마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

요약

여기, 선물이 aquaporin-4 (AQP4)의 양도 의해 마비 및 opticospinal 염증 유도 프로토콜-WT 쥐로 AQP4^/- 생쥐에서 특정 T 세포. 또한, 우리는 시각 시스템 장애 모니터링을 직렬 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

초록

그것은 인식 하는 동안 그 aquaporin-4 (AQP4)-특정 T 세포와 항 체 neuromyelitis optica (NMO), 인간 중앙 신경 시스템 (CNS) 면역 demyelinating 질병, 둘 다 AQP4 타겟 모델의 생성의 병에 참여 CNS autoimmunity의 임상 및 조직학 발현 어려운 입증 했다. 그 T 세포 순진한 받는 사람 마우스 질병을 전송할 수 있지만 AQP4 펩 티 드와 야생-타입 (WT) 쥐의 면역 T 세포 증식을 elicited. 최근에, 2 개의 소설 AQP4 T 셀 epitopes, 펩 티 드 (p) 135-153, p201-220, 발견 했다 공부 하는 T 세포 반응성이이 epitopes 제안 하는 AQP4 불충분 한 (AQP4^-/-) 마우스에서 AQP4에 대 한 면역 응답을 일반적으로 thymic 의해 제어 부정적인 선택입니다. AQP4^-/- Th17 편광 p135-153 또는 p201-220 유발된 마비에 받는 WT 쥐에서 척수와 시 신경의 주로 환자의 염증에 연결 됐다는 T 세포. 염증 주변 시 신경 및 내부 망막 레이어 (IRL)의 참여 변화 직렬 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 의해 각 성 했다. 여기, 우리는이 생체 내에서 의 새로운 모델 AQP4 대상 CNS 면역 (ATCA), 병원 성 AQP4 전용 T 세포와 그들이 어떻게 B 협조 수 있습니다의 개발을 허용 하는 메커니즘을 연구를 지금 사용할 수를 만드는 데 사용 하는 방법 설명 NMO 병 인에 셀입니다.

서문

Neuromyelitis optica (NMO) 중앙 신경 시스템 (CNS) 자기 면역 염증 demyelinating 질병 잦은 마비와 영구적인 신경학 적 장애¹로 이어지는 시각 손실의 원인입니다. NMO는 현재 간주 주로 체액 성 면역 질환² aquaporin-4 (AQP4), 이다^3,4에 풍부 하 게 표현 하는 수로 대상으로 하는 항 체 (Igs)와 관련으로. 그러나, CNS 염증 CNS AQP4 Ig^5,6의 항목에 대 한 전제 조건입니다. 따라서, 그것은 안티-AQP4 Igs 혼자의 전송에 의해 NMO의 모델을 설치 하 게 가능 되지 않았습니다. NMO 환자에서 (1) 병원 성 AQP4 전용 Igs IgG1^1,2는 결과 T 세포 의존 Ig 서브 클래스⁷ (2) T 세포는 NMO 병 변^8,9 (3) NMO 식별 됩니다 연결 된 특정 MHC II 유전자 (예: HLA-DR17 (DRB1 * 0301))¹⁰, 그리고 (4) proinflammatory AQP4-반응성 박사-제한 된 Th17 세포는 NMO 환자^11,12 모든 확장 표시 AQP4 전용 T 세포는 중요 한 역할 NMO pathogenesis에서. 따라서, AQP4 전용 T 세포 NMO pathogenesis에 기여할 수는 어떻게 결정 하는 동물 모델을 개발 하는 것이 중요 하다.

몇 년 전, 여러 AQP4 T 셀 epitopes 야생-타입 (WT) 마우스^13,14 와 쥐¹⁵에서 확인 되었다. AQP4 반응 T 세포 순진한 받는 사람 쥐^15,16opticospinal 염증 유발 수 관찰 되었다, 그러나 CNS 질환의 중요 한 임상 증상 관찰 하지 했다. 마찬가지로, AQP4 T 셀 epitopes^14,17를 포함 하는 펩 티 드와 WT 쥐의 면역을 직접 또는 그 결정 요인¹⁷를 대상으로 하는 proinflammatory T 세포의 전송, 임상 증상을 일으키지 않았습니다 또는 조직학 CNS 면역의 증거입니다.

최근에, 그것은 높은 선호도¹⁸C57BL/6 AQP4-결핍 (AQP4^-/-) 마우스 AQP4 펩 티 드 (p) 135-153 또는 p201-220, MHC II (-A^b) 바인딩할 예측 결정 하는 2 개의 요인의 그 면역 관찰 했다, elicited 강한 CD4 ⁺ T 세포 응답¹⁷. 반면,이 두 펩 티 드 WT 쥐에만 겸손 증식 반응 elicited. 또한, AQP4^/- 생쥐에서 T 세포에 의해 이러한 결정 요인의 인식에 대 한 사용 T 세포 수용 체 (TCR) 레 퍼 토리 독특한 했다. 샨 다, 이러한 연구 결과 AQP4의 T 세포 인식 thymic 부정적인 선택에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. AQP4 p135-153-또는 p201-220-특정 AQP4^-/- 기증자 쥐에서 Th17 세포 유도 순진한 받는 WT 쥐;의 거의 100%에 마비 이 T 세포, B 세포, monocytes의 opticospinal 침투와 연관 되었다. 직렬 opticospinal 일관성 단층 촬영 (OCT) 시연 동적 시각적 시스템 참여. AQP4 대상 CNS T 세포 중재 면역 (ATCA)와 쥐 마비 비주얼 시스템 부상에서 회복. EAE myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) p35-55-특정 T 세포에 의해 지속적인 임상 질병 이끌어 유도 달리 혼자 T 세포에 의해 유도 된 ATCA axonal 손실 또는 감소 망막 신경 절 세포 (RGCs)에 연결 되지 않았습니다. 우리의 결과 명확 하 게 여러 병원 성 AQP4 T 셀 결정 요인 다는 것을 설명 했다. ATCA의이 새로운 모델은 어떻게 셀 CNS 염증을 유발 하 고 어떻게 그들이 AQP4 특정 B 세포 및 NMO 병 인을 촉진 하는 항 체와 협력 수 학습 병원 성 AQP4 전용 T 세포의 개발을 제어 하는 메커니즘을 공부 하는 데 유용 .

현재 보고서에서 우리는 유도 하 고 T 세포 유도 ATCA를 평가 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 면역, T 세포 배양 및 Th17 분극 병원 성 AQP4 전용 T 세포, 양극 화 및 그 T 세포의 입양 전송 흐름 cytometry 분석 생성을 사용 하는 기법으로 시작 합니다. 우리는 다음 임상 및 조직학 질병 및 직렬 OCT 비주얼 시스템 부상을 받는 사람 마우스 모니터를 사용 하 여 평가 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 캘리포니아 대학, 샌 프란 시스 코 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 실험 지침에 따라 수행 했다. C57BL/6 (H-2 ^b) 여성 쥐, 나이, 8 주 구입 했다 고 C57BL/6 AQP4 ^/- 생쥐 A. Verkman에 의해 제공 되었다.

1. AQP4 펩 티 드와 마우스의 면역

1. 준비 완료 Freund ' s 보조 (CFA) 작업 사진.
   1. 잘게 갈아 M. 결핵 (H37Ra)는 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여의 desiccated 준비.
   2. 추가 지상 불완전 한 Freund에 H37Ra ' 4 mg/mL의 최종 농도에 s 보조. CFA는 4 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
2. 디졸브 동결 건조 된 항 원 (Ag) AQP4 펩 티 드 1 mg/mL의 최종 농도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에. 또는 얼음에 4 ° C에서 유지
3. CFA/펩타이드 에멀젼을 포함 하는 자 지와 합류 2 luer 잠금 주사기 조립 준비.
4. 연결 유리 luer 잠금 주사기 플런저 3 방향 나일론 자 지 2 남성 luer 잠금 연결을 하지 않고
   . 주사기로 레버를 전환 하 여는 자 지를 닫습니다. 수 있도록 테스트 튜브로 주사기 주사기의 오픈 엔드 위치. 추가 안정성을 위한 튜브 랙에 배치.
   1. 소용돌이 CFA 일 재고 고 Ag 솔루션. 펩 티 드의 1:1 볼륨 추가 / 오픈 주사기에 CFA. CFA/Ag (50 µ L x 4)의 200 µ L가 마우스 당 필요.
      참고: 일반적으로, 준비의 약 1 mL 접종에 사용할 수 있는 금액을 줄일 것입니다 자 지에 손실 됩니다. 따라서, 그것은 필요한 총 볼륨의 계산에이 통합 하는 것이 중요.
      예: 5 마우스의 면역에 대 한: (200 µ L/동물 x 5 동물) + 1 mL 여분의 볼륨 = 총 CFA/Ag 필요한 2 mL.
   2. 는 주사기에 유리 플런저를 삽입 하 장소에서 그것을 잡고, 주사기를 반전 하는 자 지는 위로. 사용 하지 않는 여성 연결을 자 지 레버를 전환 합니다. 신중 하 게 주사기에서 초과 공기를 제거 하기 위해 유리 플런저에 압력을 적용 됩니다. 액체는 자 지의 두 번째 남성 luer 잠금 연결 채웁니다.
   3. 는 자 지의 두 번째 남성 luer 잠금 연결을 두 번째 유리 주사기 (플런저 완전히 삽입)을 연결 합니다. 이 가능한 작은 초과 공기 포함 하는 자 지와 2 유리 주사기의 닫힌된 시스템 이어야 한다.
   4. 에멀젼, 만들을 통과 하는 액체 또는 약 2 분 약 10 분에 대 한 얼음에 주사기를 반복 하는 냉 기에 대 한 2 주사기 사이 재미 plungers를 추진 하 고 준비의 점도 분명 변화 될 때까지 혼합 하 여 혼합 아주 뻣 뻣 한, 화이트 에멀젼의 결과로. 4 ° C에서 유제를 포함 하는 주사기를 냉장 보관 또는 얼음에 유지
5. 한 유리 luer 잠금 주사기 유제의 모든 전송, 빈 유리 주사기를 제거 하 고 1 mL luer 잠금 주사기 주입을 위해. 유제와 새로운 주사기를 채우기는 자 지에서 제거 하 고 연결 바늘 (25G x 5/8).
6. " 물-테스트 " 일관성 에멀젼. 물을 작은 그릇에는 유화 액의 한 방울을 추방. 유제, 주입을 위해 적합 하다는 것을 나타내는 분산 하지 해야 합니다.
   1. 유제 분 광, 경우 그것은 주입에 대 한 준비, 전송 액체 유리에 다시 주사기와 혼합 하 고 유제는 뻣 뻣 한 때까지 다음 다시 진정 계속.
   2. 적절 한 일관성을 달성 때까지 유제를 다시 테스트.
7. 기증자 AQP4 ^/- 생쥐를 피하 주사 (사우스 캐롤라이나) AQP4 펩 티 드를 포함 하는 유제와. 각 마우스 4 x 50 µ L 사우스 캐롤라이나 주사 (200 µ L 총 (100 µ g 펩타이드))를 받습니다. 4 사이트 (LN) 사 타 구니 림프절으로 배수 하는, 더 낮은 복 부의 측 및 액 ln.로 배수 중간 각 겨드랑이 가슴 벽의 양쪽 모두를 포함 입양 전송 받는 사람 마우스 당 1-2 면역된 기증자 마우스 필요 합니다.

2. T 세포 배양 및 Proinflammatory T 세포 분극

1. 예방 접종, 10-12 일 쥐에서 LN 수집.
   1. 아이스 트레이 준비 60mm 접시 셀 스 트레이너 (메쉬 크기 70 µ m)를 장착 하 고 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 냉장된 RPMI 미디어 및 100 U/mL 페니실린-100 µ g/mL 스 (펜-strep) (RFP) 포함.
   2. CO ₂, 자 궁 경관 탈 구 다음에 노출에 의해 Euthanize 쥐. 70% 에탄올에 쥐를 담가 그리고 다음 해 부 보드에 각 노상 강도 핀.
   3. 잘라 중간 피부 절 개는 사 타 구니에서 목에 각 다리. 복 막 떨어져 피부를 당겨 하 고 엄격 하 게 보드에 그것을 핀. 사 타 구니와 겨드랑이 LN을 해 부하 고 얼음에 RFP를 포함 하는 배양 접시 합니다. ¹⁹
   4. 입양 전송 실험, 같은 예방 접종 그룹 내에서 모든 동물에서 LN을 결합. Vβ 사용의 흐름 cytometric 분석, 개별 동물에서 LN 분리.
2. RFP 포함 50 mL 원심 분리기 튜브에 LN을 포함 하는 셀 여과기를 놓습니다. 살 균 5 mL 주사기 플런저의 평면 끝을 사용 하 여 셀의 회복을 촉진 하는 RFP의 20-30 mL로 세척 여과기를 통해 LN 셀을 누릅니다. 문화에 대 한 때까지 처리를 통해 얼음에 LN 셀 유지.
3. 세척은 두 번, centrifuging 393 x g 5 분 동안에. 두 번째 세척 후 T 세포 미디어 (TCM)에 선 셀 resuspend. 한 의학 포함 된 RPMI FBS, 292 µ g/mL L-글루타민, 110 µ g/mL 나트륨 pyruvate 그리고 55 μ M 2-mercaptoethanol 및 펜 strep 10% 열 비활성화. 일반적으로, 기증자 마우스 당 5 mL TCM의 볼륨 사용 됩니다.
4. LN 셀을 계산합니다. 예상된 수확량은 약 3-6 10 ⁷ 선 세포 면역된 한 마우스 기증자 당 x. 3-4 x 10 마련해 ⁶ 확산 분석 결과 (아래 섹션 3 참조).
5. 입양 전송 (6) 문화 편광 설정.
   1. 준비 5 x 10의 Th17 편광 문화 10 µ g/mL Ag, 20 ng/mL 재조합 마우스 인터 루 킨 (IL)-23와 함께 mL 당 ⁶ LN 셀과 10 ng/mL 재조합 마우스 중에 일리노이-6.
   2. 또는 Th1 분극에 대 한 준비 5 x 10의 문화 10 µ g/mL Ag와 mL 당 ⁶ LN 셀 및 10 ng/mL 재조합 마우스 중에 IL-12.
   3. 12-잘 접시에 편광 문화 혼합의 당 2 mL (1 x 10 ⁷ 셀)을 추가합니다. 2-4 기증자 쥐에서 LN 셀 한 12-잘 접시를 채울 것입니다. 72 헤에 대 한 5% CO ₂와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 문화 유지
   4. 시각적으로 확인 48 h에 활성화를 위한 문화에 선 셀와 72 h. 활성 셀 광범위 한 클러스터를 형성할 것 이다 T 세포 크기, 더 pleomorphic 되 고 증가할 것 이다. 신진 대사 증가 오렌지에 복숭아에서 변경 미디어에서 pH의 저하 될 수 있습니다. PH는 미디어 노란색을 충분히 낮은 경우 추가 1 mL의 나머지 24 h. 셀에 독성을 방지 하기 위해 신선한 TCM
   5. 섹션 6 진행 입양 전송 편광 효율 (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine descr로 확인할 수 있습니다.섹션 5에서 ibed.
6. 문화 흐름 표면 Vβ 식 (제 4)의 cytometric 분석에 대 한 개별 마우스에서 LN을 사용 하 여 설정.
   1. 준비 5 x 10 ⁶ 10 µ g/mL 중에 Ag와 mL 당 LN 셀.
   2. 12-잘 접시에 잘 당 문화의 2 mL (1 x 10 ⁷ 셀)을 추가합니다. 문화는 10 일 동안 5% CO ₂와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 유지 되어야 합니다. 제 4 이동.

3. 확산 분석 결과

참고: 2.4 절에서에서 계속이.

1. 준비 3-4 mL 튜브, 2 x 10에 선 셀의 TCM에 mL 당 ⁶ 셀.
2. 부드럽게 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 세포를 혼합 하 고 살 균 구 유에 다음 전송.
3. 96 잘 라운드로 사용 잘 당 세포의 플레이트 100 µ L 멀티 채널 pipettor 하단 조직 배양 플레이트. 일반적으로, 4 Ag 농도 및 아무 Ag 참조 triplicate 테스트용 15 우물 판.
4. 다양 한 농도에서 TCM, 일반적으로 80, 20, 5, 1, 0 µ g/mL (2 x 주식)에 대 한 Ag 희석. 40, 10, 2.5의 최종 농도 대 한 3 중에 각 농도의 100 µ L를 추가 합니다. 0.5와 0 µ g/mL 약 72 h 37 품 어 ° c.
   참고: 단계 3.5 3.7 통해 방사성 물질을 포함. 적절 한 사용, 모니터링 및 방사성 물질의 폐기 지휘 되어야 한다, 기관 및 정부 규정.
5. ³ H 티 미 딘 일 재고 솔루션을 준비 (40 µCi/mL)으로 25 ml RPMI, 1 mCi ³ H 티 미 딘을 추가 하 고 저장이 4 ° C. 피펫으로 멸 균 여 물통으로 작업 솔루션의 0.5 mL.
6. 추가 25 µ L ³ H 티 미 딘 (1 µCi) 잘 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 당. 추가 18 h 37에 대 한 품 어 ° c.
7. 96 잘 셀 수확기를 사용 하 여 유리 필터 매트에 세포를 수확 하 고 70% 에탄올으로 씻어. 건조 후, 필터 매트 5 mL 섬광 액체와 플라스틱 샘플 봉지에 밀봉. 잘 사용 하 여 각 섬광 카운터에서 측정 방사능.

4. 세포 표면 TCR Vβ 식 Cytometry 분석 흐름

참고:이 섹션 2.6에서 계속 됩니다. 항 체 마우스 TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 및 5.2, 6, 7, 8.1, 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14, 그리고 17a TCR Vβ 식 테스트를 위해 상업적으로 사용할 수 있습니다.

1. TCR Vβ의 검색, 여러 번 pipetting으로 문화 판에서 T 세포를 꺼내 려 하 고 튜브 셀 전송.
2. FACS 버퍼 (FB) 2 %FBS, 0.1% 나트륨 아 지 드, 2 mM EDTA PBS에 들어와 씻고.
3. 1 x 10 ⁵ 3 x 10의 밀도에서 V-하단 96 잘 접시에 전송 셀 잘 당 ⁶ 셀. 경우 전체 Vβ 패널 테스트 되 고, 셀 여러 우물 (한 잘 테스트 되 고 Vβ 당)에 배포 해야 합니다.
4. 회 저 성 세포에 의해 노출 되는 무료 아민과 반응 하는 라이브/죽은 생존 염료로 착 색 하 여 흐름 cytometric 분석에서 죽은 세포를 제외 합니다. 제조 업체에 따라 ' 원심 분리 및 생존 염색 물의 resuspension s 지시. 절차를 착 색 하는 셀에 걸쳐 10-20 분에 대 한 얼음에 품 어, 빛 으로부터 세포를 보호 하 고 얼음에 계속
5. 후 부 화, 세척 접시 한번 FB에. TCR Vβ를 검출 하기 위하여 중단 CD4에 대 한 항 체의 1: 100 희석을 포함 하는 FB의 100 µ L에 셀 (RM4-5 복제)와 TCR Vβ. 얼음에 15-60 분 동안 품 어
6. FB에 접시를 한 번 세척 하 고 4% paraformaldehyde PBS에 희석의 200 µ L을 추가 하 여 셀을 해결. 얼음에 20 분 동안 품 어. FB에 접시를 세척 하 고 cytometry 분석.

5. 세포내 Cytokine 생산에 대 한 Cytometric 분석 흐름

1. (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 대 한 치료 단백질 수송 억제제 시 약 (예, GolgiPlug)의 1:1,000 희석와 T 세포 배양 TCM에 방지 하기 위해 IC 이전 4 h cytokine 분 비입니다. 그 당시, 단백질 생산을 유도 하기 위하여 50 ng/mL phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)와 500 ng/mL ionomycin T 세포 활성화.
2. 문화의 37 ° C에서 4 h, 후 아래로, pipetting으로 문화 판에서 셀을 꺼내 려 하 고 원심 분리기 튜브 (15 또는 50 mL)에 전송.
3. 세척 FB와 함께입니다. FB에 5 x 10 ⁵ 잘 당 3 x 10 ⁶ 세포의 밀도에서 V-하단 96 잘 접시에 셀 resuspend.
4. 얼룩 세포 생존 능력 (단원 4.2) 위에서 설명한 대로 염료. 부 화 후 접시 한 번에 씻어 FB.
5. 표면 마커 검출을 위한 항 체를 다음과 같은 추가:
   1. 표면 마커 검출, 100 µ L의 FB CD4에 대 한 항 체의 1: 100 희석을 포함 하는 셀을 일시 중단 (복제 RM4-5).
   2. 선택적으로 B220에 대 한 항 체를 포함 (30-F11 복제) 및 CD11b (복제 m 1/70) 1: 100 희석 및 monocytes/대 식 세포, B 세포의 각각 게이팅 개선에. 일반적으로, PE Cy7 안티-CD4, FITC 안티-B220 및 PerCP Cy5.5 안티-CD11b 잘 작동합니다. 형광 색소의 항 체 어원이 같은 말의 분석을 위해 사용 될 흐름 cytometer의 구성에 의해 유도 해야 하 고 항 체의 최적 농도 실험적으로 결정 되어야 합니다.
   3. 얼음에 15-60 분 동안 품 어
6. FB와 함께 접시를 세척 하 고 얼음에 20 분에 대 한 고정/Permeabilization 솔루션의 200 µ L 셀 resuspend. 이 셀을 수정 하 고는 막 permeabilize.
세포내 얼룩 동안 세포 막의 permeabilization를 유지 하기 위해
7. FB 대신 파 마/워시 버퍼 (비밀 번호) (10 X 재고에서 희석된 1:10)를 사용 합니다. 비밀 번호의 200 µ L에 웰 스 워시.
8. ICS에 대 한 인터페론 (IFN)에 대 한 항 체의 1: 100 희석 준비-γ와 IL-17A 1을 사용 하 여 x PW. 하나의 옵션은 APC 안티-IFN-γ (클론 XMG1.2) 및 PE 안티-일리노이-17A (클론 eBio17B7) 잘 작동. 세포내 항 체 칵테일의 100 µ L에서 세포를 resuspend 하 고 적어도 15 분 동안 품 어. 그것도 하룻밤 4에서 얼룩이 계속 ° c.
9. PW의 200 µ L에서 우물과 FB에 물의 resuspension cytometry에 대 한 세척.
10. 병렬로 감지기 전압, 및 각 개별 형광 색소 (즉, 셀 또는 하나의 항 체/형광 색소로 얼룩진 보상 구슬)에 대 한 단일 스테인드 샘플을 최적화 하는 흠 없는 샘플 (항 체 없이 FB에 셀)을 준비 보상 좀 값 결정.
11. 취득 교류 cytometer 사용 하 여, ≥에 가능한 (라이브/죽은-부정) CD4 게이팅 10000 셀 (이벤트), ⁺ 세포. T 세포의 정확한 게이팅 되도록 제외는 B220 ⁺ 및 CD11b ⁺ 세포 (B 세포, monocytes/대 식 세포, 각각). CD4 내 ⁺ T 세포 부분 모집단, IFN-γ (Th1 혈통) 또는 IL-17A (Th17 계보)를 표현 하는 셀의 비율을 결정.

6. 입양 전송의 병원 성 AQP4 전용 T 세포

참고:이 단계 섹션에서 다음과 같습니다: T 세포 문화와 proinflammatory T 세포 분극.

1. 복구를 꺼내, 아래로 pipetting 50 mL 튜브에 전송 하 여 12-잘 접시에서 셀 편광. Ma주사까지 얼음에 intain.
2. 셀 계산, 차가운 PBS에 두 번 세척 하 고 정지 1 x 10 ⁸ 셀/mL PBS에 준비. 일반적으로, 셀 시간 이내 주사.
3. 부드럽게 소용돌이 의해 세포를 혼합 하 고 1 mL 주사기에 주입 시 전송. 관리 (2 x 10 ⁷) 셀의 200 µ L 정 맥 (i.v.) 꼬리를 통해 각 마우스 정 맥.
4. 주사 200 각 받는 사람 마우스 i.p. B. 백 일 해 독 소의 ng에 그 날 그리고 2 일 후 200 µ L의 PBS에 희석. 임상 질병의 표시를 위해 매일 마우스 모니터.

7. 임상 평가 ATCA

CNS 면역의 임상 표시를 위해 매일

1. 검사 받는 사람 마우스. 일반적으로 쥐 CNS 면역의 AQP4 전용 T 세포의 입양 전송 후 5-8 일 표시 됩니다. 쥐 신경 부전의 임상 증상이 나타납니다. 그것은 마우스의 정상적인 능력을 정의 하는 순진한 마우스에 평가 수행 하는 데 도움이.
2. 평가 쥐 꼬리의 손실에 대 한 음색입니다. 꼬리의 기지에서 쥐를 부드럽게 잡고 고 똑바로 들어. 꼬리는 꼬리의 손실로 설명은 지속적으로 드 톤 (1의 점수). 꼬리의 손실은 종종 임상 질병의 첫번째 표시.
평평한 표면에 그것의 뒤에 마우스를 배치 하 여의
3. 테스트 righting 반사 Truncal incoordination의 기호를은 느린 righting (2의 점수). 순진한 마우스 완전히 그래서 어떤 느려짐 오른쪽 능력에 역 기능으로 득점의 뒷면에 배치 하는 어떤 시도 저항할 것 이다. 일반적으로이 반사에 대 한 3-4 회 마우스 테스트.
4. 평가 자세 그리고 ambulation입니다. 쥐 자세를 낮추는 결과로 또는 ambulation 동안 엉덩이의 드래그에 변화를 표시 하기 시작 (2.5의 점수). 또한 질병 결과 monoplegia, 한 뒷 다리의 완전 한 마비에에서 사지 (3.0의 점수) 및 하반신 마비, 두 뒷 다리의 전체 마비 사지 (3.5의 점수). 매우 느린 전진 운동에 온건한 quadraparesis, 모든 4 개의 사지의 약점 결과 (4의 점수). 심한 quadraparesis 수 거의 앞으로 운동 (4.5의 점수). 마지막으로, 심각한 질병을 가진 그들은 죽어가는 될 수도 (5의 점수) 죽을.
5. 관리 마우스 또는 액체 또는 고체 식품 염 분 i.p. 포도 당 5%의 1 mL를 획득 하는 능력을 잃게 하는 액체로 사용 보충 탈수 및 음식 부족을 중화 컵, 높은 칼로리 젤과 베이컨 나왔던 젤. 죽어가는 쥐를 안락사.

8. 조직 준비 및 조직학

1. 쥐 100 mg/kg 마 취 제와 10 mg/kg xylazine, Anesthetize 그리고 다음 해 부 보드에 각 노상 강도 핀.
2. 열기는 가슴을 노출 마음. 혈액 유출 허용 하도록 간 incise 나비 바늘 PBS와 10% 포 르 말린에 대 한 별도 저수지를 사용 하 여 miniflow 변속 펌프의 튜브에 연결 합니다. 심장의 좌 심 실에 바늘을 삽입 하 고 뒤에 10% 포 르 말린의 25 mL PBS의 5 mL와 함께 perfuse.
3. 머리 그리고 눈을 제거합니다. 프로세스 눈과 망막 앞에서 설명한 ²⁰. 눈 소켓을 가로질러, 코에서가 위를 삽입 하 고 각 측면에 후부 앞쪽 두개골을 잘라.
   1. 두개골을 제거, 노출 시 신경, 시 chiasm 잘라내어 2 거품 패드 사이 카세트에.
   2. 담가 10% 포 르 말린 (24 시간), 그리고 다음 50% 에탄올 (24 시간)에 70% 에탄올으로 다음 전송.
4. 뇌와 척추를 제거 하 고 10% 포 르 말린에. 직렬 섹션 두뇌 코로나 비행기; 섹션 척추 코드에 화살 (약 절반) 및 직렬 코로나 비행기 (마우스 당 약 20 횡단면).
5. 정기적으로 파라핀 포함에 대 한 프로세스 CNS 샘플입니다. 되며 고 오신 (시 신경) 또는 Luxol 빠른 블루 hematoxylin와 오신 (뇌와 척수) 8 µ m 두꺼운 부분 얼룩.
6. 시 신경 염증 신경 및 주변 meninges (광 신경 염) 또는 주로 주변 meninges (광섬유 perineuritis)의 존재에 대 한 평가.
7. Meningeal parenchymal 염증 foci 계산 (> 10 클러스터 된 단 세포) 각 마우스에 대 한 뇌와 척수 샘플에.

9. Vivo에서 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 의해 이미징 망막

참고: 쥐의 스펙트럼 도메인 10 월 망막 이미징 일관 된 눈을 달성 하기 위해 상용 장비 (예를 들어, TruTrack 눈 추적기 Spectralis)를 사용 하 여 수행 오리엔테이션 및 모션 아티팩트를 줄일.

1. 이미징, 이전 5 분 1 %tropicamide (눈 당 한 방울)과 눈동자를 팽창 하 고 당 분 (1.5 %isoflurane) 2 리터의 지속적인 흐름을 제공 하는 마 취 유도 실에서 이미지를 마우스. 열 매트 설정 하 고 준비 후 마 취 회복 케이지.
2. 이미징 실린더에 마우스 놓고 마 취 흐름을 따라 이동 합니다. 0.3% 여기 스 눈을 축축한 유지 하 고 굴절 연속성을 보장 하기 위해 눈을 보호 합니다. 눈 검사에 사용자 지정 콘택트 렌즈 배치.
3. 적외선 저 이미지에 의해 유도 빔 중심 시 신경 머리에 보장 눈에 레이저를 직접. 수직 및 수평 10 월 검사 망막 레이저에 수직 레이아웃 확인 해야 합니다.
4. 고해상도 모드와 30에서 래스터화 수행 25 B-스캔 평균 A-스캔.
5. 후 이미징 두 눈, 콘택트 렌즈를 제거 하 고 안과 젤을 적용. 따뜻한 복구 장에 마우스를 둡니다.

10. 처리 및 10 월의 분석

1. 이미징 소프트웨어 자동된 분할에 대 한 모듈을 사용 하 여.
   1. 수동으로 올바른 세그먼트 내부 제한 막 (ILM)와 내부 plexiform 레이어 (IPL)에 해당, 안쪽 망막의 한계를 나타내는 레이어를 (IRL) ²¹.
   2. 망막 신경 섬유 층 (RNFL) 신경 절 세포 층 (GCL)는 IRL의 한계 내에서 거주 하 고 오버랩 되지 않는 확인 하십시오.
2. 계산 IRL 두께 1, 2, 및 3 m m 광학 디스크에 스프레드시트 파일에 수출 중심의 직경을 가진 초기 치료 당뇨병 성 망막 증 연구 (ETDRS) ² 그리드를 사용 하 여. 소프트웨어는 각 그리드 부문 평균 하 여 각 망막 층의 두께 계산 합니다. 따라서, 시 신경 머리에 해당 하는 중앙 세그먼트는 제외 됩니다.
3. 각 시간 지점에서 그룹 간의 통계적 차이 분석합니다. 일반화 추정 방정식 교환 상관 관계 매트릭스와 내부 주제 간 눈 상관 관계 ²¹에 대 한 조정을 사용 하 여 각 마우스에 대 한 양쪽 눈 분석.

결과

이 프로토콜에서 우리는 C57BL/6 AQP4^/- 생쥐에서 기증자 T 세포를 사용합니다. 병원 성 T 세포 epitopes를 포함 하는 AQP4 p135-153 또는 p201-220,이 쥐의 피하 접종 elicited 강한 증식 T 세포 응답 배출 림프절 (그림 1)에이 두 펩 티 드 훨씬 약한 T 세포를 유도 하는 반면 WT 쥐에서 확산입니다. 비교에서는, AQP4 p91-110와 예방 접종 비 병원 성 AQP4 T 셀 결정¹³또는 MOG p35-55, 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)^{22,23 시키는 T 세포를 활성화 하는 수 초 펩 티 드를 포함 하 ,24}, 유도에 AQP4^-/- WT 쥐 T 세포 확산의 유사한 크기. 교류 cytometry 얼룩 TCR 사용률 분석 개별 Vβ 또는 Vβ, AQP4^/- 생쥐에서 p135-153-및 p201-220-특정 T 세포 독특한 TCR 레파토리 활용 시연에 대 한. 선택적 하이퍼-확산 p135-153, p201-220 AQP4^/- 생쥐로 독특한 TCR 활용 (그림 2), AQP4의 이러한 결정에 대 한 병원 성 T 세포 응답은 일반적으로 thymic 네거티브에 의해 규제 표시 선택, AQP4^-/- 기증자 T 셀이이 프로토콜을 사용 하 여에 대 한 중요성을 강조.

ATCA의 유도 대 한 입양 전송 전에 림프절 세포 AQP4 펩 티 드 액 쥐에서 3 일 동안 Th17 또는 Th1 편광 조건에서 생체 외에서 경작 했다. 어느 정도 분극 기증자 CD4의⁺ T의 세포 (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 의해 확인 되었고 cytometry (그림 3)에 의해 측정. 순진한 받는 사람 마우스는 2 x 10⁷ 기증자 AQP4 펩 티 드 관련 T 세포와 정 맥 주입 했다. 약 6 일 후, 거의 100% 받는 사람 마우스의 개발 CNS 자가 면역 질환, 다리를 절 며 꼬리와 뒷 다리 마비 (그림 4)를 포함 하 여 임상 증상. Th17 편광 AQP4 전용 T 세포 Th1 편광 AQP4 전용 T 세포 보다 더 심한 임상 질환을 유발. Th17 AQP4-펩 티 드-특정 받은 완전 한 뒷 다리 마비 (하반신 마비)를 개발 하는 대표적인 마우스 비디오 1에 표시 됩니다. MOG 특정 Th17 세포의 관리 후 EAE를 개발 하는 쥐와 받는 사람 마우스 AQP4 전용 Th17 세포에 의해 유도 된 임상 질병에서 회복. EAE MOG p35-55-특정 Th17 세포에 의해 유도 된에 관해서는 p135-153-특정 AQP4에 의해 유도 된 임상 질환 또는 p201-220-특정 Th17 세포 CNS 실질에서 meninges (그림 5) 단 세포의 침투와 관련 되었다. 병 변 더 AQP4 특정 Th17 세포에 의해 유도 된 CNS 면역에 대 한 실질에 보다 meninges에 풍부 했다.

조직학 평가 및 직렬 10 월 AQP4 관련 하 여 시 신경 관련 입증 되었다 고 집 고 양이 특정 Th17 세포 두 유도 시 신경 염증, 단 세포의 존재에 의해 특징 했다. 반면 AQP4 전용 Th17 세포 발생 광섬유 perineuritis, MOG 특정 Th17 세포 유도 심각한 광학 신경 염 (그림 5). 직렬 OCT를 사용 하 여, 시 신경 염증 분명 불어서 고 AQP4 또는 MOG 특정 Th17 세포 (그림 6)에 의해 유도 된 임상 질환에 대 한 내 망막 층 (IRL) 두께 증가. AQP4 Th17 유도 CNS 면역에 대 한 쥐로 기준선을 반환 IRL 두께 임상 질병에서 회복. 반면, EAE MOG 특정 Th17에 의해 유도 된의 지 속성 대응 IRL 엷게 하 고, 살펴본 바와 같이 이전¹⁷, 망막 신경 절 세포의 감소와 관련 되었다.

그림 1 : AQP4^/- 생쥐 하지만 하지 WT 쥐에서 강력한 T 세포 증식을 유도 하는 AQP4 p135-153, p201-220. 마우스 접종 했다 CFA에 표시 된 펩 티 드와 사우스 캐롤라이나. 11 일 후, 림프절 제거 하 고 중 아무 항 원 또는 펩 티 드 면역에 대 한 사용을 경작 했다. 확산 ³H 티 미 딘 법인 (평균 ± SEM, 5 실험의 대표)에 의해 측정 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : AQP4^/- 생쥐에서 AQP4 전용 T 세포 활용 독특한 TCR 레파토리. 표시 된 펩 티 드 AQP4^-/- 와 WT 쥐 접종 했다. 11 일 후, 림프절 제거 하 고 예방 접종에 대 한 사용 하는 펩 티 드와 경작 했다. 세포를 수확 했다. TCR Vβ 사용률 cytometry에 의해 분석 되었다 (± sem의 의미 n = 5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 기증자 AQP4 전용 T 세포의 양극 화 Proinflammatory. 11 일 AQP4 p135-153 또는 p201-220, 예방 접종 후 림프절 세포 수확 되었고 비 편광 조건, Th1 또는 Th17 편광 조건에서에서 예방 접종에 대 한 사용 하는 펩 티 드와 경작. Th17 Th1 분극 시험 되었다 IC 및 흐름 cytometry에 의해 IL-17 또는 IFN-γ, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : Th17 편광 AQP4 전용 T 세포 유도 WT 받는 사람 마우스 마비. WT 받는 사람 마우스 AQP4^/- 생쥐에서 2 x 10⁷ 기증자 Th17 편광 AQP4 p135-153 또는 p201-220-특정 T 세포를 받았다. Th17 편광 MOG 전용 T 세포 긍정적인 컨트롤로 제공 됩니다. 8 실험의 결과 (n = 5/그룹). * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : AQP4 특정 Th17 세포 유도 WT 쥐에 opticospinal 염증. 받는 사람 마우스 2 x 10⁷ 기증자 Th17 AQP4 p135-153-또는 p201-220-액 Th17 세포 AQP4^/- 생쥐에서 또는 Th17 MOG p35-55-특정 셀을 접수 하 고 10 일 후를 희생 했다. 척수와 시 신경 조직 준비 되었고 H로 얼룩진 & E/LFB 염증과 demyelination의 증거에 대 한 평가를각각. 결과 5 쥐/그룹의 대표입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6 : 시 신경 염증 AQP4 전용 Th17 세포에 의해 유도 된 경도 망막 10 월에 의해 모니터링할 수 있습니다 WT 받는 사람 마우스 하루 0에 2 x 10⁷ 기증자 Th17 편광 AQP4 p201-220-특정 또는 MOG p35-55-특정 T 세포를 받았다. 그들은 전날 0 (T 세포의 관리)에 10 월에 의해 시험 되었다 일에 다음 4, 7, 8, 9 10, 11 14 및 21. IRL 두께 측정된 (평균 ± SEM) 했다. 통계는 순진한 컨트롤과 비교를 나타냅니다. 결과 3 실험 (5 쥐/그룹)의 대표. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

AQP4는 2005³NMO IgG에 주 대상으로 확인 되었습니다. 다음, 그것은 CNS autoimmunity의 AQP4 대상 동물 모델을 확립 하는 것이 중요 될 것 이라고 인정 받았다. 이러한 모델 AQP4 전용 T와 B 세포 CNS autoimmunity의 개발에 참여 하는 방법을 조사 하 고 후보 치료제 NMO 테스트 유용할 수 있었다. 비록 야생-타입 마우스에서 epitopes 2010¹³, 그 epitopes에 응답 하는 T 세포에에서 처음 알려졌다 AQP4 전용 T 세포의 임상 또는 조직학 질병^14,17를 일으키지 않았습니다. CNS 면역 면역 반응성 AQP4 기반으로 모델을 생성 하는 무 능력 2015 때까지 수수께끼에 남아 있었다 존스, 외. ²⁵ AQP4^/- 생쥐에서 기증자 AQP4 p135 153 준비 하는 T 세포 WT 쥐에서 CNS autoimmunity의 임상 및 조직학 징후를 일으키는 수 있었다 발견 했다. 관심의 높은 선호도¹⁷와 MHC II (-A^b)을 바인딩할 AQP4 p135-153 전망 이다. 단 하나의 다른 AQP4 아미노산 시퀀스, 201-220-A^b 비슷한 높은 선호도 바인딩할 전망 이다. 사실, 우리 p201-220 두 AQP4^-/-, 하지만 WT 쥐에서 강력한 확산 유도 그 AQP4 p135-153를 관찰. 여기, 우리가 어떻게 분리 수 있고 확장 encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153-및 p201-220-반응 T 세포 AQP4^/- 생쥐에서 나타났습니다. WT 받는 쥐로 전송 하는 경우 기증자 AQP4 반응 Th17 세포 유도 마비, 척수와 시 신경에 단 세포 침투를 동행 했다. 성의 비주얼 시스템 부상 AQP4 seropositive NMOSD²⁶를 가진 환자에서 잘 알려져 있다. 여기, 우리는 AQP4-반응성 고 집 고 양이 반응 Th17 세포에 의해 유도 하는 시 신경 염증은 뚜렷한 관찰 했다. 반면 AQP4 전용 Th17 세포 유도 광섬유 perineuritis, MOG 특정 Th17 세포 심각한 광학 신경 염 유발. 우리는 또한 직렬 10 월 AQP4 및 MOG 전용 T 세포에 의해 유도 하는 시 신경 염증을 모니터링 하는 데 사용 하는 기법을 설명 했습니다. 다른 수 사관은 지금 ATCA의 병원 성 기계 장치에 집중 하는 그들의 자신의 연구를 여기에 설명 된 프로토콜을 적용할 수 있어야 합니다.

하나는 쉽게 우리의 프로토콜에 3 개의 잠재적인 함정을 피할 수 있습니다. ATCA의 첫 번째, 입양 전송 AQP4^-/- 기증자 쥐에서 AQP4 전용 T 세포의 사용을 요구 한다. 특히, 기증자 WT AQP4 p135-153-특정 T 세포 받는 WT 쥐 ATCA를 일으키지 않았습니다. 둘째, 그것은 "물-테스트" AQP4^/- 생쥐 (프로토콜 단계 1.5)의 예방 접종 전에 펩 티 드/CFA 에멀젼 방울과 함께 수행 하는 것이 중요. 그것은 사우스 캐롤라이나 사출에 적합 때 유제 물에 분산 하지 해야. 유제 분 광 경우 하나 한 번 더 유제를 혼합 해야 다시 진정 고 물-테스트를 반복 합니다. 마지막으로, 활성화 된 기증자 CNS 항 원 특정 T 세포는 T 세포 휴식 보다 더 효율적으로 CNS 면역 유도. 하나는 시각적으로 입양 전송 위한 기증자 T 세포를 수확 전에 가벼운 현미경 그 문화를 검사 해야 합니다. 급속 하 게 세포 분할 클러스터, 쉽게 확인 양식 수 있습니다. 또한 때 많은 활성화 된 T 세포를 포함 하는 문화, 미디어 수 있습니다에서 전환 핑크 오렌지 또는 황색, ph에서 감소 때문. 프로토콜 단계 3에서 설명한 대로 하나 또한 확산에 대 한 기증자 림프절 AQP4 준비 하는 T 세포의 활성화 ³H 티 미 딘 법인에 의해 평가할 수 있습니다.

두 개의 병원 성 AQP4 T 셀 epitopes는 (1) 예측 높은 선호도와 MHC II를 바인딩할 및 (2) AQP4^-/-, 하지만 하지 WT에 강력한 증식 응답을 이끌어내는 우리의 발견, 쥐 그 결정을 대상으로 하는 T 세포는 일반적으로 제안 thymic 부정적인 선택¹⁷에 의해 제어. AQP4 p135-153, p201-220 AQP4^/- 생쥐에서의 인식에 대 한 활용 TCR 레파토리는 독특한 (그림 2),이 클론 삭제 thymic 골 수 상피 세포에 의해 중재와 일치. 다른 tolerogenic 메커니즘 수 있습니다 일반적으로 AQP4에 대 한 면역 응답을 제 지. 우리의 초기 보고서¹⁷, 이후에 다른 그룹도 시연 했다 AQP4 p201-220 encephalitogenic T 셀 결정²⁷포함 되어 있습니다. 때 α/β (TCRα^-/-) T 세포 결핍 마우스 AQP4^-/- CD4 재구성 했다⁺ T 셀, encephalitogenic AQP4 전용 T 세포 응답, 하지만 하지는 AQP4 특정 체액 반응, 그 암시를 이끌어내는 것이 가능 했다 WT 쥐 AQP4 특정 B 세포 응답, AQP4 전용 T 세포 응답, 비슷한 부정적인 선택 될 수 있습니다. 사실, 혼자 AQP4 전용 T 세포에 의해 유도 된 ATCA WT 쥐에서 관찰 하지는, 척추 축 삭 및 RGCs, 손실 병원 성 AQP4 특정 항 체의 참여를 요구할 수 있습니다. 그것은 분명 AQP4 대상 CNS autoimmunity의 마우스 모델 tolerogenic 메커니즘을 일반적으로 AQP4 전용 T 세포 및 B 세포 면역 제어에 대 한 자세한 내용은 진화를 계속 하는 것입니다.

AQP4 대상 CNS 면역의 다른 모델도 되 고 개발된^{6,16,,2829,30}. 각자 공부 NMO 병 인에 관련 된 특정 측면에 대 한 장점을 제공할 수 있습니다. AQP4 전용 T 세포 WT 쥐^6,,1629에서 확인 되었습니다. 그 AQP4 전용 T 세포 발생의 CNS 면역 조직학 변화 하지만, 마찬가지로 쥐에서 관찰, WT 쥐 AQP4 전용 T 세포 발생 하지 않습니다 임상 질병의 중요 한 표시. 따라서, WT 쥐의 T 세포와 B 세포 AQP4 특정 면역 응답을 제한 하는 허용의 메커니즘은 쥐에서 작동도. 관계 없이, 하나 해야 마우스 모델을 사용 하 여 질병의 병 인에 관여 하는 메커니즘을 공부에 전력을 과소 평가 하지. 녹아웃, 유전자 변형 및 기자 쥐의 부 유리할 수 있습니다. 그것은 또한 몇 가지 기본적인 발견 면역 마우스 EAE 모델을 사용 하 여 만들어진 인식 되어야 한다. 예를 들어 데모 그 T 세포 클론 자가 항 원에 대 한 특정 면역 질환^31,32,³³ 면역에서 T 세포 costimulation의 역할 및의 발견을 중재할 수는 Th17 차별화³⁴ 에 대 한 개발 통로 처음 마우스 EAE 모델을 사용 하 여 설명 했다. 우리가 개발한 ATCA의 마우스 모델을 사용 하 여, 하나 지금가지고 연구 개발 및 병원 성 AQP4 특정 면역 응답을 vivo에서의 규제 수단 NMO 병 인에 관련 된 중요 한 통찰력을 제공 한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
M. tuberculosis H37Ra	BD Difco	231141	Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant	BD Difco	263910
AQP4 peptide p135-153	Genemed	Custom Synthesis	Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220	Genemed	Custom Synthesis	Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55	Genemed / Auspep	Custom Synthesis	Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock	Kimble	420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized)	GE Healthcare Life Sciences	SH30071
Recombinant Mouse IL-23	R&D Systems (BioTechne)	1887-ML
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems (BioTechne)	406-ML
Recombinant Mouse IL-12	R&D Systems (BioTechne)	419-ML
Thymidine [Methyl-3H]	PerkinElmer	NET027
Glass Fiber Filtermats	PerkinElmer	1450-421
Anti-mouse antibodies	eBioscience (Affymetrix)	[various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel	BD Biosciences	557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain	ThermoFisher Scientific	[various]
Paraformaldehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug	BD Biosciences	555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Iomomycin (calcium salt)	Sigma-Aldrich	I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis	List Biological Laboratories	181
10% Formalin	VWR	89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular	Fisher Scientific	22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP)	Henry Schein Animal Health	050033	NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)	Akorn		NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform	Heidelberg Engineering