JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол вызвать паралич и opticospinal воспаление путем передачи Аквапорин-4 (AQP4)-конкретных Т-клеток от AQP4- / - мышей в WT мышей. Кроме того мы показали, как использовать последовательный оптическая когерентная томография для мониторинга дисфункции зрительной системы.

Аннотация

Хотя признано, что Аквапорин-4 (AQP4)-конкретные Т-клеток и антител участвуют в патогенезе нейромиелит optica (NMO), аутоиммунные демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) на человека, создание AQP4-ориентированные модели с обоими клинические и гистологических проявления аутоиммунных заболеваний ЦНС оказалась сложной. Иммунизации одичал тип (WT) мышей с AQP4 пептидами вызвал пролиферации клеток T, хотя эти Т-клетки не могут передавать болезни наивно получателей мышей. Недавно были определены два романа AQP4 T клетки epitopes, пептид (p) 135-153 и p201-220, при изучении иммунных реакций на AQP4 в AQP4-недостаточным (AQP4- / -) мышах, предлагая реактивности Т-клеток в этих epitopes обычно контролируется тимуса негативный выбор. AQP4- / - Th17 поляризованные Т-клеток, загрунтованных p135-153 или p201-220 индуцированных паралич получателей WT мышей, который был связан с преимущественно лептоменингеальных воспаления спинного мозга и зрительных нервов. Воспаление окружающих зрительных нервов и участие внутренних слоев сетчатки (IRL) проявились изменения в последовательный оптическая когерентная томография (Окт). Здесь мы иллюстрируем подходы, используемые для создания этой новой в естественных условиях модели AQP4-ориентированных ЦНС аутоиммунных заболеваний (ATCA), которые теперь могут быть использованы для изучения механизмов, обеспечивающих развитие патогенных AQP4-специфических Т-клеток и как они могут сотрудничать с B клетки в патогенезе NMO.

Введение

Нейромиелит optica (NMO) является центральной нервной системы (ЦНС) аутоиммунные воспалительные демиелинизирующих заболеванием, которое вызывает периодические эпизоды паралич и потерю зрения, ведущих к постоянной инвалидности неврологических1. NMO в настоящее время считается главным образом гуморальные Аутоиммунные болезни2 как он связан с антителами (Igs) ориентации Аквапорин-4 (AQP4), водный канал, выразил изобилии астроциты3,4. Однако воспаление CNS является необходимым условием для вступления ЦНС AQP4 Ig5,6. Таким образом не удалось установить модель NMO переводом только Igs анти AQP4. Выводы, что (1) патогенных AQP4-конкретных Igs NMO больных являются IgG11,2, Т клеток зависимых Ig, Т-клетки подкласс7 (2) определены в NMO поражения8,9 (3) NMO связан с некоторых генов MHC II (например HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10и (4) провоспалительного AQP4-реактивной DR-ограниченного Th17 клетки раскрываются в NMO больных11,-12 все показывают, что AQP4-специфических Т-клетки имеют ключевую роль в патогенезе NMO. Таким образом важно развивать Животные модели, чтобы определить, как AQP4-специфических Т-клетки могут способствовать NMO патогенеза.

Несколько лет назад, в одичал тип (WT) мышах13,14 крыс и15были определены несколько эпитопов клетки AQP4 T. Хотя было отмечено, что AQP4-реактивных Т-клетки могут вызывать воспаление opticospinal в наивной получателей крыс15,16, не наблюдались значительные клинические признаки заболевания ЦНС. Аналогичным образом, прямые иммунизации WT мышей с пептидами, содержащие AQP4 T клетки epitopes14,17, или передачи провоспалительных T клеток, ориентация этих детерминант17, не вызывать клинических признаков или гистологических свидетельство о аутоиммунные заболевания ЦНС.

Недавно оно было отмечено, что иммунизация мышей C57BL/6 AQP4-недостаточным (AQP4- / -) с AQP4 пептид (p) 135-153 или p201-220, две детерминанты, предсказал для привязки MHC II (b-A) с высоким сродством18, вызвали сильное CD4 + Т-клеток ответов17. Напротив эти два пептиды вызвало только скромный пролиферативной ответы в WT мышей. Кроме того уникальный репертуар рецептор (TCR) Т-клеток, использовался для распознавания этих детерминант клетками T от AQP4- / - мышей. Коллективно эти результаты показывают, что Т-клеток признание AQP4 регулируется тимуса негативный выбор. AQP4 p135-153-p201-220-конкретных или Th17 клеток от AQP4- / - доноров мышей вызванных паралич в почти 100% наивно получателей WT мышей; Это было связано с opticospinal инфильтратами Т-клеток, лимфоцитов и моноцитов. Серийный opticospinal когерентная томография (Окт) продемонстрировали участие динамические визуальные системы. Мышей с Т клеточный AQP4-ориентированных ЦНС аутоиммунных заболеваний (ATCA) оправился от паралича и зрительной системы травмы. В отличие от ЕАЕ индуцированных миелина Олигодендроциты гликопротеина (MOG) p35-55-специфических Т-клеток, приведшие к стойким клинического заболевания, ATCA индуцированных Т-клеток, только не был связан с аксональное потери или уменьшения в клетках сетчатки ганглия (РГК). Наши результаты четко продемонстрировали, что существует несколько патогенных детерминанты клетки AQP4 T. Эта новая модель ATCA полезно для изучения механизмов, контролирующих развитие патогенных AQP4-специфических Т-клеток, обучение как эти клетки вызывают воспаление CNS и как они могут сотрудничать с AQP4-специфические клетки и антител к содействию NMO патогенеза .

В настоящем докладе мы описывают протоколы, используемые для побудить и оценивать Т клеток индуцированной ATCA. Мы начинаем с методы, используемые для иммунизации, культуры клеток T и Th17 поляризации для создания патогенных AQP4-специфических Т-клеток, поток cytometry анализ для подтверждения поляризации и приемных передачи этих Т-клеток. Затем мы опишем методы, используемые для оценки клинических и гистологических болезни и использование последовательного OCT для мониторинга зрительной системы травм получателям мышей.

протокол

всех животных процедуры были проведены экспериментальные утвержденных университета Калифорнии, Сан-Франциско институциональный уход животных и использования Комитетом руководящим принципам. Самок мышей C57Bl/6 (H-2 b), 8 недель возраста, были закуплены и были предоставлены мышей C57BL/6 AQP4 - / - а. Verkman.

1. иммунизации мышей с пептидами AQP4

  1. подготовить полный Фройнд ' фондовой работы s адъювантной (CFA).
    1. Мелко Измельчить сушеные подготовка микобактерий туберкулеза (H37Ra) с помощью ступку и пестик.
    2. Добавить молотый H37Ra к неполной Фройнд ' s адъювант в конечной концентрации 4 мг/мл. CFA может храниться при температуре 4 ° C на срок до 6 месяцев.
  2. Растворяют лиофилизованный препарат антигена (Ag) AQP4 пептида в фосфатный буфер (PBS) до конечной концентрации 1 мг/мл. Сохранить на 4 ° C или на льду
  3. Подготовить Ассамблеи 2 шприцах luer-lock, вместе с краном, содержащий эмульсии CFA/пептид.
    1. Присоединить шприц luer-lock стекла без поршень для 3-полосная нейлон запорный с 2 мужской люэровского подключения. Закройте кран переключения рычага к шприца. Расположите открытый конец шприца вверх, позволяя шприц в качестве пробирке. Поместите это в стойку трубки для дополнительной устойчивости.
    2. Vortex CFA рабочей фондовых и решение Ag. Добавление 1:1 тома пептида / CFA открытых шприца. Каждого мыши необходим 200 мкл CFA/Ag (4 x 50 мкл).
      Примечание: Как правило, около 1 мл препарата теряется в кран, который приведет к сокращению объема имеющихся для иммунизации. Таким образом, важно включить это в расчет общего объема требуется.
      Пример: для иммунизации 5 мышей: (200 мкл/животные x 5 животные) + 1 мл дополнительный объем = 2 мл, требуется всего CFA/Ag.
    3. Вставить стекло поршень в шприц и удерживая его на месте, инвертировать шприц так что запорный ориентирован вверх. Переключатель запорный рычаг на неиспользуемые женского связь. Тщательно надавливайте на поршень стекла для удаления избытка воздуха из шприца. Жидкость заполняет второй мужской люэровского подключения запорный.
    4. Прикрепить второй стеклянный шприц (поршень полностью вставлена) второй мужской люэровского подключения краном. Это должно быть замкнутой системы 2 стекла шприцы, связанные с краном, содержащие как маленький избыток воздуха максимально.
    5. Для создания эмульсии, смешать толкает поршни передать жидкость поочередно между 2 шприцы для около 2 мин Chill, шприцы на льду на около 10 мин повторить охлаждения и смешивания до тех пор, пока существует четкое изменение вязкости подготовки , что приводит к очень плотная, белая эмульсия. Охладите шприцы, содержащие эмульсии на 4 ° C или поддерживать на льду
  4. Все эмульсии передать один стакан luer-lock шприц, удалите пустой стакан шприц и заменить его с luer-lock шприц 1 мл раствора для инъекций. Заполнить новый шприц с эмульсией, удалить его с краном и прикрепить иглы (25 g x 5/8).
  5. " вода тест " эмульсия для последовательности. Высылать капля эмульсии в небольшое блюдо воды. Эмульсия не должны разойтись, указав, что она подходит для инъекций.
    1. Если эмульсия расходится, он не готов для инъекций; передача жидкости обратно в стекла шприцы и продолжать смешивать и затем охладить снова до тех пор, пока эмульсии жесткой.
    2. Тест эмульсии снова до тех пор, пока был достигнут надлежащей последовательности.
  6. Подкожно вводить доноров AQP4 - / - мышей (с.к.) с эмульсия, содержащая AQP4 пептид. Каждая мышь получает 4 x 50 мкл s.c. инъекции (200 мкл всего (100 мкг пептид)). 4 места включают стороны нижней части живота, которые стекают в паховые лимфатические узлы (LN), и обе стороны грудной стенки медиальнее каждого подмышечной впадины, которые стекают в подмышечных LN. Приемных передача потребует мышей иммунизированных доноров 1-2 на получателей мышь.

2. Культура клеток T и провоспалительных T Мобильный поляризации

  1. 10-12 дней после иммунизации, собирать LN от мышей.
    1. В поддон для льда, подготовить Петри 60 мм оснащены стрейнер клеток (сетка размер 70 мкм) и содержащие охлажденные RPMI СМИ с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и 100 ед/мл пенициллин-100 мкг/мл стрептомицина (ручка стрептококк) (ОПП).
    2. Euthanize мышей под воздействием CO 2, следуют шейки матки дислокации. Погружать мышей в 70% этанола и затем прикрепить каждый зверолов к доске диссекции.
    3. Вырезать срединной Кожный разрез от паховой области до шеи и вниз каждой ногой. Потяните кожу от брюшины и tautly контактный его правлению. Вскрыть подмышечной и паховой LN и поместите в Петри, содержащие RFPS, на льду. 19
    4. для приемных передачи экспериментов, объединить LN от всех животных в пределах одной и той же группы иммунизации. Для потока гранулярных анализ использования Vβ, отдельные LN от отдельных животных.
  2. Место сетчатый фильтр ячейки, содержащие LN на 50 мл пластиковых пробирок, содержащие RFPS. Используйте клавишу LN клетки через ситечко, мытье с 20-30 мл RFPS содействия восстановлению клеток плоский конец поршень шприца стерильный 5 мл. Поддерживать LN клетки на льду всей обработки до времени для культуры.
  3. Мыть дважды, центрифугирование в 393 x g за 5 мин. После второго мыть Ресуспензируйте LN клеток в клетки T СМИ (TCM). TCM содержит RPMI с 10% тепло инактивированная FBS, 292 мкг/мл L-глютамином, 110 мкг/мл пируват натрия и 55 мкм 2-меркаптоэтанол и перо стрептококк. Как правило, используется объем 5 мл TCM доноров мышь.
  4. Количество клеток пер. Ожидаемой доходности — примерно 3-6 x 10-7 LN клеток в иммунизированной мыши доноров. Отложите в сторону 3-4 x 10-6 для распространения assay (см. раздел 3 ниже).
  5. Создана поляризационный культур для приемных передачи (раздел 6).
    1. Подготовить Th17 поляризационный культуры 5 х 10 6 LN клеток / мл с 10 мкг/мл Ag, 20 нг/мл мыши рекомбинантного интерлейкина (IL) -23 и 10 нг/мл рекомбинантной мышь ИЛ-6 в TCM.
    2. В качестве альтернативы, для поляризации Th1, подготовить культуры 5 х 10 6 LN клеток / мл с 10 мкг/мл Ag и мышь 10 нг/мл рекомбинантного ИЛ-12 в TCM.
    3. Добавить 2 мл (1 x 10-7-клетки) также поляризационных культуры смесь в тарелку 12-хорошо. LN клетки от 2-4 доноров мышей будет заполнить один 12-ну пластины. Поддержания культур в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO 2 за 72 ч.
      4. Т-клетки будет увеличиваться в размерах, становится больше плеоморфные
    4. визуально проверить LN клетки в культуре для активации на 48 ч и 72 ч. активированные клетки образуют обширные кластеров. Увеличение метаболизма приведет к снижению рН в средствах массовой информации, меняется от персика на оранжевый. Если рН является достаточно низкой, чтобы пожелтеть СМИ, добавьте 1 mL свежих TCM для предотвращения токсичности для ячейки в остальные 24 h.
    5. Перейти к раздел 6 приемных передачи. Поляризации эффективности может быть проверена путем внутриклеточных цитокинов, окрашивание (ICS), как descriBed в разделе 5.
  6. Создана культур, используя LN от отдельных мышей для анализа потока гранулярных экспрессии поверхностных Vβ (раздел 4).
    1. Подготовить 5 х 10 6 клеток LN / мл с 10 мкг/мл Ag в TCM.
    2. Добавить 2 мл (1 x 10-7-клетки) культуры за хорошо в 12-ну плиту. Культур следует сохранить в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO 2 на 10 дней. Перейдите к разделу 4.

3. Распространения Assay

Примечание: это продолжается из раздела 2.4.

  1. Подготовить 3-4 мл LN клеток в трубку, 2 x 10 6 клеток / мл в TCM.
  2. Осторожно смешать клетки, инвертирование трубке несколько раз и затем передать стерильные корыте.
  3. Использование многоканальных дозаторов для пластины 100 мкл клеток на колодец в 96-луночных раунд культуры ткани днище. Как правило, плиты 15 скважин для трех экземплярах тестирования 4 Ag концентрации и не ссылку Ag.
  4. Развести Ag в TCM в различных концентрациях, обычно 80, 20, 5, 1 и 0 мкг/мл (для 2 x запасов). 100 мкл каждого концентрации, в трех экземплярах для конечной концентрации 40, 10, 2.5. 0,5 и 0 мкг/мл. Инкубируйте приблизительно 72 ч при 37 ° с.
    Примечание: шаги 3.5 через 3.7 привлекать радиоактивных материалов. Правильное использование, мониторинга и удаления радиоактивных материалов должны проводиться, по словам институциональные и правительственные правила.
  5. Приготовить рабочий раствор 3 H-тимидина (40 Μки/мл) путем добавления 1 МРП 3 H-тимидина 25 мл RPMI и хранить это в 4 ° C. Накапайте 0,5 мл рабочего раствора в стерильных ринв.
  6. Добавить 25 мкл 3 H-тимидина (1 Μки) за хорошо с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте дополнительные 18 h 37 ° C.
  7. Урожая клеток на стекловолокно фильтр, с помощью комбайн 96-луночных клеток и промыть 70% этиловом спирте. После высыхания, уплотнение фильтрующую прокладку в пластиковых проб с 5 мл сцинтилляционные жидкости. Измерения радиоактивности в каждой хорошо используя счетчик сцинтилляции.

4. Cytometry анализ для клеток поверхности TCR Vβ выражение потока

Примечание: это продолжается из раздела 2.6. Антитела для мыши TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 и 5.2, 6, 7, 8.1 и 8.2, 8.3, 9, 10В, 11, 12, 13, 14 и 17a доступны коммерчески для тестирования выражения TCR Vβ.

  1. Для обнаружения TCR Vβ, выбить Т-клетки от культуры пластины, закупорить несколько раз и передать трубку клетки.
  2. Мыть с СУИМ буфер (FB), содержащий 2% FBS, азид натрия 0,1% и 2 мм ЭДТА в PBS.
  3. Передачи клетки к V-дно 96-луночных пластины на плотности 5 1 x 10-3 х 10 6 клеток на хорошо. Если тестируется вся группа Vβ, клетки должны распределяться на несколько скважин (один хорошо за Vβ тестируется).
  4. Исключает мертвые клетки от анализа потока гранулярных путем пятнать с краской жизнеспособности LIVE/DEAD, который реагирует с бесплатным амины, предоставляемые отмершие клетки. Следуйте производитель ' s инструкции для центрифугирования и ресуспендирования в жизнеспособности красителя. Инкубируйте на льду на 10-20 мин на протяжении клетка пятная процедур, защищают клетки от света и держать на льду
  5. После инкубации, мыть тарелку раз в FB. Чтобы обнаружить TCR Vβ, приостановить клетки в 100 мкл FB, содержащий разбавления 1: 100 антител для CD4 (клон RM4-5) и TCR Vβ. Инкубируйте 15-60 мин на льду
  6. Раз мыть тарелку в FB и исправить ячейки, добавив 200 мкл параформальдегида 4%, разбавленных в PBS. Проинкубируйте втечение 20 мин на льду. Вымойте тарелку в FB и анализировать подачей cytometry.

5. Гранулярных анализа для внутриклеточных цитокинов производства

  1. для внутриклеточных цитокинов, окрашивание (ICS), лечения Т-клеточных культур с 1:1,000 растворения реагента ингибитором белка транспорта (например, GolgiPlug) в TCM, 4 ч до ICS для предотвращения секрецию цитокинов. В то время, активация Т-клеток с 50 нг/мл phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) и 500 нг/мл ionomycin для того, чтобы побудить производства белка.
  2. После 4 ч культуры при 37 ° C, выбить клетки от культуры пластины, закупорить вверх и вниз и передачи для пластиковых пробирок (15 или 50 мл).
  3. Мыть с FB. Ресуспензируйте клетки в FB и передачи в V-дно 96-луночных пластины на плотности тарелок 5 x 10 5 3 х 10 6 клеток / колодец.
  4. Пятно клетки с жизнеспособностью красителя, как описано выше (раздел 4.2). После инкубации, мыть тарелку раз в FB.
  5. Добавить антитела для обнаружения поверхностных маркеров следующим:
    1. для обнаружения поверхностных маркеров, приостановить клетки в 100 мкл FB, содержащие 1: 100 разбавления антитела для CD4 (клон RM4-5).
    2. По желанию, включают в себя антитела для B220 (клон 30-F11) и CD11b (клон M1/70) при разбавлении 1: 100 для улучшения стробирования лимфоцитов и моноцитов/макрофагов, соответственно. Как правило пе-Cy7 анти CD4, FITC анти B220 и PerCP-Cy5.5 анти CD11b работают хорошо. Выбор антитела/флюрохром конъюгатов следует руководствоваться конфигурации проточный цитометр использоваться для анализа, и оптимальной концентрации антител должно определяться эпирически.
    3. Инкубируйте 15-60 мин на ДВС.
  6. Мыть тарелку с FB и Ресуспензируйте клетки в 200 мкл раствора фиксации/Permeabilization для 20 мин на льду. Это будет исправить клетки и разрушения мембран.
  7. Для того, чтобы поддерживать permeabilization клеточных мембран в ходе внутриклеточной окрашивание, использовать буфер Пермь/мыть (PW) (разбавленным 1:10 из 10 X запасов) вместо FB. Промыть лунки в 200 мкл PW.
  8. Для ICS, подготовить разбавления 1: 100 антител для интерферон (ИФН)-γ и IL-17а с использованием 1 x PW. Одним из вариантов является APC анти ИФН γ (клон XMG1.2) и PE анти IL-17а (клон eBio17B7) которая работает хорошо. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл внутриклеточных антитела коктейль и затем Инкубируйте по крайней мере 15 минут. Это также возможно продолжать окрашивания на ночь при 4 ° C.
  9. Мыть скважин в 200 мкл PW и ресуспендирования в FB для проточной цитометрии.
  10. Параллельно, подготовить безупречный пример (клетки в FB без антител) для оптимизации детектор напряжения и один витражи образцы для каждого индивидуального флюрохром (т.е. клетки или компенсации бусы, окрашенных с только одним антитела/флюрохром) для определить значения компенсации побочное.
  11. С помощью проточный цитометр, приобрести ≥ 10 000 ячеек (события), стробирования на жизнеспособные CD4 (LIVE/DEAD-минус) + клеток. Для обеспечения точной стробирования Т-клеток, исключить B220 + и CD11b + клеток (лимфоцитов и моноцитов/макрофагов, соответственно). В рамках CD4 + T ячейке субпопуляция, определить процент клеток, выражая ИФН γ (Th1 линии) или ил 17а (Th17 линия).

6. Приемных передачи патогенных AQP4-специфических Т клетки

Примечание: этот шаг следует из раздела 2.5: Т-клеток культуры и провоспалительных Т-клеток поляризации.

Плиты
  1. восстановить поляризованных клетки от 12-хорошо закупорить вверх и вниз, чтобы выбить, и их передачи на 50 мл трубки. Маintain на льду до инъекции.
  2. Подсчитать количество ячеек, вымыть в холодной PBS дважды и подготовить подвеска 1 x 10 8 клеток/мл в PBS. Как правило, придать клетки в течение часа.
  3. Осторожно смешать клетки, закрученного и передачи во время инъекции 1 мл шприц. Администрировать 200 мкл клеток (2 x 10-7) внутривенно (и.в.) к каждой мыши, через хвост вен.
  4. Вставки каждого получателя мыши и.п. с 200 ng B. коклюша токсина разбавляют в 200 мкл PBS в тот день и два дня спустя. Контролировать мышей ежедневно для признаки клинического заболевания.

7. Клиническая оценка ATCA

  1. изучения получателей мышей ежедневно для клинических признаков аутоиммунные заболевания ЦНС. В целом мышей будут показывать признаки аутоиммунные заболевания ЦНС 5-8 дней после передачи приемным AQP4-специфических Т-клеток. Мышей покажет клинические симптомы неврологической дисфункции. Это полезно для выполнения оценок на наивных мыши для определения нормальной способность мыши.
  2. Мышей Evaluate для потери хвоста тон. Аккуратно возьмите мышь в основании хвоста и поднять вертикально. Хвост, что обвисает постоянно характеризуется как потеря хвост тон (1 балл). Потеря тонуса хвост часто является первым признаком клинического заболевания.
    3. Рефлекс
  3. тест для восстанавливающее, поместив мышь на его обратно на плоской поверхности. Медленно восстанавливающее является признаком нарушения стволовая (Оценка 2). Наивный мышь полностью будет сопротивляться любая попытка поместить его на своей спине, так что медлительность в способности право оценивается как дисфункция. Это типично для тестирования мыши 3 - 4 раза за этот рефлекс.
  4. Оценка осанки и передвигаться. Мышей начинают показывать изменения в позе, что приводит к снижению или перетаскивания бедра во время передвигаться (Оценка 2,5). Далее заболеваний результаты в monoplegia, полный паралич одного задних конечностей (Оценка 3.0) и паралич, полный паралич обеих задних конечностей (Оценка 3.5). Умеренный quadraparesis, слабости всех четырех конечностей, приводит к очень медленное движение вперед (Оценка 4). Тяжелая quadraparesis позволяет почти не движение вперед (Оценка 4.5). Наконец, с тяжелой формой болезни они могут стать устаревшей или умереть (5 баллов).
  5. Администрирование для мышей, которые теряют способность приобретать жидкости или твердого пищи 1 мл 5% глюкозы в солевой и.п. Кроме того, использование добавок с жидкостью гель чашки, высокая калорийность гель и беконом мякишам противодействия обезвоживанию и лишение пищи. Усыпить умирающий мышей.

8. Подготовка тканей и гистологии

  1. анестезировать мышей с кетамина 100 мг/кг и 10 мг/кг Ксилазина, и затем прикрепить каждый зверолов к доске диссекции.
  2. Открыть до груди, подвергая сердце. Надрезать печени позволяют оттока крови. Прикрепите Бабочка иглы для труб miniflow переменной скорости насоса, используя отдельный резервуар для PBS и 10% формалина. Вставить иглу в левый желудочек сердца и perfuse с PBS, следуют 25 мл формалина 10% 5 мл.
  3. Удалить голову, а затем глаза. Процесс глаза и сетчатки, как описано выше 20. Вырезать через глазницы, вставить ножницы в нос и вырезать череп предшествовавшие задней на каждой стороне.
    1. Удалить черепа, разоблачить зрительных нервов, вырезать зрительных нервов и место в кассету между 2 амбушюры.
    2. Погрузиться в формалина 10% (24 h) и затем 50% этанола (24 ч) и затем передать 70% этанол.
  4. Мозга и позвоночника и переводить в формалина 10%. Серийно раздел мозги в корональных плоскости; шнуры раздел позвоночника в сагиттальной (около половины) и серийный корональный самолетов (примерно 20 разрезов на мышь).
  5. Процесс ЦНС образцы регулярно для встраивания парафина. Пятно 8 µm толщиной секций с гематоксилином и эозином (зрительных нервов) или Luxol быстро сине гематоксилином и эозином (головного и спинного мозга).
  6. Оценки зрительных нервов на наличие воспаления нервных и окружающие мозговых оболочек (неврит) или преимущественно в окружающих мозговых оболочек (оптика perineuritis).
  7. Количество менингеальные и Паренхиматозный воспалительных очагов (> 10 кластерных мононуклеаров) в мозг и спинной мозг образцов для каждой мыши.

9. В естественных условиях Сетчатки Imaging, оптическая когерентная томография (Окт)

Примечание: спектральной области октября сетчатки изображений мышей осуществляется с помощью торгового оборудования (например, Spectralis с TruTrack глаз tracker) для достижения последовательного окуляра ориентация и уменьшить артефакты движения.

  1. 5 мин до изображений, расширяются учеников с 1% Тропикамид (одной капли в глаз) и поместите мышь для записи образа в камере индукции анестезии, обеспечивая устойчивый поток 2 л / мин (1,5% изофлюрановая). Включите тепла мат и подготовить после анестезии восстановления Кейдж.
  2. Поместите курсор мыши на изображения цилиндра и перенаправление потока анестезии соответственно. Защитите глаза с 0,3% гидроксипропилметилцеллюлоза держать глаза влажные и обеспечить непрерывность рефракции. Место пользовательские контактные линзы на глаз быть расмотренным.
  3. Руководствуясь фундус инфракрасные изображения, прямой лазер для глаза, гарантируя луч центрируется на голове зрительного нерва. Вертикальных и горизонтальных проверок OCT должен подтвердить, что сетчатка лежит перпендикулярно к лазер.
  4. Выполнять 25 Б-сканов в режиме с высоким разрешением и растрировать с 30 в среднем А-сканов.
  5. После визуализации оба глаза, удалить контактные линзы и применять глазной гель. Оставьте мышь в клетке теплый восстановления.

10. Обработка и анализ OCT

  1. Используйте модульный изображений программное обеспечение для автоматической сегментации.
    1. Вручную правильных сегментов, соответствующая внутренняя пограничная мембрана (ILM) и внутренний сплетениевидный слой (IPL), представляющие пределы внутренней сетчатки слои (IRL) 21.
    2. Убедитесь, что слой сетчатки нервных волокон (RNFL) и слоя клеток ганглия (GCL) находятся в пределах IRL и не перекрываются.
  2. Вычислить IRL толщины с помощью раннего лечения диабетической исследование ретинопатии (ETDRS) 2 сетки с диаметром 1, 2 и 3 мм по центру диска зрительного нерва и экспорт в файл электронной таблицы. Программное обеспечение вычисляет толщина каждого слоя сетчатки, усреднение каждый сектор сетки. Таким образом, исключается Центральный сегмент, соответствующий руководитель зрительного нерва,.
  3. Анализ статистических различий между группами в каждый момент времени. Анализировать оба глаза для каждой мыши, используя обобщенные оценки уравнений матрицы сменные корреляции и корректировки для внутри предметные корреляции между глаз 21.

Результаты

В этом протоколе мы использовали клеток донора T от- / - мышей C57BL/6 AQP4. Подкожной иммунизации этих мышей с AQP4 p135-153 или p201-220, которые содержат болезнетворные клетки T epitopes, вызвали сильное пролиферативной Т-клеток ответов в сливной лимфатических узлов (рис. 1), в то время как эти два пептиды индуцированной гораздо слабее Т-клеток распространение в WT мышей. В сравнении, иммунизации с AQP4 p91-110, содержащий непатогенные AQP4 T клеток из определяющих13, или MOG p35-55, пептид миелин, который активирует Т-клеток, которые вызывают Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE)22,23 ,24, индуцированной аналогичные величины пролиферации Т-клеток в AQP4- / - и WT мышей. Анализ использования TCR потока цитометрии окрашивания для отдельных Vβ или Vβ семей, продемонстрировали, что p135-153 - и p201-220-специфических Т клеток от AQP4- / - мышей использовать уникальный репертуар TCR. Селективный гипер распространения AQP4 p135-153 и p201-220 в AQP4- / - мышей, а также уникальный TCR использования (рис. 2), указали, что патогенные Т-клеток ответов на эти факторы обычно регулируется тимуса отрицательный выбор, подчеркивая важность использования AQP4- / - клеток донора T в этом протоколе.

До приемных передачи для индукции ATCA лимфоузлов клетки от AQP4 пептид загрунтовать мышей были культивируемых in vitro в Th17 или Th1 поляризационный условиях в течение трех дней. Степень поляризации доноров CD4+ T клетки был подтвержден внутриклеточных цитокинов, окрашивание (ICS) и измеряется проточной цитометрии (рис. 3). Наивный получателей мышей были введены внутривенно с 2 x 107 доноров AQP4 пептид специфичные Т-клетки. После примерно шести дней почти 100% получателей мышей разработаны клинические признаки аутоиммунного заболевания ЦНС, включая хромать хвост и задних конечностей паралич (рис. 4). AQP4-специфических Т-клеток, Th17-поляризованных индуцированной более тяжелой болезни клинических чем Th1-поляризованных AQP4-специфических Т-клеток. Представитель мыши, что получил Th17 AQP4 пептид специфичные и разработали полный задних конечностей паралич (паралич) показано в видео 1. В отличие от мышей, которые разработали ЕАЕ после отправления MOG конкретных Th17 клеток получателей мышей оправился от клинического заболевания, вызванных Th17 AQP4-специфические клетки. Что касается ЕАЕ индуцированных MOG p35-55-специфичные Th17 клетки клинические заболевания, вызванного AQP4 p135-153-определенного или p201-220-специфичные Th17 клетки был связан с проникновением мононуклеарных клеток в ЦНС паренхимы и мозговые оболочки (рис. 5). Повреждения были более обильны в мозговых оболочек чем в паренхиме для аутоиммунных заболеваний ЦНС, индуцированных Th17 AQP4-специфические клетки.

Зрительного нерва участия был продемонстрирован гистологические оценки и последовательного Окт AQP4-конкретных и Th17 MOG конкретных клеток оба воспаление индуцированных зрительного нерва, который характеризовался наличием мононуклеарных клеток. Тогда как Th17 AQP4-специфические клетки вызвало оптические perineuritis, MOG конкретных Th17 клетки индуцированной тяжелой неврит (рис. 5). С помощью последовательного OCT, воспаление зрительного нерва проявляется путем Опухать и увеличена толщина внутренний слой сетчатки (IRL) для клинического заболевания, вызванного AQP4-конкретного или конкретных MOG Th17 клеток (рис. 6). Для AQP4 Th17-индуцированной ЦНС аутоиммунные заболевания, толщина IRL, вернулся в базовых мышей оправился от клинического заболевания. В противоположность этому сохранение ЕАЕ индуцированных MOG конкретных Th17 переписывался с IRL истончение и, как мы отмечали ранее,17, был связан с потерей клеток сетчатки ганглия.

figure-results-4349
Рисунок 1 : AQP4 p135-153 и p201-220 заручиться надежной T пролиферации в AQP4- / - мышей, но не WT мышей. Мышей были иммунизированы s.c. с указанной пептидов в CFA. Одиннадцать дней спустя, лимфатические узлы были удалены, а затем культивировали либо не антиген или с пептида, используемые для иммунизации. Распространения была измерена путем включения 3H-тимидина (среднее ± SEM, представитель 5 экспериментов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5155
Рисунок 2 : AQP4-специфических Т-клеток от AQP4- / - мышей использовать уникальный репертуар TCR. AQP4- / - и WT мышей были иммунизированы с указанной пептиды. Одиннадцать дней спустя, лимфатические узлы были удалены и культивируемых с пептида, используемые для иммунизации. Клетки были собраны. TCR Vβ использования был проанализирован проточной цитометрии (означает ± SEM, n = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5917
Рисунок 3 : Провоспалительных поляризации клеток донора AQP4-специфических Т. Одиннадцать дней после иммунизирования с AQP4 p135-153 или p201-220, лимфоузлов клетки были собраны и культивируемых с пептида, используемые для иммунизации в-поляризационные условия, поляризационный Th1 или Th17. Th17 или Th1 поляризации осмотрел ICS и потока цитометрии для Ил-17 или ИФН γ, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6661
Рисунок 4 : Th17-поляризованных AQP4-специфических Т-клетки вызывают паралич в WT получателей мышей. WT получателей мышей получил7 доноров AQP4 Th17-поляризованных p135-153 2 x 10 или p201-220-специфичные Т-клетки от AQP4- / - мышей. MOG специфичных Т-клеток, Th17-поляризованных служил в качестве позитивного элемента управления. Результаты являются представитель 8 экспериментов (n = 5/группа). * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-7489
Рисунок 5 : Th17 AQP4-специфические клетки вызывают воспаление opticospinal в мышах WT. Получателя мышей получил 2 x 107 Th17 AQP4 p135-153 - или p201-220-загрунтовать Th17 клеток донора от AQP4- / - мышей или Th17 мог p35-55-специфические клетки и были принесены в жертву 10 дней спустя. Спинного мозга и зрительного нерва тканей были подготовлены и витражи с H & E/LFB для оценки доказательств воспаления и демиелинизации, соответственно. Результаты являются представитель 5 мышей/группы. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-8381
Рисунок 6 : Воспаление зрительного нерва, индуцированных Th17 AQP4-специфические клетки может контролироваться продольной сетчатки октября WT получателей мышей получил 2 x 107 доноров AQP4 Th17-поляризованных p201-220-определенного или MOG p35-55-специфичные Т-клетки в день 0. Они были рассмотрены октября день 0 (до отправления Т-клеток) и затем на дни 4, 7, 8, 9-10, 11 14 и 21. IRL толщина был измеренных (среднее ± SEM). Статистика показывает сравнение с наивными управления. Результаты являются представитель 3 экспериментов (5 мышей/группа). * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

AQP4 была определена как основная цель в NMO-IgG в 2005 году3. Затем было признано, что было бы важно установить AQP4-ориентированные животной модели аутоиммунные заболевания ЦНС. Такая модель может быть полезным для изучения, как AQP4-специфических Т и Б клетки участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС и для проверки кандидата терапии NMO. Хотя определение Т-клеток AQP4-специфические epitopes в мышах одичал тип впервые сообщалось в 201013, Т-клетки, отвечая на те epitopes не вызывать клинических или гистологических болезни14,17. Неспособность создать модель аутоиммунные заболевания ЦНС, основанные на иммунной реактивности организма в AQP4 остается загадкой до 2015 года, когда Джонс, и др. 25 обнаружил, что доноров AQP4 p135-153-загрунтовать Т-клеток от AQP4- / - мышей были способны вызвать клинических и гистологические признаки аутоиммунные заболевания ЦНС в WT мышей. Интерес AQP4 p135-153 прогнозируется с высоким сродством17связывается MHC II (b-A). Только один другой AQP4 аминокислотной последовательности, 201-220, предсказал для привязки-Ab с аналогичными высоким сродством. Действительно мы наблюдали, что AQP4 p135-153 и p201-220 оба заручиться надежной распространения в AQP4- / -, но не WT, мышей. Здесь мы показали, как можно изолировать и расширять провоспалительные Th17 AQP4 p135-153 - и p201-220-реактивных Т-клеток от AQP4- / - мышей. При передаче в WT получателей мышей, AQP4-реактивный Th17 клеток донора вызванных паралич, который сопровождался мононуклеарных клеток инфильтратов в спинного мозга и зрительного нерва. Афферентные зрительной системы травмы хорошо известна в больных с AQP4-серопозитивными NMOSD26. Здесь мы наблюдали, что воспаление зрительного нерва, индуцированных AQP4-реактивной и MOG-реактивный Th17 клетки отличается. Тогда как Th17 AQP4-специфические клетки индуцированной оптические perineuritis, MOG конкретных Th17 клетки индуцированной тяжелой неврит. Также мы описали методы, используемые для мониторинга воспаление зрительного нерва, индуцированных AQP4-конкретные и MOG-специфических Т клетки серийный Окт. Другие исследователи теперь должны иметь возможность применять описанную здесь, для продвижения своих собственных исследований было сосредоточено на патогенетических механизмов ATCA протоколов.

Можно легко избежать три потенциальных pitfalls в нашей протокола. Во-первых, приемные передачи ATCA требует использования AQP4-специфических Т-клеток от AQP4- / - доноров мышей. В частности доноров WT AQP4 p135-153-специфических Т-клетки не вызывать ATCA получателей WT мышей. Во-вторых важно выполнить «вода тест» с капелькой пептида/CFA эмульсии до иммунизации AQP4- / - мышей (протокол шаг 1.5). Эмульсии не должен разогнать в воде, когда он подходит для инъекций s.c.. Если эмульсия расходится, следует еще раз перемешать эмульсии, холод снова и повторить тест воды. Наконец активированные доноров ЦНС антиген специфические Т-клетки вызывают аутоиммунные заболевания ЦНС более эффективно, чем отдыха Т-клеток. Один должен визуально проверить эти культуры под световой микроскоп до уборки Т-клеток донора для приемных передачи. Быстро делящиеся клетки могут образовывать кластеры, которые легко идентифицируются. Кроме того когда культур содержат много активированные Т-клеток, средства массовой информации могут переход от розовый, оранжевый или даже желтый, за счет снижения рН. Можно также оценить активации клеток донора загрунтовать AQP4 Лимфоузел T для распространения путем включения 3H-тимидина, как описано в шаге 3 протокола.

Наше открытие, что два патогенных AQP4 T клетки epitopes (1) прогнозируются связывать MHC II с высоким сродством и (2) вызывают мощные пролиферативной ответы в AQP4- / -, но не WT, мышей считают, что Т-клетки, ориентация этих факторов являются обычно под контролем тимуса негативный выбор17. TCR репертуарами, используемых для признания AQP4 p135-153 и p201-220 в AQP4- / - мышей являются уникальными (рисунок 2), которая согласуется с клоновых удаления опосредовано тимуса медуллярного эпителиальных клеток. Другие механизмы tolerogenic обычно может сдерживать иммунные реакции на AQP4. После нашего первоначального доклада17другая группа также продемонстрировал, что AQP4 p201-220 содержит провоспалительные Т-клеток определяющим27. Когда α/β (TCRα- / -) Т клеток недостаточным мышей были воссоздана с AQP4- / - CD4+ T клетки, можно было добиться ответа провоспалительные AQP4-специфических Т-клеток, но не AQP4-конкретных гуморальный ответ, подразумевая, что в WT мышей AQP4-специфические клетки B ответы, похож на AQP4-специфических Т-клеток ответов, подлежат негативный выбор. Действительно потеря спинного аксонов и РГК, который не наблюдался в WT мышей с ATCA, индуцированных AQP4-специфических Т-клетки только, может потребовать участия патогенных AQP4-специфических антител. Ясно, что мыши модели AQP4-ориентированных ЦНС аутоиммунитета будет продолжать развиваться, как мы узнаем больше относительно механизмов tolerogenic, обычно управление AQP4-специфических Т-клеток и B клеток иммунитета.

Другие модели AQP4-ориентированных ЦНС аутоиммунитета также подвергаются развитых6,16,28,29,30. Каждый из них может предложить преимущества для изучения конкретных аспектов, которые имеют отношение к патогенезу NMO. AQP4-специфичные Т-клетки были определены в WT-крысы-6,-16,-29. Те AQP4-специфических Т-клетки вызвало гистологических изменений аутоиммунные заболевания ЦНС, но аналогичные замечания в мышей, WT крыса AQP4-специфических Т-клетки не вызывают существенных признаков клинического заболевания. Таким образом механизмы терпимости, ограничивая Т-клеток и клеток B AQP4-специфических иммунных реакций в WT мышей также функционируют в крыс. Несмотря на это не следует недооценивать власть в использовании мыши модели для изучения механизмов, участвующих в патогенезе заболевания. Богатство нокаут, трансгенных и репортер мышей может быть выгодным. Следует также признать, что несколько фундаментальных открытий в аутоиммунных заболеваний были сделаны с помощью мыши ЕАЕ модели. Например, демонстрация, что Т-клеток клоны специфических для себя антиген может посредничать Аутоиммунные болезни31,32, выявление роли костимуляции Т-клеток в аутоиммунных заболеваний33 и открытие путь развития для Th17 дифференциация34 были впервые описаны с помощью мыши ЕАЕ моделей. С помощью мыши модель ATCA, которую мы разработали, один теперь имеет средства для изучения развития и регулирования патогенных AQP4-специфических иммунных реакций в естественных условиях, которые должны обеспечить важные идеи, связанные с NMO патогенеза.

Раскрытие информации

С.а. Саган, а. Крус-Эрранс Касадо, к.м. Спенсер, п.п. Хо, L. Штейнман, A.J. зеленый и Sobel р.а. сообщать без информации. Zamvil с.с., заместитель главного редактора по неврологии, нейроиммунология и Neuroinflammation и является членом Консультативного Совета для международного общества нейроиммунология. Он был членом редакционной коллегии Журнала клинического расследования, Журнал иммунологии и Журнал неврологических науки был членом Хартии Грант Комитета по рассмотрению национальных институтов Клинические нейроиммунология здравоохранения (НИЗ) и опухоли головного мозга (CNBT) изучите раздел и национальное общество рассеянного склероза (НМС). Он работал в качестве консультанта и полученных гонораров от Biogen Idec, EMD Сероно, компания Джензайм, Новартис, Рош/Genentech и Teva Pharmaceuticals, Inc. и служил или служит на досках мониторинг данных безопасности для Lilly, BioMS, Teva и Opexa Therapeutics. В настоящее время д-р Zamvil получает грант поддержки исследований от НИЗ, НМС, Мезен фонд, Biogen и Селген.

Благодарности

Была оказана поддержка для S.S.Z., Национальный институт здравоохранения (RO1 AI073737 и RO1 NS092835-01), Национальное общество рассеянного склероза (RG 4768, 5179 РГ и RG 5180), Мезен фонд и Guthy Джексон благотворительного фонда.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
M. tuberculosis H37RaBD Difco231141Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's AdjuvantBD Difco263910
AQP4 peptide p135-153GenemedCustom SynthesisPeptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220GenemedCustom SynthesisPeptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55Genemed / AuspepCustom SynthesisPeptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way StopcockKimble420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized)GE Healthcare Life SciencesSH30071
Recombinant Mouse IL-23R&D Systems (BioTechne)1887-ML
Recombinant Mouse IL-6R&D Systems (BioTechne)406-ML
Recombinant Mouse IL-12R&D Systems (BioTechne)419-ML
Thymidine [Methyl-3H]PerkinElmerNET027
Glass Fiber FiltermatsPerkinElmer1450-421
Anti-mouse antibodieseBioscience (Affymetrix)[various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening PanelBD Biosciences557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell StainThermoFisher Scientific[various]
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlugBD Biosciences555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-AldrichP8139
Iomomycin (calcium salt)Sigma-AldrichI0634
Pertussis Toxin from B. pertussisList Biological Laboratories181
10% FormalinVWR89370-094
Variable-Flow Peristaltic PumpFisher Scientific13-876-2
Foam Biopsy Pads, RectangularFisher Scientific22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP)Henry Schein Animal Health050033NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)AkornNDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging PlatformHeidelberg Engineering

Ссылки

  1. Hardy, T. A., et al. Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS. Lancet Neurol. 15 (9), 967-981 (2016).
  2. Lennon, V. A., et al. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet. 364 (9451), 2106-2112 (2004).
  3. Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel. J Exp Med. 202 (4), 473-477 (2005).
  4. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), 62 (2015).
  5. Bennett, J. L., et al. Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica. Ann Neurol. 66 (5), 617-629 (2009).
  6. Bradl, M., et al. Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo. Ann Neurol. 66 (5), 630-643 (2009).
  7. Nurieva, R. I., Chung, Y. Understanding the development and function of T follicular helper cells. Cell Mol Immunol. 7 (3), 190-197 (2010).
  8. Lucchinetti, C. F., et al. The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica. Brain Pathol. 24 (1), 83-97 (2014).
  9. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (4), 110 (2015).
  10. Brum, D. G., et al. HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis. Mult Scler. 16 (1), 21-29 (2010).
  11. Varrin-Doyer, M., et al. Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter. Ann Neurol. 72 (1), 53-64 (2012).
  12. Vaknin-Dembinsky, A., et al. T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO). Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).
  13. Nelson, P. A., et al. Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica. PLoS One. 5 (11), 15050 (2010).
  14. Kalluri, S. R., et al. Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica. PLoS One. 6 (1), 16083 (2011).
  15. Pohl, M., et al. Pathogenic T cell responses against aquaporin 4. Acta Neuropathol. 122 (1), 21-34 (2011).
  16. Zeka, B., et al. Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS. Acta Neuropathol. 130 (6), 783-798 (2015).
  17. Sagan, S. A., et al. Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (51), 14781-14786 (2016).
  18. Vita, R., et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 43, 405-412 (2015).
  19. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  20. Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry. J Vis Exp. (82), e51018 (2013).
  21. Cruz-Herranz, A., et al. The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies. Neurology. 86 (24), 2303-2309 (2016).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur J Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).
  23. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
  24. Molnarfi, N., et al. MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med. 210 (13), 2921-2937 (2013).
  25. Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica. Acta Neuropathol Commun. 3, 28 (2015).
  26. Oertel, F. C., et al. Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD. Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72 (2017).
  27. Vogel, A. L., et al. Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice. Eur J Immunol. , (2017).
  28. Zhang, H., Verkman, A. S. Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59. J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).
  29. Zeka, B., et al. Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 82 (2016).
  30. Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G. J Neuroinflammation. 13 (1), 275 (2016).
  31. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
  32. Zamvil, S. S., et al. Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition. J Exp Med. 162 (6), 2107-2124 (1985).
  33. Kuchroo, V. K., et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy. Cell. 80 (5), 707-718 (1995).
  34. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

126optica4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены