاركة منظومة بصرية ديناميكية. الفئران بالمناعة الذاتية بوساطة الخلايا T AQP4 التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي (ATCA) تعافي من الشلل وإصابة النظام المرئي. خلافا ع الناجمة عن المايلين أوليجوديندروسيتي بروتين سكري (موج) p35-55-الخاصة بخلايا تي، مما أدى إلى استمرار الأمراض السريرية، ATCA الناجمة عن خلايا تي وحدها لم يترافق مع فقدان محواري أو انخفاض في خلايا العقدة الشبكية (رجكس). النتائج التي توصلنا إليها أثبتت بوضوح أن هناك عدة محددات خلية AQP4 T المسببة للأمراض. هذا النموذج الجديد من ATCA مفيد لدراسة آليات مراقبة تطوير خلايا تي الخاصة AQP4 المسببة للأمراض، تعلم كيفية حمل تلك الخلايا التهاب الجهاز العصبي المركزي، وكيف أنها قد تتعاون مع AQP4 الخاصة ب الخلايا والأجسام المضادة لتعزيز نمو المرضية .

في هذا التقرير، يصف لنا البروتوكولات المستخدمة للحث وتقييم ATCA المستحثة بخلية تي. نبدأ مع التقنيات المستخدمة للتطعيم وزراعة الخلايا T والاستقطاب، Th17 لتوليد خلايا تي الخاصة AQP4 المسببة للأمراض، تحليل التدفق الخلوي لتأكيد الاستقطاب والتبني نقل تلك الخلايا T. ثم يصف لنا الأساليب المستخدمة لتقييم الأمراض السريرية ونسيجية واستخدام OCT المسلسل لرصد إصابة النظام المرئي في الفئران المستفيدة.

Protocol

كافة الإجراءات الحيوان أجريت امتثالا للمبادئ التوجيهية التجريبية التي أقرتها جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة. C57BL/6 (H-2 ب) الفئران الإناث، وتم شراء 8 أسابيع عمر، وقدمت AQP4 C57BL/6 --/-- الفئران بيركمان أ.

1-"التحصين من الفئران" مع الببتيدات AQP4

  1. إعداد فروند كاملة ' s adjuvant (CFA) العامل المخزون.
    1. تطحن ناعما إعداد يهتمان السل م (H37Ra) باستخدام قذائف الهاون والمدقة.
      2. أرض
    2. إضافة H37Ra إلى فروند غير مكتملة ' adjuvant s إلى تركيز نهائي 4 مغ/مل. يمكن تخزينها فرنكات الجماعة المالية الأفريقية في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. المجففة بالتبريد حل الببتيد مستضد (Ag) AQP4 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بتركيز 1 ملغ/مل نهائي. تحتفظ في 4 درجات مئوية أو مدت
  3. إعداد الجمعية 2 اللوير لوك المحاقن، انضم مع محبس الحنفية، التي تحتوي على مستحلب فرنكات الجماعة المالية الأفريقية/الببتيد-
    1. إرفاق حقنه اللوير لوك زجاج دون المكبس إلى محبس الحنفية 3-طريقة نايلون مع اتصالات قفل اللوير الذكور 2. إغلاق محبس الحنفية طريق التحول الرافعة نحو المحاقن. ضع نهاية مفتوحة للمحاقن أعلى، مما يسمح حقنه بمثابة أنبوب اختبار. ضع هذا في حامل أنبوب للاستقرار وأضاف-
    2. دوامة فرنكات الجماعة المالية الأفريقية العامل المخزون والحل Ag. إضافة وحدة تخزين 1:1 من الببتيد/فرنك للمحاقن مفتوحة. 200 ميليلتر من فرنكات الجماعة المالية الأفريقية/Ag (4 × 50 ميليلتر) مطلوب للماوس-
      ملاحظة: بشكل عام، يتم فقدان حوالي 1 مل إعداد في محبس الحنفية، مما سيقلل من المبلغ المتاح للتحصين. ولذلك، من المهم إدراج هذا في حساب الحجم الإجمالي المطلوب.
      على سبيل المثال: لتحصين الفئران 5: (200 ميليلتر/الحيوانات x 5 الحيوانات) + 1 مل الحجم الإضافي = 2 مل المطلوب مجموع فرنكات الجماعة المالية الأفريقية/Ag-
    3. إدراج المكبس الزجاج في المحاقن، وحين عقد في المكان، عكس المحاقن حيث أن محبس الحنفية وموجه نحو الأعلى. التبديل رافعة محبس الحنفية إلى اتصال الإناث غير المستخدمة. تطبيق الضغط على المكبس الزجاج من أجل إزالة الهواء الزائد من المحاقن بعناية. السائل يملأ الاتصال قفل اللوير الذكور الثاني من محبس الحنفية.
      4. إرفاق
    4. حقنه زجاجية ثانية (الغطاس تم إدخالها بالكامل) في الثانية ربط قفل اللوير الذكور محبس الحنفية. وهذا ينبغي أن يكون نظام مغلق من المحاقن الزجاجية 2 ترتبط محبس الحنفية التي تتضمن كالهواء الزائد قليلاً قدر الإمكان.
      5. مزيج
    5. لخلق مستحلب، بدفع بلونجيرس لتمرير السائل بالتناوب بين الحقن 2 لحوالي 2 دقيقة البرد تكرار الحقن على الجليد لحوالي 10 دقيقة تقشعر لها اﻷبدان، وخلط حتى يكون هناك تغيير واضح في لزوجة إعداد ، نتج عنه مستحلب قاسية جداً، بيضاء. في الثلاجة الحقن التي تحتوي على مستحلب عند 4 درجة مئوية أو الحفاظ على مدت
  4. نقل كل من المستحلب لحقنه اللوير لوك زجاج واحد وإزالة المحاقن الزجاجية الفارغة واستبداله بحقنه اللوير لوك 1 مل للحقن. ملء المحاقن الجديدة مع مستحلب وإزالته من محبس الحنفية وإرفاق إبرة (25 x 5/8)-
  5. " الماء-اختبار " مستحلب للاتساق. طرد قطره من المستحلب في طبق صغير من الماء. ينبغي أن لا تفريق المستحلب، مشيراً إلى أنها مناسبة لحقن.
    1. إذا تسارع شرط المستحلب، أنها ليست جاهزة للحقن؛ ونقل السائل مرة أخرى إلى الزجاج المحاقن والاستمرار في خلط والبرد ثم مرة أخرى حتى يتم شكل مستحلب قاسية.
    2. اختبار المستحلب مرة أخرى حتى يتحقق الاتساق السليم.
  6. حقن الفئران -/- الجهات المانحة AQP4 تحت الجلد (الليبي) مع مستحلب يحتوي على الببتيد AQP4. ويتلقى كل الماوس 4 x 50 ميليلتر الليبي الحقن (200 ميليلتر الكامل (100 ميكروغرام الببتيد)). 4 مواقع تشمل كلا من الجانبين من أسفل البطن، والتي تصب في العقد اللمفية الاربية (LN)، وكلا الجانبين من الصدر الجدار الآنسي لكل الإبط، التي تصب في إبطي LN. وسيتطلب نقل التبني 1-2 الجهات المانحة المحصنين الفئران كل مستلم الماوس.

2. زراعة الخلايا T و Proinflammatory T خلية الاستقطاب

  1. 10-12 يوما من التحصين، جمع LN من الفئران.
    1. في علبة جليد، إعداد أطباق بيتري 60 ملم مزودة بمصفاة خلية (مش حجم 70 ميكرومتر) وتحتوي على وسائط الإعلام ربمي برود مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) و 100 يو/مليلتر البنسلين-100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (القلم-بكتيريا) (RFPS)-
    2. الفئران يوثانيزي بالتعرض لأول أكسيد الكربون 2، يليه سرطان عنق الرحم التفكك. تزج الفئران في الإيثانول 70% ودبوس ثم كل قاطع إلى لوحة تشريح.
    3. قص شق جلد خط الوسط من الفخذ في الرقبة وأسفل كل ساق. سحب الجلد بعيداً عن الصفاق ودبوس تاوتلي إلى المجلس. تشريح LN الاربية وابطي ووضع في طبق بتري تحتوي على طلبات تقديم العروض، على الجليد. 19
    4. لتجارب نقل التبني، الجمع بين قانون الجنسية من جميع الحيوانات داخل نفس المجموعة التحصين. لتحليل سيتوميتريك تدفق من الاستخدام Vβ، فصل قانون الجنسية من الحيوانات الفردية-
  2. وضع مصفاة الخلية التي تحتوي على LN على أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي التي تتضمن طلبات تقديم العروض. استخدام شقة نهاية المكبس المحاقن المعقمة 5 مل للضغط LN الخلايا من خلال المصفاة، الغسيل مع 20-30 مل من طلبات تقديم العروض لتسهيل استعادة الخلايا. الحفاظ على الخلايا LN على الجليد في جميع أنحاء تجهيز حتى وقت للثقافة-
  3. يغسل مرتين، سينتريفوجينج في س 393 ز لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل الثاني، ريسوسبيند LN الخلايا في خلية T وسائط الإعلام (الطب الصيني التقليدي). يتضمن الطب الصيني التقليدي ربمي مع 10% الحرارة-إبطال FBS، 292 ميكروغرام/مل ل الجلوتامين، 110 بيروفات صوديوم ميكروغرام/ملليلتر، وميكرومتر 55 2-mercaptoethanol وبكتيريا القلم. نموذجياً، يتم استخدام وحدة تخزين من 5 مل الطب الصيني التقليدي في الماوس المانحة.
  4. عد الخلايا LN. العائد المتوقع من حوالي 3-6 × 10 7 LN الخلايا كل المانحين الماوس المحصنين. جانبا 3-4 × 10 6 مقايسة انتشار (انظر القسم 3 أدناه)-
  5. إعداد الاستقطاب الثقافات لنقل التبني (الجزء 6)-
    1. إعداد ثقافة استقطاب Th17 5 × 10 6 LN الخلايا كل مل مع 10 ميكروغرام/مل Ag، 20 نانوغرام/مليلتر الماوس المؤتلف انترلوكين (إيل)-23 و 10 نانوغرام/مل المؤتلف فأرة إيل-6 في الطب الصيني التقليدي.
    2. بدلاً من ذلك، لاستقطاب Th1، تعد ثقافة من 5 × 10 6 LN الخلايا كل مل مع 10 ميكروغرام/مل Ag والفأر 10 نانوغرام/مل المؤتلف إيل-12 في الطب الصيني التقليدي.
      3. إضافة
    3. 2 مل (1 × 10 7 الخلايا) في البئر في خليط ثقافة الاستقطاب في لوحة 12-جيدا. سيتم تعبئة الخلايا LN من 2-4 الجهات المانحة الفئران لوح 12-بئر واحد. الحفاظ على الثقافات في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 ل 72 h.
    4. بصريا فحص الخلايا LN في الثقافة للتنشيط في ح 48 وحاء 72 المنشط الخلايا ستشكل مجموعات واسعة النطاق والخلايا T سوف تزيد في حجمها، وأن تصبح أكثر بليومورفيك. الزيادة في الأيض سيؤدي إلى خفض درجة الحموضة في وسائط الإعلام، وتغيير من الخوخ إلى اللون البرتقالي. إذا كان الرقم الهيدروجيني منخفضا بما يكفي لتشغيل وسائط الإعلام الصفراء، أضف 1 مل من الطب الصيني التقليدي الطازجة لمنع سمية للخلايا في h. 24 المتبقية
    5. تابع للقسم 6 لنقل التبني. من الممكن التحقق من كفاءة الاستقطاب سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ (ICS)، كوصفعبد في القسم 5-
  6. إعداد الثقافات استخدام قانون الجنسية من الفئران الفردية لتحليل سيتوميتريك التدفق السطحي Vβ التعبير (القسم 4)-
    1. إعداد 5 × 10 6 خلايا LN كل مل مع 10 ميكروغرام/مل Ag في الطب الصيني التقليدي.
    2. إضافة 2 مل (1 × 10 7 خلايا) الثقافة الواحدة وكذلك في لوحة 12-جيدا. ينبغي الاحتفاظ بالثقافات في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 لمدة 10 أيام. انتقل إلى القسم 4-

3. انتشار الإنزيم

ملاحظة: وما زال هذا من القسم 2-4.

  1. إعداد 3-4 مل خلايا LN في أنبوب، في 2 × 10 6 خلايا كل مل في الطب الصيني التقليدي.
  2. بلطف مزج الخلايا بعكس الأنبوبة عدة مرات، وثم نقلها إلى حوض عقيم.
  3. استخدام بيبيتور متعدد القنوات للوحة 100 ميليلتر من الخلايا الواحدة وكذلك إلى جولة 96-جيدا أسفل لوحة زراعة الأنسجة. نموذجياً، لوحة 15 بئرا لاختبار ثلاث 4 جي تركيزات ومرجع جي لا.
  4. تمييع Ag في الطب الصيني التقليدي بتركيزات مختلفة، عادة 80، 20، 5, 1 و 0 ميكروغرام/مل (للأسهم x 2). إضافة 100 ميليلتر من كل تركيز في ثلاث نسخ لتركيز نهائي من 40، 10، 2.5. 0, 5 و 0 ميكروغرام/مل. احتضانها لحوالي 72 ح في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خطوات 3.5 من خلال 3.7 تنطوي على المواد المشعة. ينبغي إجراء الاستخدام الصحيح، ورصد والتخلص من المواد المشعة، ووفقا للوائح الحكومية والمؤسسية-
  5. تعد حلاً أسهم عامل 3 ح-thymidine (40 µCi/mL) إضافة 1 mCi 3 ح-thymidine إلى 25 مل ربمي، وتخزين هذا في 4 ° بيبيت جيم 0.5 مل الحل العامل في حوض عقيم.
  6. إضافة 25 ميليلتر من 3 ح-thymidine (1 µCi) الواحدة وكذلك استخدام بيبيت الأقنية. احتضانها ح 18 إضافية في 37 درجة مئوية.
    7. حصاد الخلايا على حصيرة مرشح زجاج حصاده خلية 96-جيدا باستخدام
  7. وشطف مع الإيثانول 70%. بعد التجفيف، ختم حصيرة عامل التصفية في كيس من بلاستيك عينة مع 5 مل التﻷلؤ السائل. قياس النشاط الإشعاعي في كل أيضا استخدام عداد التﻷلؤ.

4. تدفق التحليل الخلوي "الخلية سطح تكر Vβ التعبير"

ملاحظة: وما زال هذا من 2.6 الفرع. الأجسام المضادة للماوس تكر Vβ 2، 3، 4، 5.1 و 5.2، 6، 7، 8.1 و 8.2، 8.3، 9، 10 باء، 11، 12، 13، 14، و 17a متوفرة تجارياً لاختبار التعبير تكر Vβ.

  1. للكشف عن Vβ تكر، إزاحة الخلايا T من لوحة الثقافة من بيبيتينج عدة مرات ونقل الخلايا إلى أنبوب.
  2. يغسل مع نظام مراقبة الأصول الميدانية مخزن (إف ب) يحتوي على 2% FBS وأزيد الصوديوم 0.1% 2 مم يدتا في برنامج تلفزيوني.
  3. نقل الخلايا إلى لوحة 96 الخامس-أسفل بئر في كثافة 1 × 10 5 إلى 3 × 10 6 خلايا كل بئر. إذا كان يجري اختبار الفريق Vβ بأكمله، وينبغي أن توزع الخلايا في آبار متعددة (بئر واحدة كل Vβ التي يجري اختبارها).
  4. استبعاد الخلايا الميتة من تحليل تدفق سيتوميتريك بصبغة بصبغة بقاء حية/الميت، الذي يتفاعل مع الأمينات الحرة كشفها بواسطة نخرية الخلايا. تتبع الشركة المصنعة ' s تعليمات للطرد المركزي واستثارة في صبغ البقاء. احتضان على الجليد ل 10-20 دقيقة في جميع أنحاء الخلية تلطيخ الإجراءات وحماية الخلايا من الضوء والحفاظ على مدت
  5. بعد الحضانة، تغسل اللوحة مرة واحدة في إف. للكشف عن Vβ تكر، تعليق الخلايا في 100 ميليلتر من FB تتضمن تخفيف 1: 100 من الأجسام المضادة لخلايا CD4 (استنساخ RM4-5) وتكر Vβ. احتضان لمدة 15-60 دقيقة على مدت
    6. أغسل اللوحة مرة في إف
  6. وإصلاح الخلايا بإضافة 200 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% المخفف في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. أغسل اللوحة في إف وتحليلها بالتدفق الخلوي-

5. تحليل سيتوميتريك "إنتاج سيتوكين داخل الخلايا" تدفق

  1. سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ (ICS)، تعامل الثقافات الخلية T مع إضعاف البروتين النقل المانع كاشف (مثلاً، جولجيبلوج) 1:1,000 في الطب الصيني التقليدي، ح 4 قبل ICS لمنع سيتوكين إفراز. في ذلك الوقت، تنشيط خلايا تي مع 50 نانوغرام/مل phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (PMA) وإيونوميسين 500 نانوغرام/مليلتر من أجل الحث على إنتاج البروتين.
  2. بعد 4 ح للثقافة في 37 درجة مئوية، إزاحة الخلايا من لوحة الثقافة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ونقل إلى أنبوب الطرد مركزي (15 أو 50 مل)-
    3. أغسل
  3. مع إف. الخلايا في إف ونقل إلى لوحة 96 الخامس-أسفل بئر في كثافة 5 × 10 5 إلى 3 × 10 6 خلايا كل بئر ريسوسبيند-
  4. الخلايا وصمة عار مع بقاء صبغ كما هو موضح أعلاه (الجزء 4-2). بعد الاحتضان، غسل اللوحة مرة واحدة في إف ب.
  5. إضافة الأجسام المضادة للكشف عن علامات السطحية كما يلي:
    1. للكشف عن علامات السطحية، تعليق الخلايا في 100 ميليلتر من FB تتضمن تخفيف 1: 100 من الأجسام المضادة لخلايا CD4 (استنساخ RM4-5)-
    2. اختيارياً، تشمل الأجسام المضادة ل B220 (استنساخ 30-F11) و CD11b (استنساخ M1/70) في إضعاف 1: 100 لتحسين النابضة للخلايا ب وحيدات/الضامة، على التوالي. وبصفة عامة، مكافحة PE-Cy7-CD4 ومكافحة فيتك-B220 ومكافحة بيركب-Cy5.5-CD11b تعمل بشكل جيد. اختيار يصرف جسم/fluorochrome ينبغي أن تسترشد بتكوين سيتوميتير تدفق لاستخدامها لتحليل، وينبغي تحديد التركيزات المثلى للأجسام المضادة تجريبيا.
    3. احتضان لمدة 15-60 دقيقة على مدت
  6. تغسل اللوحة مع إف وريسوسبيند الخلايا في 200 ميليلتر من حل التثبيت/بيرميبيليزيشن لمدة 20 دقيقة على الجليد. هذا سيتم إصلاح الخلايا وبيرميبيليزي في الأغشية.
    7. استخدام
  7. من أجل الحفاظ على بيرميبيليزيشن في أغشية الخلايا أثناء تلطيخ داخل الخلايا، بيرم/يغسل المخزن المؤقت (PW) (المخفف 01:10 من المخزون X 10) بدلاً من إف. غسل الآبار في 200 ميليلتر من PW.
  8. "للمركز"، إعداد إضعاف 1: 100 من الأجسام المضادة لمضاد للفيروسات (إيفن)-γ وايل-17A استخدام 1 x PW. خيار واحد هو APC المضادة-IFN-γ (استنساخ XMG1.2) وبي مكافحة--إيل-17A (استنساخ eBio17B7) الذي يعمل بشكل جيد. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من الأجسام المضادة داخل الخلايا كوكتيل واحتضان ثم لمدة 15 دقيقة على الأقل. من الممكن أيضا أن يواصل تلطيخ بين عشية وضحاها في 4 ° C.
  9. غسل الآبار في 200 ميليلتر من الأسبق واستثارة في إف للتدفق الخلوي-
  10. في نفس الوقت، إعداد نموذج أونستينيد (الخلايا في إف دون الأجسام المضادة) لتحسين الفولتية الكاشف، وعينات الملطخة بمفرده لكل فلوروتشرومي الفردية (أي الخلايا أو تعويض الخرز الملون مع جسم واحد فقط/فلوروتشرومي) إلى تحديد قيم التعويضات المباشرة.
  11. باستخدام سيتوميتير تدفق، الحصول على ≥ الخلايا 10,000 (الأحداث)، النابضة في خلايا CD4 (لايف/قتلى-سلبية) قابلة للحياة + الخلايا. لضمان النابضة دقيقة لخلايا T، يستبعد B220 + و CD11b + الخلايا (خلايا ب وحيدات/الضامة، على التوالي). داخل خلايا CD4 + تي الخلية يتدنى، تحديد النسبة المئوية للخلايا معربا عن IFN-γ (Th1 النسب) أو إيل-17A (Th17 النسب)-

6. خلايا "نقل من الممرضة" تي AQP4--الخاصة بالتبني

ملاحظة: يتبع هذه الخطوة من 2.5 القسم: خلية T الثقافة و proinflammatory الاستقطاب خلية T.

لوحات
  1. الخلايا استعادة الاستقطاب من 12-بئر بيبيتينج صعودا وهبوطاً لإزاحة، وتحويلها إلى أنبوب 50 مل. ماجستيرإينتين على الجليد حتى الحقن.
    2. عد الخلايا
  2. وتغسل مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة، وإعداد تعليق 1 × 10 8 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني. وبصفة عامة، حقن الخلايا بعد ساعة.
  3. بلطف مزج الخلايا بدوامات ونقل إلى حقنه 1 مل وقت الحقن. إدارة 200 ميليلتر من الخلايا (2 × 10 7) عن طريق الوريد الوريد (رابعا) إلى كل الماوس، من خلال الذيل.
    4. حقن
  4. كل القائمة الماوس المتلقي مع 200 نانوغرام السمية باء-السعال الديكي مخففة في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ذلك اليوم، وبعد ذلك بأيام 2. رصد الفئران يوميا بحثاً عن علامات المرض الإكلينيكية.

7. التقييم اﻻكلينيكي ل ATCA

  1. دراسة الفئران المستفيدة يوميا للأعراض الإكلينيكية للجهاز العصبي المركزي المناعة الذاتية. وبصفة عامة، الفئران سوف تظهر علامات المناعة الذاتية CNS 5-8 أيام بعد التبني نقل الخلايا T AQP4 محددة. الفئران وسوف تظهر الأعراض السريرية للخلل في الجهاز العصبي. أنه من المفيد القيام بالتقييمات على ماوس ساذجة لتعريف القدرة العادية لماوس.
    2. لهجة
  2. الفئران تقييم للخسائر في الذيل. عقد الفئران بلطف عند قاعدة الذيل ورفع وضع مستقيم. أن droops باستمرار وصف خسارة ذيل ذيل لهجة (درجة 1). خسارة لهجة الذيل في كثير من الأحيان أول بادرة من الأمراض السريرية-
  3. اختبار لتصحيح العاكسة بوضع الماوس على ظهرها على سطح مستو. تصحيح بطء علامة إينكوردينيشن truncal (درجة 2). ماوس السذاجة ستقاوم تماما أي محاولة لوضعه على ظهره، حتى يتم تسجيل أي بطء في القدرة على الحق كخلل. أنها نموذجية لاختبار الماوس 3-4 مرات لهذا المنعكس.
  4. تقييم الموقف وأمبوليشن. تبدأ الفئران لإظهار تغيير في الموقف أدى إلى خفض أو سحب الوركين خلال أمبوليشن (نقاط 2.5). كذلك نتائج المرض في مونوبليجيا، الشلل الكامل هند أحد أطرافهم (نقاط 3.0) والشلل النصفي، الشلل الكامل من كلا هند الأطراف (نقاط 3.5). نتائج معتدلة كوادراباريسيس، ضعف جميع الأطراف الأربعة، في التحرك إلى الأمام بطيئة جداً (4 نقاط). كوادراباريسيس شديدة يسمح تقريبا أي تحرك إلى الأمام (درجة 4-5). أخيرا، مع المرض الشديد وقد أصبحت تحتضر أو تموت (من 5 نقاط)-
  5. إدارة للفئران التي تفقد القدرة على الحصول على الغذاء السائل أو الصلب 1 مل جلوكوز 5% في القائمة المالحة وبدلاً من ذلك، استخدام مكملات مع سائل هلام أكواب، عالية السعرات الحرارية الضعفاء جل ولحم الخنزير المقدد لمواجهة الجفاف والحرمان من الطعام. Euthanize الفئران تحتضر.

8. إعداد الأنسجة والأنسجة

  1. تخدير الفئران مع الكيتامين 100 مغ/كغ و xylazine 10 مغ/كغ، وثم يعلقون كل قاطع إلى لوحة تشريح.
  2. فتح أعلى الصدر وتعريض القلب. جداً في الكبد للسماح بتدفق الدم. إرفاق إبرة فراشة للأنبوب مضخة متغيرة السرعة مينيفلوو باستخدام خزان منفصل لبرنامج تلفزيوني و 10% فورمالين. أدخل الإبرة في البطين الأيسر للقلب ونتخلل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، تليها 25 مل من 10% فورمالين.
  3. إزالة الرأس، ومن ثم العينين. عملية عيون وشبكية العين كما هو موضح سابقا 20. قص عبر مأخذ العين وإدراج مقص في الآنف وقطع الجمجمة عرفت الخلفي على كل جانب.
    1. إزالة الجمجمة وفضح الأعصاب البصرية وقطع chiasm البصرية ووضع في كاسيت بين منصات رغوة 2-
    2. تزج في الفورمالين 10% (24 ساعة)، وثم 50% إيثانول (24 ساعة) ونقل بعد ذلك إلى إيثانول 70%-
  4. إزالة الدماغ والعمود الفقري وفي فورمالين 10%. متسلسل من قسم العقول في الطائرة الاكليلية؛ قسم الشوكي الحبال في السهمي (حوالي النصف) وطائرات coronal التسلسلي (حوالي 20 المقاطع العرضية للماوس)-
  5. عينات CNS العملية بشكل روتيني لتضمين البارافين. وصمة عار 8 ميكرومتر أبواب سميكة مع الهيماتوكسيلين ويوزين (الأعصاب البصرية) أو لوكسول سريعة الأزرق-توضع وويوزين (المخ والحبل الشوكي).
  6. تقييم الأعصاب البصرية لوجود التهاب داخل العصب والسحايا المحيطة بها (التهاب العصب البصري) أو في معظمها في السحايا المحيطة بها (الألياف البصرية بيرينيوريتيس)-
  7. عد البؤر التهاب سحائي ومتني (> 10 خلايا وحيدات النوى متفاوت المسافات) في عينات المخ والحبل الشوكي لكل الماوس.

9. في فيفو الشبكية التصوير "التصوير المقطعي التماسك الضوئية" (OCT)

ملاحظة: المجال الطيفي أكتوبر تصوير الشبكية للفئران تتم باستخدام المعدات التجارية (مثلاً، سبيكتراليس مع تعقب العين تروتراك) لتحقيق متسقة العين التوجه والحد من القطع الأثرية الحركة.

  1. خمس دقائق قبل التصوير، تمدد التلاميذ مع تروبيكاميدي 1% (قطره واحدة في العين) وضع الماوس تصويرها في قاعة تحريض التخدير، توفير تدفق مستمر من 2 لتر لكل دقيقة (1.5% إيسوفلوراني). بدوره على حصيرة الحرارة وإعداد القفص الانتعاش بعد التخدير.
    2. ضع الماوس على اسطوانة التصوير
  2. وإعادة توجيه تدفق التخدير تبعاً لذلك. حماية العينين مع 0.3% هيدروكسيبروبيل methylcellulose لإبقاء العين رطبة وضمان استمرارية الانكسار. ضع عدسة الاتصال مخصصة في العين لدراسة-
  3. الموجهة بصورة النظارة الأشعة تحت الحمراء، توجيه الليزر للعين، وضمان الشعاع يتركز على رأس العصب البصري. الرأسي والأفقي بمسح أكتوبر ينبغي تأكيد أن يضع الشبكية عمودي بالليزر-
  4. متوسط أداء 25 ب-مسح في وضع الاستبانة وتنقيط من 30 أ-فحص-
  5. بعد التصوير كلتا العينين، وإزالة العدسات اللاصقة وتنطبق جل العيون. اترك الماوس في قفص الانتعاش الحارة.

10. معالجة وتحليل أكتوبر

  1. استخدام وحدات التصوير البرمجيات لتجزئة الآلي.
    1. الصحيح يدوياً الأجزاء المقابلة للداخلية مما يحد من غشاء (ILM) والطبقة بليكسيفورم الداخلية (IPL)، الذي يمثل حدود الشبكية الداخلية طبقات (أيرلندا) 21-
    2. التحقق من أن طبقة الألياف العصبية الشبكية (رنفل) وطبقة خلايا العقدة (جكل) يقيمون داخل حدود أيرلندا ولا تتراكب.
  2. سمك IRL حساب باستخدام الشبكة 2 المبكر علاج السكري اعتلال الشبكية الدراسة (اتدرس) مع أقطار من 1 و 2 و 3 مم تركزت على القرص البصري، والتصدير إلى ملف جدول بيانات. البرنامج يقوم بحساب سمك كل طبقة الشبكية بمتوسط كل قطاع الشبكة. ولذلك، هو استبعاد الجزء المركزي، المقابلة لرأس العصب البصري،-
  3. تحليل الفروق الإحصائية بين المجموعات في كل نقطة في الوقت. تحليل كلتا العينين لكل الماوس، استخدام المعمم تقدير المعادلات مع مصفوفة ارتباط قابل للصرف والتسويات للموضوع داخل العين بين الارتباطات 21-

النتائج

في هذا البروتوكول، قمنا باستخدام الخلايا المانحة تي من AQP4 C57BL/6--/-- الفئران. التحصين تحت الجلد من هذه الفئران مع AQP4 p135-153 أو p201-220، التي تحتوي على [ابيتوبس] خلية T المسببة للأمراض، وأثارت ردود قوية خلية T التكاثري في الغدد الليمفاوية تجفيف (الشكل 1)، بينما هذه الببتيدات اثنين الناجمين عن الخلية تي أضعف بكثير الانتشار في وزن الفئران. وبالمقارنة، التحصين مع AQP4 p91-110، يحتوي على خلية AQP4 T غير ممرضة حاسما13، أو موج p35-55، ببتيد المايلين التي تؤدي إلى تنشيط خلايا تي التي تتسبب في النخاع الذاتية التجريبية (إي)22،23 ،24، الناجم عن حجم مماثل من تكاثر الخلايا تي في AQP4--/-- ووزن الفئران. تحليل استخدام تكر تلطيخ التدفق الخلوي للفرد Vβ أو الأسر Vβ، وأظهرت أن الخلايا p135-153-p201-220-محددة وتي من AQP4--/-- الفئران المستخدمة فريدة تكر مبدع. فرط الانتشار الانتقائي من AQP4 p135-153 و 220 p201 في AQP4--/-- الفئران، فضلا عن استخدام تكر فريدة من نوعها (الشكل 2)، أشارت إلى أن ردود الخلية T المسببة للأمراض لهذه المحددات عادة ينظمها السلبية الغدة الصعترية التحديد، مما يؤكد أهمية استخدام الخلايا المانحة تي-/- AQP4 في هذا البروتوكول.

قبل نقل التبني لتحريض ATCA، كانت مثقف خلايا العقدة الليمفاوية من AQP4 معبي الببتيد الفئران في المختبر في ظروف الاستقطاب Th17 أو Th1 لمدة ثلاثة أيام. المدى استقطاب المانحين CD4+ تي الخلايا كان يؤكده سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ (ICS) ويقاس بالتدفق الخلوي (الشكل 3). تم حقن الفئران المستفيدة ساذجة عن طريق الوريد 2 × 107 المانحة AQP4 الببتيد محددة خلايا تي. بعد ستة أيام تقريبا، حوالي 100% فئران المستفيدة وضع علامات سريرية لأمراض المناعة الذاتية والملاحة والمراقبة، بما في ذلك الشلل الذيل واطرافهم هند يعرج (الشكل 4). الخلايا T AQP4 حدة الاستقطاب Th17 الناجمين عن أشد الأمراض السريرية من خلايا تي AQP4 على حدة الاستقطاب Th1. ويبين 1 فيديوماوس تمثيلية التي تلقت Th17 AQP4-الببتيد-محددة ووضع الشلل الكامل هند أطرافهم (الشلل النصفي). على النقيض من الفئران التي وضعت EAE بعد إقامة خلايا Th17 موج على حدة، استعادت الفئران المستفيدة من الأمراض السريرية الناجمة عن خلايا Th17 AQP4 على حدة. أما ع الناجمة عن خلايا Th17 p35-55-خاصة بموج، الأمراض السريرية الناجمة عن AQP4 p135-153-محددة أو خلايا Th17 p201-220-محددة مرتبطة بتسلل خلايا وحيدات النوى في الجهاز العصبي المركزي حمة والسحايا (الشكل 5). وكانت الآفات أكثر وفرة في السحايا مما في حمة للجهاز العصبي المركزي المناعة الذاتية الناجمة عن خلايا Th17 AQP4 على حدة.

مشاركة العصب البصري تجلى التقييم النسيجي، وقبل أكتوبر المسلسل AQP4-محددة وخلايا Th17 موج على حدة كلا التهاب العصب البصري المتعمد، التي تميزت بوجود خلايا وحيدات النوى. بينما تسبب خلايا Th17 الخاصة AQP4 بيرينيوريتيس الألياف الضوئية، خلايا Th17 الخاصة بموج الناجم عن التهاب العصب البصري الحاد (الشكل 5). استخدام OCT المسلسل، التهاب العصب البصري وكان واضحا من تورم وزيادة سمك الطبقة الشبكية الداخلية (أيرلندا) للأمراض السريرية الناجمة عن AQP4 محددة أو خلايا Th17 الخاصة بموج (الشكل 6). بالنسبة للجهاز العصبي المركزي التي يسببها AQP4 Th17 المناعة الذاتية، سمك IRL عاد إلى الأساس كالفئران استردادها من الأمراض السريرية. وفي المقابل، استمرار ع فعل Th17 الخاصة بموج تقابل مع أيرلندا رقيق، وكما أثبتنا سابقا17، ارتبط بفقدان خلايا الشبكية العقدة.

figure-results-3676
الشكل 1 : AQP4 p135-153 و p201-220 تحظى بانتشار قوة تي الخلايا في الفئران-/- AQP4، ولكن لا وزن الفئران. تم تحصين الفئران الليبي مع الببتيدات المشار إليه في فرنكات الجماعة المالية الأفريقية. أحد عشر يوما في وقت لاحق، الغدد الليمفاوية، ومثقف ثم مع أي مستضد لا أو الببتيد المستخدمة للتحصين. وتم قياس انتشار بإدراج 3ح-thymidine (يعني ± SEM، ممثل عن تجارب 5). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-4399
الشكل 2 : استخدام الخلايا T AQP4 محددة من الفئران AQP4-/- فريدة تكر مبدع. تم تحصين AQP4-/- والفئران WT مع الببتيدات المشار إليه. أحد عشر يوما في وقت لاحق، إزالة العقد الليمفاوية ومثقف مع الببتيد المستخدمة للتحصين. كان حصاد الخلايا. وقد تم تحليل الاستخدام Vβ تكر بالتدفق الخلوي (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 5). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-5067
الشكل 3 : الاستقطاب Proinflammatory الخلايا مانحة محددة AQP4 ر. أحد عشر يوما بعد التحصين مع AQP4 p135-153 أو p201-220، تحصد خلايا العقدة الليمفاوية ومثقف مع الببتيد المستخدمة للتحصين في ظروف غير الاستقطاب، وشروط Th1 أو Th17 الاستقطاب. الاستقطاب Th17 أو Th1 بدراسة ICS والتدفق الخلوي لايل-17 أو IFN-γ، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-5714
الشكل 4 : حمل الخلايا T AQP4 حدة الاستقطاب Th17 الشلل في الفئران المستفيدة WT. تلقي الفئران المستفيدة WT المانحة7 AQP4 الاستقطاب Th17 p135-153 2 x 10 أو خلايا تي p201-220-محددة من AQP4--/-- الفئران. خلايا تي موج على حدة الاستقطاب Th17 كعنصر إيجابي. تمثل نتائج التجارب 8 (n = 5/المجموعة). * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-6412
الشكل 5 : حمل خلايا Th17 AQP4 حدة التهاب أوبتيكوسبينال في الفئران WT. تلقي 2 × 107 المانحة Th17 AQP4 p135-153-أو p201-220--تستعد Th17 الخلايا من AQP4--/-- الفئران أو موج Th17 p35-55-الخاصة بخلايا الفئران المستفيدة وضحى بعد 10 أيام. وأعدت أنسجة النخاع الشوكي والعصب البصري والملون مع ح & ه/لفب لتقييم أدلة على وجود التهاب وديميليناتيون، على التوالي. النتائج هي الممثل للفئران/المجموعة 5. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-7185
الرقم 6 : التهاب العصب البصري الناجم عن خلايا Th17 AQP4 محددة يمكن رصدها باكتوبر الشبكية طولية وزن الفئران المستلم تلقي 2 × 107 المانحة الاستقطاب Th17 AQP4 p201-220-محددة أو خلايا تي p35-55-خاصة بموج اليوم 0. أنها فحصت OCT اليوم 0 (قبل إقامة خلايا T) ثم في أيام 4، 7، 8، 9 10، 11 14 و 21. وكان سمك IRL المقاسة (يعني ± ووزارة شؤون المرأة). وتشير الإحصاءات إلى مقارنة مع مراقبة ساذجة. تمثل نتائج التجارب 3 (5 الفئران في المجموعة). * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

واعتبر AQP4 أن الهدف الرئيسي في "نمو مفتش" في 20053. ثم، أنه اعترف بأنه من الهام وضع نموذج حيوان AQP4 المستهدفة من الجهاز العصبي المركزي المناعة الذاتية. نموذج من هذا القبيل يمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في كيفية الخلايا T AQP4 على حدة وب المشاركة في التنمية للجهاز العصبي المركزي المناعة الذاتية واختبار المداواة المرشح لنمو. على الرغم من أن تحديد الخلية تي AQP4 على حدة [ابيتوبس] في الفئران البرية من نوع ذكر أولاً في 201013، خلايا تي الاستجابة إلى تلك [ابيتوبس] لم يسبب الأمراض السريرية أو نسيجية14،17. عدم القدرة على توليد نموذج للمناعة الذاتية CNS يستند مفاعليه محصنة إلى AQP4 وظلت لغزا حتى عام 2015 عندما جونز, et al. 25 اكتشفت أن المانحين AQP4 p135-153-تستعد خلايا تي من AQP4--/-- الفئران كانت قادرة على التسبب في علامات سريرية ونسيجية للجهاز العصبي المركزي المناعة الذاتية في وزن الفئران. الاهتمام، هو توقع AQP4 p135-153 لربط الثاني MHC (-أب) مع ارتفاع تقارب17. ومن المتوقع فقط واحدة أخرى AQP4 تسلسل الأحماض الأمينية، 201-220، لربط-أب مع تقارب عالية مماثلة. وفي الواقع، لاحظنا أن AQP4 p135-153 و p201-220 كلا تحظى بانتشار قوي في AQP4--/--، ولكن لا وزن الفئران. هنا، وقد أظهرنا كيف يمكن للمرء عزل وتوسيع انسيفاليتوجينيك Th17 AQP4 p135-153--و p201-220--رد الفعل خلايا تي من AQP4--/-- الفئران. عندما حولت إلى وزن الفئران المستفيدة، خلايا Th17 AQP4 المتفاعلة المانحة المستحث بالشلل، الذي كان يرافقه تتسرب الخلايا وحيدات النوى في الحبل الشوكي والعصب البصري. إصابة النظام المرئي الزبائ معروف جيدا في المرضى الذين يعانون من نموسد AQP4 المصل26. هنا، لاحظنا أن التهاب العصب البصري الناجم عن الخلايا AQP4-القائم على رد الفعل ورد الفعل موج Th17 كانت متميزة. بينما خلايا Th17 AQP4 الخاصة التي يسببها بيرينيوريتيس الألياف الضوئية، خلايا Th17 الخاصة بموج الناجم عن التهاب العصب البصري الحاد. لقد قمنا أيضا بوصف التقنيات المستخدمة لرصد التهاب العصب البصري الناجم عن خلايا محددة AQP4 و T الخاصة بموج قبل أكتوبر المسلسل. محققون آخرون الآن يجب أن تكون قادراً على تطبيق البروتوكولات المذكورة هنا للنهوض بهم دراسات تركز على الآليات المسببة للأمراض من ATCA.

واحد بسهولة تجنب المزالق المحتملة الثلاثة في أعمالنا البروتوكول. ويتطلب نقل أولاً، التبني ATCA استخدام الخلايا T AQP4 محددة من AQP4--/-- الفئران المانحين. على وجه التحديد، لم يسبب الخلايا المانحة تي p135-153-الخاصة WT AQP4 ATCA المتلقية وزن الفئران. وثانيا، من المهم إجراء "اختبار الماء" مع قطره من مستحلب الببتيد/فرنك قبل التحصين AQP4--/-- الفئران (البروتوكول خطوة 1.5). ينبغي أن لا تفريق المستحلب في المياه عندما تكون مناسبة لحقن الليبي. إذا تسارع شرط المستحلب، واحدة ينبغي أن مزيج مستحلب مرة أخرى، والبرد مرة أخرى وكرر المياه-الاختبار. أخيرا، حمل خلايا تي محددة مستضد المانحة تنشيط الجهاز العصبي المركزي CNS المناعة الذاتية أكثر كفاءة من يستريح خلايا تي. واحد ينبغي أن بصريا تفقد هذه الثقافات تحت المجهر الخفيفة قبل الحصاد الخلايا T المانحة لنقل التبني. سرعة تقسيم الخلايا يمكن أن تشكل الكتل، والتي يتم التعرف عليها بسهولة. أيضا، عند الثقافات تحتوي على العديد من الخلايا T المنشط، قد الانتقال وسائط الإعلام من الوردي إلى اللون البرتقالي أو حتى إلى اللون الأصفر، بسبب انخفاض في درجة الحموضة. واحد أيضا تقييم التنشيط من المانحين معبي AQP4 العقدة الليمفاوية تي الخلايا للانتشار بإدراج 3ح-التريتيوم، كما هو موضح في الخطوة 3 البروتوكول.

لدينا اكتشاف أن اثنين الممرضة AQP4 تي خلية [ابيتوبس] (1) يتوقع أن الربط الثاني MHC مع تقارب عالية، و (2) الحصول على ردود التكاثري قوية في AQP4--/--، ولكن لا وزن، الفئران تشير إلى أن خلايا تي تستهدف تلك المحددات عادة التحكم بواسطة الغدة الصعترية الانتقاء السلبي17. مبدع تكر المستخدمة للاعتراف AQP4 p135-153 و 220 p201 في AQP4--/-- الفئران هي فريدة من نوعها (الشكل 2)، وهو أيضا يتفق مع الحذف الاستنساخ بالغدة الصعترية الخلايا الظهارية النخاع وساطة. قد يقيد آليات أخرى توليروجينيك عادة الاستجابات المناعية ل AQP4. بعد التقرير الأولى لدينا17، أظهرت مجموعة أخرى أيضا أن AQP4 p201-220 يحتوي انسيفاليتوجينيك خلية T حاسما27. عندما تم تشكيل α/β (TCRα--/--) تفتقر إلى خلية T الفئران مع AQP4-/- CD4+ تي الخلايا، كان من الممكن الحصول على استجابة خلايا T انسيفاليتوجينيك AQP4 على حدة، ولكن لا AQP4 على حدة خلطيه استجابة، مما يعني أنه في وزن الفئران الردود الخلية ب AQP4 على حدة، مشابهة لردود الخلية T AQP4 محددة، تخضع للانتقاء السلبي. في الواقع، خسارة محاور عصبية في الحبل الشوكي ورجكس، الذي لوحظ في الفئران WT لا مع ATCA الناجمة عن الخلايا T AQP4 الخاصة وحدها، قد يتطلب مشاركة من الأجسام المضادة الخاصة AQP4 المسببة للأمراض. فمن الواضح أن نماذج الماوس للمناعة الذاتية AQP4 التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي ستظل تتطور كما نتعلم المزيد فيما يتعلق بآليات توليروجينيك عادة السيطرة على الحصانة الخاصة AQP4 تي الخلية والخلية ب.

ويجري أيضا نماذج أخرى للمناعة الذاتية AQP4 التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي16المتقدمة6،،،من2829،30. كل واحد قد توفر مزايا لدراسة الجوانب الخاصة ذات الصلة بنمو المرضية. وقد حددت الخلايا T AQP4 على حدة في وزن الفئران6،،من1629. تلك الخلايا T AQP4 على حدة بسبب التغيرات النسجية للمناعة الذاتية والملاحة والمراقبة ولكن مشابهة للملاحظات في الفئران، وزن الفئران خلايا تي AQP4 على حدة لا تسبب علامات هامة من الأمراض السريرية. ولذلك، أيضا آليات التسامح تقييد خلية تي وب خلية محددة AQP4 الاستجابات المناعية في الفئران WT التشغيلية في الفئران. بغض النظر، واحد لا ينبغي الاستخفاف بالقوة في استخدام نماذج الماوس لدراسة الآليات التي تشارك في الآلية المرضية للمرض. ثروة المغلوب، محوره وراثيا ومراسل الفئران يمكن أن يكون مفيداً. أنه ينبغي أيضا الاعتراف بأن العديد من الاكتشافات الأساسية في المناعة الذاتية أجريت باستخدام الماوس ع نماذج. على سبيل المثال، يمكن التوسط مظاهرة استنساخ تلك الخلية تي محددة الذات-مستضد لأمراض المناعة الذاتية31،32، تحديد دور خلية T كوستيموليشن في المناعة الذاتية33 والاكتشاف ووصفت المسار التنموي ل التمايز Th1734 أولاً باستخدام الماوس ع النماذج. باستخدام نموذج الماوس ATCA التي قمنا بتطوير، أحد الآن يملك الوسائل لدراسة تطوير وتنظيم الاستجابات المناعية الخاصة AQP4 الممرضة الحية، التي ينبغي أن تقدم أفكاراً هامة تتصل بنمو المرضية.

Disclosures

ساغان S.A.، ألف كروز-هيرانز، سبنسر C.M.، هو بروبلين، ستينمان L.، الأخضر جعفر، والمرسوم الجمهوري رقم سوبيل تقرير لا الكشف. س. س. زامفيل نائب رئيس تحرير الأعصاب ونيورويمونولوجي ونيوروينفلاميشن وهو عضو في المجلس الاستشاري "المجتمع الدولي من نيورويمونولوجي". أنه خدم في "مجلس تحرير مجلة التحقيقات السريرية"و دفتر اليومية لعلم المناعة و مجلة العلوم العصبية، وكان الميثاق عضو لجنة استعراض منحة "المعاهد الوطنية" نيورويمونولوجي السريرية الصحة (المعاهد الوطنية للصحة) وأورام الدماغ (الراقصة) دراسة القسم والمجتمع التصلب الوطني (NMSS). أنه عمل كمستشار وتلقى أتعاب من Biogen شركة إربد، EMD Serono وشركة جنزايم، وشركة نوفارتيس، روش/Genentech وتيفا المستحضرات الصيدلانية، وشركة، وقد خدم أو يخدم في "مجالس مراقبة سلامة البيانات" يللي، بيومس، تيفا والمداواة أوبيكسا. في الوقت الراهن، يتلقى الدكتور زامفيل دعم المنح البحثية من المعاهد الوطنية للصحة، NMSS، مؤسسة مايسين، Biogen وسيلجيني.

Acknowledgements

قدم الدعم إلى S.S.Z. من المعهد الوطني للصحة (RO1 AI073737 و RO1 NS092835-01)، الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد (4768 النمو الحقيقي و RG 5179 RG 5180) ومؤسسة ميسين وجوثي جاكسون مؤسسة خيرية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
M. tuberculosis H37RaBD Difco231141Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's AdjuvantBD Difco263910
AQP4 peptide p135-153GenemedCustom SynthesisPeptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220GenemedCustom SynthesisPeptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55Genemed / AuspepCustom SynthesisPeptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way StopcockKimble420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized)GE Healthcare Life SciencesSH30071
Recombinant Mouse IL-23R&D Systems (BioTechne)1887-ML
Recombinant Mouse IL-6R&D Systems (BioTechne)406-ML
Recombinant Mouse IL-12R&D Systems (BioTechne)419-ML
Thymidine [Methyl-3H]PerkinElmerNET027
Glass Fiber FiltermatsPerkinElmer1450-421
Anti-mouse antibodieseBioscience (Affymetrix)[various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening PanelBD Biosciences557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell StainThermoFisher Scientific[various]
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlugBD Biosciences555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-AldrichP8139
Iomomycin (calcium salt)Sigma-AldrichI0634
Pertussis Toxin from B. pertussisList Biological Laboratories181
10% FormalinVWR89370-094
Variable-Flow Peristaltic PumpFisher Scientific13-876-2
Foam Biopsy Pads, RectangularFisher Scientific22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP)Henry Schein Animal Health050033NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)AkornNDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging PlatformHeidelberg Engineering

References

  1. Hardy, T. A., et al. Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS. Lancet Neurol. 15 (9), 967-981 (2016).
  2. Lennon, V. A., et al. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet. 364 (9451), 2106-2112 (2004).
  3. Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel. J Exp Med. 202 (4), 473-477 (2005).
  4. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), 62 (2015).
  5. Bennett, J. L., et al. Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica. Ann Neurol. 66 (5), 617-629 (2009).
  6. Bradl, M., et al. Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo. Ann Neurol. 66 (5), 630-643 (2009).
  7. Nurieva, R. I., Chung, Y. Understanding the development and function of T follicular helper cells. Cell Mol Immunol. 7 (3), 190-197 (2010).
  8. Lucchinetti, C. F., et al. The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica. Brain Pathol. 24 (1), 83-97 (2014).
  9. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (4), 110 (2015).
  10. Brum, D. G., et al. HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis. Mult Scler. 16 (1), 21-29 (2010).
  11. Varrin-Doyer, M., et al. Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter. Ann Neurol. 72 (1), 53-64 (2012).
  12. Vaknin-Dembinsky, A., et al. T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO). Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).
  13. Nelson, P. A., et al. Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica. PLoS One. 5 (11), 15050 (2010).
  14. Kalluri, S. R., et al. Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica. PLoS One. 6 (1), 16083 (2011).
  15. Pohl, M., et al. Pathogenic T cell responses against aquaporin 4. Acta Neuropathol. 122 (1), 21-34 (2011).
  16. Zeka, B., et al. Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS. Acta Neuropathol. 130 (6), 783-798 (2015).
  17. Sagan, S. A., et al. Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (51), 14781-14786 (2016).
  18. Vita, R., et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 43, 405-412 (2015).
  19. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  20. Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry. J Vis Exp. (82), e51018 (2013).
  21. Cruz-Herranz, A., et al. The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies. Neurology. 86 (24), 2303-2309 (2016).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur J Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).
  23. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
  24. Molnarfi, N., et al. MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med. 210 (13), 2921-2937 (2013).
  25. Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica. Acta Neuropathol Commun. 3, 28 (2015).
  26. Oertel, F. C., et al. Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD. Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72 (2017).
  27. Vogel, A. L., et al. Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice. Eur J Immunol. , (2017).
  28. Zhang, H., Verkman, A. S. Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59. J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).
  29. Zeka, B., et al. Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 82 (2016).
  30. Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G. J Neuroinflammation. 13 (1), 275 (2016).
  31. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
  32. Zamvil, S. S., et al. Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition. J Exp Med. 162 (6), 2107-2124 (1985).
  33. Kuchroo, V. K., et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy. Cell. 80 (5), 707-718 (1995).
  34. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126 4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved