Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir paralisia e opticospinal inflamação por transferência da aquaporina 4 (AQP4)-células T específicas de AQP4^{- / -} ratos em camundongos WT. Além disso, demonstramos como usar a tomografia de coerência óptica serial para monitorar a disfunção do sistema visual.

Resumo

Enquanto é reconhecido que aquaporina-4 (AQP4)-células T e anticorpos específicos participarem na patogênese da Neuromielite Óptica (NMO), uma doença desmielinizante autoimune do sistema nervoso central humano (CNS), a criação de um modelo AQP4-alvo com ambos manifestações clínicas e histológicas de auto-imunidade CNS provou-se um desafio. Imunização de camundongos (WT) de tipo selvagem com peptídeos AQP4 suscitou a proliferação de células T, embora essas células T não poderiam transferir a doença aos ratos destinatário ingênuo. Recentemente, dois romance epitopos de célula T AQP4, peptídeo (p) 135-153 p201-220, foram identificadas e quando estudar respostas imunes para AQP4 em camundongos deficientes em AQP4 (AQP4^{- / -}), sugerindo a reatividade de células T para estes resumos é normalmente controlado pelo tímicos seleção negativa. AQP4^{- / -} Th17 polarizadas células T aprontadas para paralisia induzida p135-153 ou p201-220 em destinatários camundongos WT, que foi associada predominantemente leptomeníngeo inflamação da medula espinhal e nervos ópticos. Nervos ópticos circundantes de inflamação e envolvimento das camadas internas da retina (IRL) foram manifestados por alterações na tomografia de coerência óptica serial (OCT). Aqui, podemos ilustrar as abordagens usadas para criar este modelo novo na vivo de auto-imunidade CNS AQP4-alvo (ATCA), que agora pode ser empregada para estudar os mecanismos que permitem o desenvolvimento de patogénicos específicos AQP4 T células e como eles podem cooperar com B células na patogênese OMN.

Introdução

Neuromielite Óptica (NMO) é uma sistema nervoso central (SNC) inflamatória desmielinizante doença auto-imune que provoca episódios recorrentes de paralisia e perda visual, levando a incapacidade neurológica permanente¹. NMO é atualmente considerada principalmente uma doença auto-imune humoral² está associada com anticorpos (Igs) segmentação aquaporina 4 (AQP4), um canal de água abundantemente expressado em astrócitos^3,4. No entanto, inflamação do CNS é um pré-requisito para a entrada de CNS de AQP4 Ig^5,6. Assim, não foi possível estabelecer um modelo de NMO por transferência de anti-AQP4 Igs sozinho. As conclusões que (1) patogénicos específicos AQP4 Igs em pacientes OMN são IgG1^1,2, um Ig de célula T-dependente subclasse⁷ (2) T células são identificadas no OMN lesões^8,9 (3) NMO é associado com determinados genes MHC II (por exemplo, HLA-DR17 (DRB1 * 0301))¹⁰e (4) proinflammatory DR AQP4-reativa-restrito Th17 células são expandidas no OMN pacientes^11,12 todos indicam que células T AQP4 específicos têm um papel fundamental na patogênese da OMN. Assim, é importante desenvolver modelos animais para determinar como as células T específicas AQP4 poderão contribuir para a patogênese OMN.

Há vários anos, múltiplos epitopos de célula T AQP4 foram identificados no selvagem-tipo (WT) ratos^13,14 e ratos¹⁵. Enquanto observou-se que as células T reativas-AQP4 podem induzir inflamação opticospinal em ingênuo ratos destinatário^15,16, significativos sinais clínicos de doença do CNS não foram observados. Da mesma forma, direcionar a imunização de camundongos WT com peptídeos contendo AQP4 T célula epitopos^14,17, ou transferência de células proinflammatory T alvejando aqueles determinantes¹⁷, não causar sinais clínicos ou histológicos evidências de auto-imunidade CNS.

Recentemente, ele observou-a imunização de camundongos C57BL/6 AQP4 deficiente (AQP4^{- / -}) com AQP4 peptídeo (p) 135-153 ou p201-220, dois determinantes previstos para vincular MHC II (-A^b) com alta afinidade¹⁸, suscitou forte CD4 ⁺ De respostas de células T¹⁷. Em contrapartida, estes dois peptídeos suscitou apenas modestas respostas proliferativas em camundongos WT. Além disso, o repertório de células T do receptor (TCR) usado para reconhecimento destes determinantes por pilhas de T do AQP4^{- / -} ratos era único. Coletivamente, esses achados indicam que células T reconhecimento das AQP4 é regulamentado pela seleção negativa do timo. AQP4 p135-153-p201-220-específico ou células Th17 de ratos de doador^{- / -} AQP4 induzida por paralisia em quase 100% dos ratos WT destinatários ingênuo; Isto foi associado com opticospinal infiltrados de células T, células B e monócitos. Serial opticospinal tomografia de coerência (OCT) demonstrou o envolvimento do sistema visual dinâmico. Ratos com autoimunidade mediada por células T CNS AQP4-alvo (ATCA) recuperaram de paralisia e lesão do sistema visual. Em contraste com a EAE induzida pela mielina oligodendrocyte glicoproteína (MOG) p35-55-T células específicas, que levaram à doença clínica persistente, ATCA induzida por células T sozinhos não esteve associada a perda axonal ou redução nas células ganglionares da retina (RGCs). Nossos resultados demonstraram claramente que existem múltiplos determinantes de célula T AQP4 patogénicos. Este novo modelo de ATCA é útil para estudar os mecanismos para controlar o desenvolvimento de patogénicos específicos AQP4 T células, aprendendo como essas células induzem inflamação CNS e como eles podem cooperar com células específicas AQP4 B e anticorpos para promover a patogênese OMN .

No presente relatório, nós descrevemos os protocolos usados para induzir e avaliar ATCA induzida por células T. Começamos com as técnicas utilizadas para imunização, cultura de células T e Th17 polarização para gerar patogénicos específicos AQP4 T células, análise de citometria de fluxo para confirmar a polarização e transferência adoptiva essas células T. Em seguida descreveremos métodos utilizados para avaliação clínica e histológica da doença e o uso da OCT serial para monitorar a lesão do sistema visual em ratos do destinatários.

Protocolo

animais todos os procedimentos foram realizados em conformidade com orientações experimentais aprovadas pela Universidade da Califórnia, cuidado Animal institucional do São Francisco e Comitê de uso. Ratos fêmeas C57Bl/6 (H-2 ^b), 8 semanas de idade, foram comprados e C57BL/6 AQP4 ^{- / -} ratos foram fornecidos pelo r. Verkman.

1. imunização de camundongos com peptídeos AQP4

1. preparar Freund completo ' estoque de trabalho adjuvante (CFA) s.
   1. Moer finamente ralada preparação de M. tuberculosis (H37Ra) usando um almofariz e um pilão.
   2. Adicionar à terra H37Ra de Freund incompleto ' adjuvante de s para uma concentração final de 4 mg/mL. CFA pode ser armazenada a 4 ° C por até 6 meses.
2. Dissolver liofilizado do peptide AQP4 de antígeno (Ag) em solução salina tamponada fosfato (PBS) para uma concentração final de 1 mg/mL. Manter a 4 ° C ou em gelo
3. Preparar a montagem de 2 seringas luer-lock, juntou-se com uma torneira de passagem, que contém a emulsão CFA/peptídeo.
   1. Anexar uma seringa de vidro luer-lock sem êmbolo para uma torneira de 3 vias nylon com 2 conexões luer-lock macho. Feche a torneira, comutando a alavanca para a seringa. Posicione a extremidade aberta da seringa acima, permitindo que a seringa atuar como um tubo de ensaio. Coloque isso em uma cremalheira do tubo para aumentar a estabilidade.
   Estoque de trabalho
   2. vortex o CFA e a solução de Ag. Adicionar um volume de 1:1 do peptídeo / CFA na seringa aberta. 200 µ l de CFA/Ag (4 x 50 µ l) é necessária por rato.
      Nota: Normalmente, cerca de 1 mL da preparação é perdida na torneira, o que reduzirá o montante disponível para a imunização. Portanto, é importante incorporar isto no cálculo do volume total exigido.
      Exemplo: para a imunização de 5 ratos: (200 animais µ l/animal x 5) + 1 mL volume extra = 2 mL CFA/Ag total necessário.
   3. Inserir o êmbolo de vidro para a seringa e, mantendo-a no lugar, inverter a seringa para que a torneira está orientada para cima. Mude a alavanca da torneira para a conexão fêmea não utilizado. Cuidadosamente, aplica pressão para o êmbolo de vidro para remover o excesso de ar da seringa. O líquido preenche a segunda conexão luer-lock macho de torneira a.
   4. Anexar uma segunda seringa de vidro (êmbolo totalmente inserido) para a segunda conexão luer-lock macho da torneira. Este deve ser um sistema fechado de 2 seringas de vidro conectado com uma torneira de passagem contendo como pouco excesso de ar possível.
   Mix de
   5. para criar uma emulsão, empurrando os êmbolos para passar o líquido alternadamente entre as 2 seringas para aproximadamente 2 min. Chill repetir as seringas no gelo durante cerca de 10 min. a refrigeração e misturar até que haja uma clara mudança na viscosidade da preparação , resultando em uma emulsão branca, muito dura. Refrigerar as seringas contendo a emulsão a 4 ° C ou manter no gelo
4. Transferir todos da emulsão para seringa luer-lock de um vidro, remova a seringa de vidro vazio e substituí-lo com uma seringa de 1 mL luer-lock para injeção. Encha a seringa nova com emulsão, retire a torneira e anexar uma agulha (25 x 5/8).
5. " água-teste " a emulsão para a consistência. Expulse uma gota da emulsão em um pequeno prato de água. A emulsão não deve dispersar, indicando que é apropriado para a injeção.
   1. Se a emulsão dispersa, não está pronta para a injeção; transferência o líquido de volta no copo de seringas e continue a misturar e em seguida relaxar novamente até que a emulsão é dura.
   2. Testar a emulsão novamente até a consistência apropriada tenha sido alcançada.
6. Injetar camundongos de doador AQP4 ^{- / -}, por via subcutânea (s.c.) com emulsão contendo o peptídeo AQP4. Cada rato recebe injeções de s.c. 4 x 50 µ l (200 µ l total (100 µ g de peptídeo)). Os 4 sites incluem ambos os lados da parte inferior do abdome, que drenam para os linfonodos inguinais (LN), e ambos os lados da parede torácica medial para cada axila, que desaguam LN. axilar A transferência adotiva exigirá ratos imunizados doador de 1-2 por destinatário do mouse.

2. Polarização de células de cultura de células T e Proinflammatory T

1. 10-12 dias após a imunização, coletamos os ratos LN.
   1. Em uma bandeja de gelo, preparar pratos de Petri 60mm equipado com um filtro de célula (malha tamanho 70 µm) e que contém a mídia RPMI refrigeradas com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e estreptomicina de penicilina-100 µ g/mL 100 U/mL (pen-estreptococos) (RFPS).
   2. Euthanize ratos por exposição ao CO ₂, seguido por deslocamento cervical. Mergulhe os ratos em etanol a 70% e em seguida fixar cada pata para um tabuleiro de dissecação.
   3. Cortar uma incisão de pele da virilha, no pescoço e embaixo de cada perna. Puxe a pele longe do peritônio e fixá-lo esticada à diretoria. Dissecar LN inguinal e axilar e colocar o prato de Petri contendo RFPS, no gelo. ¹⁹
   4. para experiências de transferência adotiva, combine o LN de todos os animais dentro do mesmo grupo de imunização. Para análises de fluxo cytometric do uso Vβ, separe LN animais individuais.
2. Coloque o filtro de célula que contém a FLN um tubo de centrífuga de 50 mL contendo RFPS. Use a extremidade achatada de um êmbolo da seringa 5ml estéril para pressionar as células LN através do filtro, lavando com 20-30 mL de RFPS para facilitar a recuperação das células. Manter as células LN no gelo durante todo o processamento até o momento para a cultura.
3. Lavar duas vezes, centrifugação a 393 x g por 5 min. Após a segunda lavagem, Ressuspender as células LN em células T media (TCM). TCM contém RPMI com 10% inactivadas pelo calor FBS, 292 µ g/mL L-glutamina, 110 piruvato de sódio µ g/mL e 55 µM 2-Mercaptoetanol e caneta-estreptococos. Normalmente, um volume de 5 mL TCM por rato doador é usado.
4. Contar as células de LN. Rendimento esperado é de aproximadamente 3-6 x 10 células de ⁷ LN por doador rato imunizado. Reserve 3-4 x 10 ⁶ para um ensaio de proliferação (consulte a seção 3 abaixo).
5. Configurar polarizador culturas para transferência adotiva (secção 6).
   1. Preparar uma cultura de Th17 polarizador de 5 x 10 ⁶ LN células por mL com 10 µ g/mL Ag, 20 ng/mL do mouse recombinante interleucina (IL) -23 e IL-6 no TCM de mouse de 10 recombinante ng/mL.
   2. Como alternativa, para a polarização Th1, preparar uma cultura de 5 x 10 ⁶ LN células por mL com 10 µ g/mL Ag e recombinante de ng/mL 10 mouse IL-12 na TCM.
   3. Adicionar 2 mL (1 x 10 ⁷ células) por poço da mistura de cultura de polarização em uma placa de 12. As células de LN de 2-4 ratos de doador preencherá uma placa de 12. Manter as culturas em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO ₂ por 72 h.
   4. Verifique visualmente as células LN na cultura para ativação em 48 h e 72 h. Activated células formarão extensivos aglomerados e as células T vão aumentar de tamanho, tornando-se mais pleomórfico. O aumento do metabolismo causará uma redução do pH na mídia, mudando de pêssego, a laranja. Se o pH estiver baixo o suficiente para transformar a mídia amarelo, adicionar 1 mL de TCM fresco para evitar toxicidade para as células no restante 24 h.
   5. Prosseguir com a secção 6 para transferência adotiva. Eficiência de polarização pode ser verificada por citocinas intracelulares (ICS), a coloração como described na seção 5.
6. Configurar culturas usando LN de ratos individuais para análise de fluxo cytometric de superfície expressão Vβ (secção 4).
   1. Preparar 5 x 10 ⁶ células LN / mL com 10 µ g/mL Ag em TCM.
   Adicionar 2 mL (1 x 10 ⁷ células) da cultura por bem em uma placa de 12 de
   2. . As culturas devem ser mantidas em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO ₂ por 10 dias. Prossiga para a secção 4.

3. Ensaio de proliferação

Nota: isto continua a partir do ponto 2.4.

1. Preparar 3-4 mL de células LN em um tubo, em 2 x 10 ⁶ células / mL no TCM.
2. Misture suavemente as células por inversão do tubo várias vezes e depois transferir para um cavado estéril.
Placa de cultura de tecidos de fundo
3. usar uma pipeta multicanal para placa, 100 µ l de células por poço em uma rodada de 96 poços. Normalmente, placa 15 poços para testar três vias 4 concentrações de Ag e nenhuma referência Ag.
4. Diluir o Ag no TCM em várias concentrações, normalmente 80, 20, 5, 1 e 0 µ g/mL (para 2 unidades populacionais de x). Adicione 100 µ l de cada concentração em triplicado para uma concentração final de 40, 10, 2.5. 0,5 e 0 µ g/mL. Incubar durante aproximadamente 72 h a 37 ° C.
   Nota: etapas 3.5 através de 3.7 envolvem materiais radioativos. O uso correto, monitoramento e eliminação de materiais radioativos devem ser conduzidas, de acordo com regulamentos governamentais e institucionais.
5. Prepare uma solução stock de trabalho de ³ H-timidina (40 µCi/mL) por adição 1 mCi ³ H-timidina a 25 mL RPMI e guardá-lo em 4 ° C. Pipetar 0,5 mL da solução de trabalho para uma calha estéril.
6. Adicionar 25 µ l de ³ H-timidina (1 µCi) por bem, usando uma pipeta multicanal. Incubar durante um adicional 18 h a 37 ° C.
7. Colheita de células para uma esteira de filtro de vidro usando uma colhedora de célula de 96 poços e enxágue com etanol a 70%. Após a secagem, sele a filtro esteira em um saco plástico amostra de líquido de cintilação de 5 mL. Radioactividade de medida em cada poço usando um contador do scintillation.

4. Fluxo Cytometry Analysis para célula superfície TCR Vβ expressão

Nota: isto continua da seção 2.6. Anticorpos para mouse TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 e 5.2, 6, 7, 8.1 e 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14 e 17a estão disponíveis comercialmente para testar a expressão TCR Vβ.

1. Para detecção de TCR Vβ, desalojar as células T da placa de cultura pipetando várias vezes e transferir as células para um tubo de.
2. Lavar com tampão de FACS (FB) contendo 2% FBS, 0,1% de azida de sódio e 2 mM EDTA em PBS.
3. Células de transferência para uma placa de 96 V-fundo em uma densidade de 1 x 10 ⁵ 3 x 10 ⁶ células por poço. Se o painel inteiro de Vβ está sendo testado, as células devem ser distribuídas em vários poços (um bem por Vβ sendo testado).
4. Excluir células mortas de análise de fluxo cytometric manchando com uma tintura de viabilidade ao vivo/morto, que reage com aminas livre expostas por células necróticas. Siga o fabricante ' instruções de s para centrifugação e ressuspensão em tintura de viabilidade. Incubar no gelo por 10-20 min. em toda a pilha que mancha os procedimentos, proteger as células de luz e manter em gelo
5. Após a incubação, lavar a placa uma vez no FB. Para detectar TCR Vβ, suspender as células em 100 µ l de FB contendo uma diluição de 1: 100 de anticorpos para CD4 (clone RM4-5) e TCR Vβ. Incube por 15-60 min no gelo
6. Lavar a placa uma vez no FB e corrigir as células, adicionando-se 200 µ l de paraformaldeído 4%, diluído em PBS. Incube durante 20 min no gelo. Lavar a placa no FB e analisar por citometria de fluxo.

5. Fluxo Cytometric Analysis para a produção de citocinas intracelulares

1. de citocinas intracelulares coloração (ICS), tratar a culturas de células T com uma diluição de 1:1,000 do reagente de inibidor de transporte de proteínas (por exemplo, GolgiPlug) em TCM, 4h antes da ICS para evitar secreção de citocinas. Naquele tempo, ativar as células T com 50 ng/mL phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) e 500 ng/mL ionomycin fim de induzir a produção de proteína.
2. Após 4 h de cultura a 37 ° C, desalojar as células da placa de cultura pipetando para cima e para baixo e transfira para um tubo de centrífuga (15 ou 50 mL).
3. Lavagem com FB. Ressuspender as células em FB e transferir para uma placa de 96 V-fundo em uma densidade de 5 x 10 ⁵ 3 x 10 ⁶ células por alvéolo.
4. Células de mancha com tintura de viabilidade como descrito acima (seção 4.2). Após a incubação, lavar a placa uma vez no FB.
5. Adicionar anticorpos para a deteção de marcadores de superfície como segue:
   1. para detecção de marcadores de superfície, suspender as células em 100 µ l de FB contendo uma diluição de 1: 100 de anticorpo para CD4 (clone RM4-5).
   2. , Opcionalmente, incluir anticorpos para B220 (clone 30-F11) e CD11b (clone M1/70) a uma diluição de 1: 100 para melhorar a retenção de células B e monócitos/macrófagos, respectivamente. Geralmente, PE-Cy7 anti-CD4, FITC anti-B220 e PerCP-Cy5.5 anti-CD11b funcionam bem. Escolha de anticorpo/fluorocromo conjugados deve ser guiada pela configuração de citômetro de fluxo a ser usado para análise e optimal concentrações de anticorpos devem ser determinadas empiricamente.
   3. Incube por 15-60 min na Ice.
6. Lavar a placa com FB e ressuspender as células em 200 µ l de solução de fixação/permeabilização por 20 min no gelo. Isto irá corrigir as células e permeabilize as membranas.
7. a fim de manter a permeabilização de membranas celulares durante a coloracao intracelular, use o tampão de lavagem/Perm (PW) (diluídos 01:10 do estoque X 10) em vez de FB. Lavar os poços em 200 µ l de PW.
8. Para ICS, preparar uma diluição de 1: 100 de anticorpos para o interferon (IFN)-γ e IL-17A usando 1 x PW. Uma opção é APC anti-IFN-γ (clone XMG1.2) e PE anti-IL-17A (clone eBio17B7) que funciona bem. Ressuspender as células em 100 µ l do anticorpo intracelular cocktail e então incubar durante pelo menos 15 min. Também é possível continuar a coloração durante a noite a 4 ° C.
9. Lavar os poços em 200 µ l de PW e ressuspensão em FB por citometria de fluxo.
10. Em paralelo, preparar uma amostra imaculada (células no FB sem anticorpos) para otimizar o detector tensões e single-manchado de amostras para cada fluorocromo individual (isto é, células ou grânulos de compensação manchados com apenas um anticorpo/fluorocromo) para determinar valores de compensação spillover.
11. Usando um citômetro de fluxo, adquirir ≥ 10.000 células (eventos), gating no viável CD4 (LIVE/mortos-negativo) ⁺ células. Para garantir a exata gating de células T, excluir o B220 ⁺ e CD11b ⁺ células (células B e monócitos/macrófagos, respectivamente). Dentro o CD4 ⁺ T subpopulação de células, determinar a percentagem de células expressando IFN-γ (linhagem Th1) ou IL-17A (linhagem Th17).

6. Adotivos transferência de patogénicos específicos AQP4 T células

Nota: esta etapa segue de secção 2.5: célula T cultura e proinflammatory polarização de célula T.

1. Células recover polarizado 12-poço chapas por pipetagem para cima e para baixo para desalojar e transferir para um tubo de 50 mL. Maintain no gelo até injeções.
2. Contar as células, lave duas vezes com PBS frio e preparar uma suspensão de 1 x 10 ⁸ células/mL de PBS. Geralmente, injetar as células dentro de uma hora.
3. , Delicadamente, misturar as células agitando e transferir para uma seringa de 1 mL, no momento da injeção. Administrar 200 µ l de células (2 x 10 ⁷) por via intravenosa (IV) para cada mouse, através da cauda veia.
4. Injetar cada destinatário rato i.p. com 200 ng da b. pertussis toxina diluída em 200 µ l de PBS naquele dia e 2 dias depois. Monitorar os ratos diariamente para sinais de doença clínica.

7. Avaliação clínica de ATCA

1. Examine destinatários ratos diariamente para sinais clínicos de auto-imunidade CNS. Em geral, os ratos mostrará sinais de auto-imunidade CNS 5-8 dias após transferência adotiva de células T específicas AQP4. Os ratos mostrará sintomas clínicos de disfunção neurológica. É útil realizar as avaliações em um ingênuo rato para definir a capacidade normal de um rato.
Tom
2. ratos de avaliar a perda da cauda. Mantenha os ratos suavemente na base da cauda e levantar na vertical. Uma cauda que inclina-se continuamente é descrita como a perda da cauda o Tom (Nota 1). Perda do tônus da cauda é frequentemente o primeiro sinal da doença clínica.
Reflexo
3. teste para corrigir colocando o mouse em suas costas sobre uma superfície plana. Corrigindo lento é um sinal de incoordenação do tronco (Pontuação de 2). Um ingênuo rato completamente vai resistir a qualquer tentativa de colocá-lo em suas costas, então qualquer lentidão na capacidade de direito é marcado como uma disfunção. É típico para testar o mouse 3 - 4 vezes para este reflexo.
4. Avaliar a postura e deambulação. Os ratos começam a mostrar uma mudança na postura, resultando em uma redução ou arrastando do quadril durante a deambulação (Pontuação de 2.5). Mais resultados de doença em monoplegia, paralisia completa de um hind de um membro (Pontuação de 3.0) e paraplegia, paralisia completa de ambos os hind dos Membros (Pontuação de 3.5). Quadraparesis moderada, fraqueza dos quatro membros, resulta em movimento muito lento (Pontuação dos 4). Quadraparesis grave não permite quase nenhum movimento (Pontuação de 4,5). Finalmente, com doença grave podem tornar-se moribundo ou morrer (Pontuação de 5).
5. Administrar aos ratos que perdem a capacidade de adquirir alimentos líquidos ou sólidos 1 mL de glicose 5% em salina i.p. Alternativamente, uso de suplementação com fluido de gel copos, alta calóricas softies gel e toucinho para contrariar a desidratação e privação de comida. Eutanásia em ratos moribundos.

8. Preparação do tecido e histologia

1. anestesiar ratos com 100 mg/kg de ketamina e xilazina 10 mg/kg, e em seguida fixar cada pata para um tabuleiro de dissecação.
2. Abrir o peito, expondo o coração. Faça uma incisão do fígado para permitir a saída do sangue. Anexe uma agulha borboleta para a tubulação de uma bomba de velocidade variável miniflow usando um reservatório separado para PBS e 10% de formol. Insira a agulha no ventrículo esquerdo do coração e perfundir com 5 mL de PBS, seguido de 25 mL de formol a 10%.
3. Remove a cabeça e, em seguida, os olhos. Olhos de processo e retinas conforme descrito anteriormente, ²⁰. Atravessam as órbitas, insira uma tesoura no nariz e cortar o crânio anterior posterior de cada lado.
   1. Remover o crânio, expor os nervos ópticos, cortar o quiasma óptico e coloque em uma gaveta entre 2 almofadas de espuma.
   2. Mergulhar em formol a 10% (24 h) e então 50% de etanol (24h) e depois transferência para etanol a 70%.
4. Remover o cérebro e coluna vertebral e coloque em formalina 10%. Serialmente seção cérebros no plano coronal; cabos de secção espinhal em sagital (aproximadamente metade) e coronal serial aviões (aproximadamente 20 seções cruzadas por rato).
5. Amostras de processo CNS rotineiramente para a incorporação de parafina. Mancha de 8 µm de espessura seções com hematoxilina e eosina (nervo óptico) ou Luxol fast blue-hematoxilina e eosina (cérebro e medula espinhal).
6. Avaliar o nervo óptico para a presença de inflamação dentro do nervo e meninges circundantes (neurite óptica) ou predominantemente em meninges circundantes (óptica perineuritis).
7. Contar meníngeos e parenquimatosos focos inflamatórios (> 10 células mononucleares clusterizadas) nas amostras de cérebro e medula espinhal para cada mouse.

9. Na Vivo Retinal Imaging por tomografia de coerência óptica (OCT)

Nota: imagem latente retinal OCT domínio espectral dos ratos é executada usando equipamento comercial (por exemplo, Spectralis com TruTrack tracker do olho) para atingir a ocular consistente orientação e reduzir artefatos de movimento.

1. 5 min antes da imagem latente, dilatar as pupilas com tropicamida 1% (uma gota por olho) e coloque o mouse para ser fotografada na câmara de indução de anestesia, fornecendo um fluxo constante de 2 litros por minuto (1,5% de isoflurano). Vire na esteira de calor e preparar a gaiola de recuperação pós-anestesia.
2. Coloque o mouse sobre o cilindro de imagem e redirecionar o fluxo de anestesia em conformidade. Protege os olhos com metilcelulose hidroxipropil de 0,3% para manter o olho úmido e assegurar a continuidade de refração. Coloque uma lente de contato personalizada no olho a ser examinado.
3. Guiado pela imagem do fundo de infravermelho, direcionar o laser aos olhos, garantindo que o feixe é centrado sobre a cabeça do nervo óptico. Vertical e horizontal OCT deve confirmar que a retina apresenta o perpendicular ao laser.
4. B 25 executar scans em modo de alta resolução e rasterização de 30 em média A-Scans.
5. Após a imagem de ambos os olhos, remover a lente de contato e aplicar o gel oftálmico. Deixar o rato na gaiola recuperação quente.

10. Processamento e análise de out

1. usar o modular software para segmentação automatizada de imagem.
   1. Segmentos manualmente corretos correspondente para o interior, limitando a membrana (ILM) e camada plexiforme interna (IPL), que representa os limites do interior da retina camadas (IRL) ²¹.
   2. Certifique-se que a camada de fibras de nervo da retina (RNFL) e a camada de células ganglionares (GCL) residam dentro dos limites da IRL e não se sobreponham.
2. Espessuras IRL calcular usando a grade de ² início tratamento retinopatia diabética estudo (ETDRS) com diâmetros de 1, 2 e 3 mm, centrado no disco óptico e exportar para um arquivo de planilha. O software calcula a espessura de cada camada da retina por uma média de cada setor de grade. Portanto, o segmento central, correspondente na cabeça do nervo óptico, é excluído.
3. Analisar diferenças estatísticas entre os grupos em cada ponto de tempo. Analisar os dois olhos para cada mouse, usando generalizado estimando equações com uma matriz de correlação exchangeable e ajustes para intra-sujeitos correlações inter olho ²¹.

Resultados

Neste protocolo, usamos células de doador T de AQP4 C57BL/6^{- / -} ratos. Imunização subcutânea destes ratos com AQP4 p135-153 ou p201-220, que contêm resumos de patogenicidade de célula T, suscitou respostas proliferativas forte T cell na drenagem dos gânglios linfáticos (Figura 1), Considerando que estes dois peptídeos induzido muito mais fraca célula T proliferação em camundongos WT. Em comparação, a imunização com AQP4 p91-110, que contém um não-patogênicas AQP4 T célula determinante¹³, ou MOG p35-55, um peptídeo de mielina que ativa as células T que causam encefalomielite auto-imune experimental (EAE)^{22,23 ,24}, induzidas pelo semelhante magnitude da proliferação de células T em AQP4^{- / -} e camundongos WT. Análise da utilização de TCR pela coloração de citometria de fluxo do Vβ individuais ou famílias Vβ, demonstrou que células p135-153-p201-220-específicas e T de AQP4^{- / -} ratos utilizaram exclusivos repertórios TCR. Hiperproliferação seletiva de AQP4 p135-153 e p201-220 em AQP4^{- / -} ratos, bem como a utilização exclusiva de TCR (Figura 2), indicado que patogenicidade de célula T respostas a estes determinantes normalmente é regulada pela negativa do Timo seleção, ressaltando a importância para o uso de células de doador T^{- / -} AQP4 neste protocolo.

Antes da transferência adoptiva para indução de ATCA, linfonodo células de ratos de peptídeo-aprontadas AQP4 foram cultivadas in vitro em condições Th17 - ou de polarização Th1 para três dias. O grau de polarização do doador CD4⁺ T células foi confirmada por citocinas intracelulares coloração (ICS) e medida por citometria de fluxo (Figura 3). Ingênua destinatários ratos foram injetados por via intravenosa com 2 x 10⁷ doador AQP4 peptídeo específico as células T. Depois de aproximadamente seis dias, quase 100% dos ratos destinatários desenvolvido sinais clínicos de doença auto-imune do CNS, incluindo paralisia flácida de cauda e membro posterior (Figura 4). Th17 polarizado as células T AQP4 específicas induzidas por doença clínica mais grave do que as células Th1-polarizada AQP4 específico T. Um rato representativo que recebeu Th17 AQP4-peptídeo específico e desenvolvido paralisia completa dos membros de hind (paraplegia) é mostrado no vídeo 1. Em contraste com os ratos que desenvolveram EAE após a administração de células Th17 MOG específicos, ratos destinatários recuperaram de doença clínica induzida pelas células Th17 AQP4 específicos. Quanto EAE induzida pelas células de Th17 MOG p35-55-específico, doença clínica induzida por AQP4 p135-153-específicos ou células de Th17 p201-220-específico foi associado com a infiltração de células mononucleares no parênquima do CNS e meninges (Figura 5). As lesões foram mais abundantes em meninges do que no parênquima para auto-imunidade CNS induzida pelas células Th17 AQP4 específicos.

Envolvimento do nervo óptico foi demonstrado pela avaliação histológica e pelo serial OCT. AQP4 específicos e Th17 MOG específicas células ambos inflamação induzida nervo óptico, que foi caracterizado pela presença de células mononucleares. Considerando que células Th17 AQP4 específicos causaram perineuritis óptica, células Th17 MOG específicas induziram grave neurite óptica (Figura 5). Usando a OCT serial, inflamação do nervo óptico era evidente por inchaço e aumento da espessura da camada interna da retina (IRL) para doença clínica induzida por AQP4 específicos ou células Th17 MOG específico (Figura 6). Para auto-imunidade induzida por AQP4 Th17 CNS, espessura IRL retornada à linha de base como ratos recuperou de doença clínica. Em contraste, persistência da EAE induzida por MOG específicos Th17 correspondia com IRL afinamento e, como temos demonstrado anteriormente¹⁷, foi associada com a perda de células ganglionares da retina.

Figura 1 : AQP4 p135-153 e p201-220 eliciam robusto T cell proliferação em AQP4^{- / -} ratos, mas não os ratos WT. Os ratos foram imunizados s.c. com os peptídeos indicados no CFA. Onze dias depois, gânglios linfáticos foram removidos e então cultivados com ou sem antígeno, ou com o peptídeo usado para a imunização. Proliferação foi medida pela incorporação de ³H-timidina (média ± SEM, representativa de 5 experiências). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Células T específicas AQP4 de AQP4^{- / -} ratos utilizam exclusivos repertórios TCR. AQP4^{- / -} e WT ratos foram imunizados com os peptídeos indicados. Onze dias depois, linfonodos foram removidos e cultivados com peptídeo usado para a imunização. As células foram colhidas. Utilização de TCR Vβ foi analisada por citometria de fluxo (quer dizer SEM ±, n = 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Proinflammatory polarização das células do doador específico AQP4 T. Onze dias após a imunização com AQP4 p135-153 ou p201-220, células do linfonodo foram colhidas e cultivadas com o peptídeo usado para imunização em condições não-polarização, condições de polarização Th1 ou Th17. Polarização de Th17 ou Th1 foi examinada por citometria de fluxo e ICS para IL-17 ou IFN-γ, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Células Th17 polarizado AQP4 específico T induzem paralisia em camundongos destinatários WT. Destinatários camundongos WT receberam 2 x 10⁷ doador polarizado Th17 AQP4 p135-153 ou as células T específicas p201-220 AQP4^{- / -} ratos. Th17 polarizado pilhas de T de MOG específicos serviram como controle positivo. Os resultados são representativos de 8 experimentos (n = 5/grupo). * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Células Th17 AQP4 específicos induzem inflamação opticospinal em camundongos WT. Ratos de destinatários receberam 2 x 10⁷ doador Th17 AQP4 p135-153 - ou p201-220-aprontadas Th17 nas células de AQP4^{- / -} ratos ou Th17 MOG p35-55-específicos e sacrificaram-se 10 dias depois. Tecidos da medula espinhal e do nervo óptico foram preparados e corados com H & E/LFB para a evidência de inflamação e desmielinização, respectivamente. Os resultados são representativos de 5 ratos/grupo. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Inflamação do nervo óptico induzida pelas células Th17 AQP4 específicas pode ser monitorizada por Oct da retina longitudinal Destinatários camundongos WT receberam 2 x 10⁷ doador polarizado Th17 AQP4 p201-220-específicos ou pilhas de T do MOG p35-55-específicos no dia 0. Eles foram examinados pelo OCT no dia 0 (antes da administração de células T) e em seguida nos dias 4, 7, 8, 9, 10, 11 14 e 21. Espessura da IRL foi medido (média ± SEM). As estatísticas indicam uma comparação com controle de ingênuo. Os resultados são representativos de 3 experimentos (5 ratos/grupo). * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

AQP4 foi identificado como o principal alvo no OMN IgG em 2005³. Então, reconheceu-se que seria importante estabelecer um modelo animal AQP4-alvo de auto-imunidade CNS. Esse modelo pode ser útil para investigar como células específicas AQP4 T e B participarem no desenvolvimento de auto-imunidade CNS e para testar terapêutica candidato OMN. Embora a identificação da célula de T AQP4 específico epitopes em ratos do selvagem-tipo foi primeiramente relatada em 2010¹³, respondendo a esses resumos de células T não causou doença clínica ou histológica^14,17. A incapacidade de gerar um modelo de auto-imunidade CNS com base na reatividade imune a AQP4 permanecido um enigma até 2015, quando Jones, et al ²⁵ descobriu que o doador AQP4 p135-153-carregado as pilhas de T do AQP4^{- / -} ratos foram capazes de causar sinais clínicos e histológicos de auto-imunidade CNS em camundongos WT. De interesse, prevê-se para vincular MHC II (-A^b) com alta afinidade¹⁷AQP4 p135-153. Apenas um outra AQP4 sequência de aminoácidos, 201-220, prevê-se que vincule-A^b com afinidade elevada similar. Com efeito, observamos que AQP4 p135-153 e p201-220 ambos provocam proliferação robusta em AQP4^{- / -}, mas não WT, ratos. Aqui, mostramos como pode isolar-se e expandir encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - e p201-220-reativa as células T de AQP4^{- / -} ratos. Quando transferidos para destinatários camundongos WT, células Th17 AQP4-reativo de doador induzida por paralisia, que foi acompanhada por infiltrações de células mononucleares de medula espinhal e o nervo óptico. Lesão do sistema visual aferente é bem conhecido em pacientes com NMOSD AQP4-seropositivos²⁶. Aqui, observamos que a inflamação do nervo óptico induzida pelas células AQP4-reativo e Th17 MOG-reativa era distinta. Considerando que células Th17 AQP4 específicas induzidas perineuritis óptica, células Th17 MOG específicas induziram grave neurite óptica. Também descrevemos as técnicas usadas para monitorar a inflamação do nervo óptico induzida por células T MOG específicos e específicos AQP4 out serial. Outros investigadores agora devem ser capazes de aplicar os protocolos descritos aqui para avançar seus próprios estudos centrados-se mecanismos de patogenicidade de ATCA.

Um pode facilmente evitar três possíveis armadilhas em nosso protocolo. Primeira, adotiva transferência de ATCA requer o uso de células T específicas AQP4 de ratos de doador^{- / -} AQP4. Especificamente, as células do doador WT AQP4 p135-153-específico T não causa ATCA no destinatários camundongos WT. Em segundo lugar, é importante realizar um "água-teste" com uma gota da emulsão CFA/peptídeo antes de imunização das AQP4^{- / -} ratos (protocolo passo 1.5). A emulsão não deve dispersar na água quando é apropriado para a injeção s.c.. Se a emulsão dispersa, um deve misturar a emulsão mais uma vez, relaxar novamente e repita o teste de água. Por último, as pilhas de T antígeno-específicos registrados doador CNS induzem auto-imunidade CNS mais eficientemente do que as células T a descansar. Um deve Inspecione visualmente essas culturas sob o microscópio de luz antes da colheita as pilhas de T do doador para transferência adotiva. Dividir-se rapidamente as células pode formar clusters, que são facilmente identificados. Também, quando culturas contêm muitas células T ativadas, a mídia pode transição do rosa ao laranja ou até mesmo para o amarelo, devido à diminuição do pH. Um pode também avaliar ativação de células de doador AQP4-aprontadas linfonodo T para proliferação por ³H-timidina incorporação, conforme descrito na etapa 3 de protocolo.

Nossa descoberta de que o dois epitopos de célula AQP4 T patogênicos são (1) previu vincular MHC II com alta afinidade e (2) eliciar respostas proliferativas potentes em AQP4^{- / -}, mas não WT, ratos sugerem que células T alvejando aqueles determinantes são normalmente controlada pela seleção negativa do Timo¹⁷. Os repertórios TCR utilizados para reconhecimento das AQP4 p135-153 e p201-220 em AQP4^{- / -} ratos são exclusivos (Figura 2), que também é consistente com deleção clonal mediada por células epiteliais medulares do timo. Outros mecanismos de tolerogenic normalmente podem conter respostas imunes para AQP4. Na sequência do nosso relatório inicial¹⁷, outro grupo também demonstrou que AQP4 p201-220 contém um encephalitogenic determinante de célula T²⁷. Quando ratos de célula T-deficiente α/β (TCRα^{- / -}) foram reconstituídos com AQP4^{- / -} CD4⁺ T células, foi possível eliciar uma resposta de célula T encephalitogenic AQP4 específicos, mas não uma específico AQP4 resposta humoral, que implica que, em Camundongos WT respostas de células B AQP4 específicas, semelhantes a respostas de célula T AQP4 específicos, estão sujeitos a seleção negativa. Na verdade, perda de axônios de medula espinhal e RGCs, que não foi observada em camundongos WT com ATCA induzida por células T específicas AQP4 sozinhos, pode exigir participação de patogenicidade anticorpos específicos AQP4. É claro que modelos de rato de auto-imunidade CNS AQP4-alvo continuará a evoluir à medida que aprendemos mais sobre os mecanismos de tolerogenic normalmente controla a imunidade específica AQP4 T cell e células B.

Outros modelos de auto-imunidade CNS AQP4-alvo também estão sendo desenvolvidos^{6,16,28,29,30}. Cada um pode oferecer vantagens para estudar aspectos particulares que são relevantes para a patogênese OMN. As células T AQP4 específicas foram identificadas em WT ratos^6,16,29. Essas células T específicas AQP4 causaram mudanças histológicas de auto-imunidade CNS mas, semelhante às observações em camundongos, pilhas de T AQP4 específicas do rato WT não causam sinais significativos da doença clínica. Portanto, os mecanismos de tolerância restringindo células T e células B respostas imunes específicas AQP4 em camundongos WT também são operacionais em ratos. Independentemente disso, um não deve subestimar o poder em usando modelos de rato para estudar os mecanismos envolvidos na patogênese da doença. A riqueza de mata-mata, transgênico e repórter ratos pode ser vantajosa. Deve-se reconhecer também que várias descobertas fundamentais em auto-imunidade foram feitas utilizando modelos EAE de rato. Por exemplo, a demonstração de que a célula T clones específicos para um autoantígeno pode mediar doença auto-imune^31,32, identificação do papel das células T costimulation em auto-imunidade³³ e a descoberta do caminho do desenvolvimento para a diferenciação de Th17³⁴ foi primeiramente descrito usando modelos EAE de rato. Usando o modelo do rato de ATCA que temos desenvolvido, um agora tem os meios para estudar o desenvolvimento e regulamentação dos patogénicos específicos AQP4 respostas imunes in vivo, que deve fornecer importantes visões relacionadas à patogênese OMN.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
M. tuberculosis H37Ra	BD Difco	231141	Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant	BD Difco	263910
AQP4 peptide p135-153	Genemed	Custom Synthesis	Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220	Genemed	Custom Synthesis	Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55	Genemed / Auspep	Custom Synthesis	Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock	Kimble	420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized)	GE Healthcare Life Sciences	SH30071
Recombinant Mouse IL-23	R&D Systems (BioTechne)	1887-ML
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems (BioTechne)	406-ML
Recombinant Mouse IL-12	R&D Systems (BioTechne)	419-ML
Thymidine [Methyl-3H]	PerkinElmer	NET027
Glass Fiber Filtermats	PerkinElmer	1450-421
Anti-mouse antibodies	eBioscience (Affymetrix)	[various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel	BD Biosciences	557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain	ThermoFisher Scientific	[various]
Paraformaldehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug	BD Biosciences	555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Iomomycin (calcium salt)	Sigma-Aldrich	I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis	List Biological Laboratories	181
10% Formalin	VWR	89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular	Fisher Scientific	22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP)	Henry Schein Animal Health	050033	NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)	Akorn		NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform	Heidelberg Engineering