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要約

ここでは、アクアポリン 4 (AQP4) 伝による麻痺と opticospinal の炎症を誘発するプロトコルを提案-WT マウスに AQP4-/-マウスから特定の T 細胞。さらに、シリアルの光干渉断層計を使用して視覚システムの機能不全を監視する方法を示します。

要約

それが認識される中、アクアポリン 4 の (AQP4)-特定の T 細胞と抗体に関与して発症オプティカ視神経脊髄炎 (NMO)、人間の中枢神経系 (CNS) 自己免疫性脱髄疾患、両方と AQP4 対象モデルの作成中枢神経系の自己免疫疾患の臨床的および組織学的症状は、挑戦的な証明されています。AQP4 ペプチド (WT) マウスを野生型の予防接種は、これらの T 細胞は、素朴な受信者マウスに病気を転送できませんでしたが T 細胞の増殖を誘発しました。胸腺によってコントロールされて AQP4 エピトープに対する T 細胞の反応性を示唆、AQP4 欠損 (AQP4-/-) マウスの免疫応答の勉強時に、p201-220、ペプチド (p) 135 153 2 つ小説 AQP4 T 細胞エピトープが指定された最近では、負の淘汰。AQP4-/- th17 細胞 T 細胞脊髄と視神経の主に髄膜炎症に関連付けられていた p135 153 または p201 220 受信者の WT マウスで麻痺誘導を仕掛ける円偏波。炎症周囲視神経と網膜内層 (IRL) の関与は、シリアル光コヒーレンストモグラフィ (OCT) の変化によって明示されました。ここで、我々 はモデルを作成するこの新しい生体内で病原性の AQP4 特異的 T 細胞と彼らが B に協力する方法の開発を可能にするメカニズムを研究することができますとり入れ AQP4 をターゲットとした中枢神経系自己免疫 (ATCA) の使用方法を説明します。NMO の病態のセルします。

概要

Optica 視神経脊髄炎 (NMO) は、中枢神経系 (CNS) 引き起こす自己免疫炎症性脱髄性疾患まひ状態および永続的な神経障害1につながる視覚的な損失の再発エピソードです。NMO は、2液性の自己免疫疾患をする抗体 (Igs) アクアポリン-4 (AQP4)、アストロ サイト3,4に豊富に発現水チャネルをターゲットに関連付けられている、主に現在考えられています。しかし、中枢神経系の炎症は AQP4 Ig5,6の CNS エントリーの前提条件です。したがって、それだけで抗 AQP4 Igs の譲渡による NMO のモデルを確立することはなかった。NMO 患者に (1) 病原性の AQP4 固有 Igs である IgG11,2所見、サブクラス7 (2) T 細胞が NMO 病変8,9 (3) NMO で識別される T 細胞依存性免疫グロブリンが関連付けられています。特定の MHC II 遺伝子を持つ (例えば HLA DR17 (DRB1 * 0301))10、および (4) 炎症性反応 AQP4 博士-制限 Th17 細胞が NMO 患者11,12すべての展開は AQP4 特異的 T 細胞が重要な役割であることを示すNMO の病態。したがって、AQP4 特異的 T 細胞 NMO の病態に貢献するかもしれない方法を決定するための動物モデルを開発することが重要です。

数年前、複数の AQP4 T 細胞エピトープは、野生型 (WT) マウス13,14とラット15で識別されました。AQP4 反応性 T 細胞が素朴な受信者ラット15,16opticospinal 炎症を引き起こすことができることがわかった中、CNS 疾患の重要な臨床症状は認められなかった。同様に、AQP4 T 細胞エピトープ14,17, を含むペプチドと WT マウスの免疫を直接、または炎症性 T 細胞それら要因17をターゲットの転送し、臨床症状が発生していない組織、または中枢神経系の自己免疫の証拠。

最近では、それは親和性の高い18AQP4 ペプチド (p) 135 153 または MHC II (- Ab) をバインドする予測 2 つの要因、p201 220 C57BL/6 AQP4 欠損 (AQP4-/-) マウスの予防接種を認め、強い CD4 を誘発+ T 細胞応答17。対照的に、これらの 2 つのペプチドは WT マウスでのみ控えめな反応を引き出した。さらに、AQP4-/-マウスの T 細胞によるこれらの要因の認識に使用される T 細胞受容体 (TCR) レパートリーはユニークだった。総称して、AQP4 の認識を T 細胞が胸腺の負の淘汰によって調節されていることが示唆されました。AQP4 p135 153 または p201-220-固有 AQP4-/-ドナーのマウスから Th17 細胞による素朴な受信者 WT マウス; のほぼ 100% で麻痺これは、T 細胞、B 細胞、単球の opticospinal 浸潤と関連付けられました。シリアル opticospinal コヒーレンストモグラフィ (OCT) は、動的視覚システムの関与を示した。AQP4 をターゲットとした CNS の T 細胞性自己免疫 (ATCA) を持つマウスは、麻痺とビジュアル系の傷害から回復しました。ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) p35-55-特定の T 細胞による、永続的な臨床病気につながったフイブロネクチンと対照をなして単独で T 細胞による ATCA は軸索損失または網膜神経節細胞 (Rgc) の削減に関連付けられてでした。我々 の結果では、複数の病原性 AQP4 T 細胞決定があることが明らか。ATCA のこの新しいモデルはそれらの細胞が CNS の発火を誘発する方法と彼らが AQP4 特異 B 細胞と抗体 NMO の病態を促進するために協力する方法を学習、病原性の AQP4 特異的 T 細胞の開発を制御するメカニズムを調べる場合に役立ちます.

本報告を誘導し、T 細胞による ATCA を評価に使用するプロトコルについて述べる。まず、予防接種、培養 T 細胞、th17 細胞の分極のため病原性 AQP4 特異的 T 細胞、偏波とそれらの T 細胞の養子の転送を確認する流れフローサイトメトリー解析を生成するための技術に。私たちは、臨床的および組織学的病と受信者のマウスの視覚システム障害を監視するシリアル 10 月の使用を評価するために使用方法を説明します。

プロトコル

カリフォルニア大学、サンフランシスコ機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された実験的ガイドラインに準拠してすべての動物の手続きを行った。生後 8 週に購入された C57BL/6 (H-2 b) 雌マウスと C57BL/6 AQP4 -/- マウスは、A. Verkman によって提供されたします

。

1 マウス接種 AQP4 ペプチド

  1. 準備完了フロイント ' s アジュバント (CFA) 在庫。。
    1. 結核 (菌 H37Ra) 乳鉢と乳棒を使用しての乾燥調製を細かく挽く
      2. 。
    2. 追加地面に不完全フロイントアジュ菌 H37Ra ' 4 mg/mL の最終的な集中する s の補助。CFA を最大 6 ヶ月の 4 ° C で保存できます
      3. 。
  2. ディゾルブ (Ag) を最終濃度 1 mg/mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で AQP4 ペプチドを凍結乾燥します。4 ° c または氷を維持
  3. CFA/ペプチド エマルションを含む、活栓で結合されている 2 のルアーロック シリンジのアセンブリを準備します。
    1. アタッチ プランジャー 2 男性ルアーロック接続とナイロン三方活栓なしガラスのルアーロック注射器。注射器に向かってレバーを切り替え、活栓を閉じる。テスト チューブとして使用する注射器が可能シリンジのオープン エンドを配置します。チューブ ラック加えられた安定性のためにこれを配置します
      2. 。
    2. 渦 CFA 作業用ストックと Ag のソリューション。ペプチドの 1:1 ボリュームを追加/オープンのシリンジに CFA。CFA/Ag (50 μ L × 4) を 200 μ l 添加はマウスごとに必要です
      。 注: 通常、準備の約 1 mL は、予防接種の利用量を減らす活栓で失われます。したがって、必要な容量の計算にこれを組み込むことが重要です
      。 例: 5 マウスの免疫の: (200 μ L/動物 x 5 動物) + 1 mL 余分なボリューム = 2 mL 合計 CFA/Ag 必要があります
      3. 。
    3. 注射器に、場所にそれを保持している間ガラス プランジャーを挿入し、活栓が上向き、注射器を反転します。未使用のメスの接続にコック レバーを切り替えます。慎重にシリンジから空気を除去するためにガラスのプランジャーに圧力を適用します。液体を塗りつぶします、活栓の 2 番目の男性のルアーロック接続します
      4. 。
    4. は、活栓の 2 番目の男性のルアーロック接続に 2 番目ガラス製注射器 (ピストンが完全に挿入される) を接続します。これはできるだけ少し余分な空気として含む活栓で接続されている 2 ガラス注射器のクローズド システムをする必要があります
      5. 。 エマルジョンを作成する
    5. 、低温約 2 分約 10 分間氷の上の注射器を繰り返す寒さの 2 注射器間交互に液体を渡すプランジャーを押すと準備の粘度の明確な変化があるまで混合ミックスします。、非常に硬い、ホワイト エマルジョンの結果します。4 ° C でエマルジョンを含む注射器を冷蔵または、氷の維持
  4. 乳剤のすべてを 1 つのガラス ルアーロック注射器に転送、削除空のガラス製注射器および注射用 1 mL ルアーロック注射器交換します。エマルションを用いた新しい注射器を埋める、活栓からそれを削除し、針 (25 x 5/8) を添付します
    5. 。
  5. " 水テスト " 一貫性のエマルジョン。小さな皿に水の滴のエマルジョンを追放します。乳剤が分散されず、注射に適したがあることを示す.
    1. エマルジョンの分散する場合、は、注射の準備はありません; 転送液体ガラスに注射器や混合し、エマルジョンが硬いになるまで再びリラックスし続けます
      2. 。
    2. 適切な一貫性を達成するまでに乳剤を再度テストします
      3. 。
  6. ドナー AQP4 -/- マウスの皮下注入 (サウスカロライナ) AQP4 ペプチドを含有エマルションを用いた。それぞれのマウスは、4 x 50 μ L 皮下注射 (200 μ 合計 (100 μ g ペプチド)) を受け取ります。4 サイト、下腹部の両側鼠径リンパ節 (LN) に流出して腋窩のレーンに流出する各脇の内側の箱壁の両側の両方を含める養子の転送受信者マウスあたり 1-2 免疫ドナー マウスが必要になります
    7. 。

2。T 細胞培養と炎症性 T 細胞の分極

  1. 10-12 日、予防接種後は、マウスから LN を集める。
    1. 製氷皿で 60 mm ペトリ皿セル ストレーナー (メッシュ サイズ 70 μ m)、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) 冷蔵 RPMI メディアと 100 U/mL ペニシリン 100 μ g/mL ストレプトマイシン (ペン-連鎖球菌) (RFP) を含むを準備します
      2. 。
    2. CO 2、続いて頚部転位への露出によって安楽死マウス。70% エタノールでマウスを浸すし、郭清の掲示板に各足蹠をピンします
      3. 。
    3. は、各脚の上下、首に脚の付け根から正中皮膚切開をカットしました。腹膜から皮膚を引っ張ったりし、緊張してボードにピン留めします。鼠径部や腋窩の LN を解剖し、氷の上、見積もり依頼を含むペトリ皿に配置します。 19
    4. 養子転送実験のため同じ予防接種グループ内のすべての動物から LN を組み合わせます。個々 の動物を Vβ 利用の流れフローサイトメトリー解析分離 LN
      5. 。
  2. RFP を含む 50 mL 遠心管に LN を含むセル ストレーナーを配置。細胞の回復を促進するのに RFP の 20-30 mL で洗浄、こし器を通して LN セルを押して滅菌 5 mL シリンジのプランジャーの平らな終わりを使用します。LN 細胞文化の時間まで処理全体で氷の上を維持します
    3. 。
  3. 洗浄 2 回、5 分 393 × g で遠心分離します。第二その後、T 細胞のメディア (TCM) LN 細胞を再懸濁します。TCM に RPMI が含まれています 10% 熱-不活化 FBS、292 μ G/ml L-グルタミン、110 μ g/mL ピルビン酸ナトリウム、および 55 μ M 2-メルカプトエタノール、ペン連鎖球菌。通常、ドナー マウスあたり 5 mL TCM のボリュームが使用されます
    4. 。
  4. は、LN のセルをカウントします。予想収量は約 3-6 免疫マウス ドナーごとの 10 の 7 LN セル x です。脇に 3-4 x 10 拡散の試金のための 6 (以下のセクション 3 を参照してください).
  5. 養子転送 (セクション 6) 文化を偏光を設定。
    1. 10 μ g/ml の Ag、20 ng/mL 遺伝子組換えマウス インターロイキン (IL)-23 mL あたり 6 LN セル 5 x 10 の th17 細胞の偏光文化を準備し、10 ng/mL 組換えマウスを TCM に IL 6.
    2. また、5 x 10 の文化 10 μ g/ml の Ag mL あたり 6 LN 細胞を準備 Th1 偏波用と 10 ng/mL 組換えマウスを TCM に IL 12
      3. 。
    3. は、12 ウェル プレートに偏光の文化の混合物の井戸あたり 2 mL (1 x 10 の 7 セル) を追加します。2-4 ドナー マウスから LN 細胞 1 つ 12 ウェル プレートいっぱいになります。72 h の 5% CO 2 と 37 ° C で加湿のインキュベーターで培養を維持
    4. は視覚的に 48 時間の活性化のための文化の LN セルを確認し、72 h 活性細胞は大規模なクラスターを形成、T 細胞より多形性になること、サイズが大きくなります。代謝の増加は、桃からオレンジに変更、メディアで pH の低下原因となります。残り 24 時間で細胞への毒性を防ぐために新鮮な TCM の 1 mL を追加し pH が十分に低いメディアを黄色にする場合、
    5. 養子転送のセクション 6 に進みます。Descr として細胞内サイトカイン染色 (ICS) によって偏光効率を検証可能性があります。セクション 5 で ibed です
      6. 。
  6. 表面の Vβ 式 (セクション 4) のフローサイトメトリーによる解析のための個々 のマウスから LN を使用するカルチャを設定します。
    1. 5 × 10 6 10 μ g/ml の TCM の Ag mL あたり LN セルを準備します
      2. 。
    2. は、12 ウェル プレートによくあたり文化の 2 mL (1 x 10 の 7 セル) を追加します。文化は、10 日の 5% CO 2 と 37 ° C で加湿のインキュベーターで維持しなければなりません。セクション 4 に進みます
      3. 。

3。拡散の試金

注: これはセクション 2.4 から続行されます

。
  1. TCM の mL あたり 6 セル 2 × 10 で、チューブの LN セルの 3-4 mL を準備します
    2. 。
  2. 優しく数回、チューブの反転によってセルをミックスし、滅菌トラフに転送します
    3. 。
  3. 96 ウェルのラウンドに使用細胞/ウェルのプレート 100 μ L にマルチ チャンネル pipettor 下部組織培養プレート。通常、4 Ag 濃度と Ag 参照なしの帳票をテストするための 15 の井戸をプレートします
    4. 。
  4. は、様々 な濃度で TCM、通常 80、20、5、1、0 μ g/ミリリットル (2 x 株) の Ag を希釈します。最終濃度 40、10、2.5、3 通の各濃度 100 μ L を追加します。0.5 と 0 μ g/mL。37 で約 72 時間インキュベート ° C
    注: 手順 3.7 から 3.5 に放射性物質が含まれています。適切な使用方法、監視及び放射性物質の廃棄は、機関および政府の規制に従って実施する必要があります
    5. 。
  5. 3 H-チミジンの作業の原液を準備 (40 µCi/mL) 25 mL RPMI に 1 mCi 3 H-チミジンを加えると 4 でこれを保管 ° C. ピペット滅菌トラフに作業溶液 0.5 mL
    6. 。 3 H-チミジンの追加 25 μ L
  6. (1 µCi) あたりもマルチ チャンネル ピペットで移しなさい。さらに 18 時間 37 分間インキュベート ° C
  7. は 96 ウェルの細胞収穫機を使用ガラス フィルター マットの上に細胞を収穫し、70% エタノールでリンスします。乾燥後、フィルター マットを 5 mL シンチレーション液体でプラスチック製のサンプル袋にシールします。まあシンチレーション カウンターを使用して各メジャー放射能
    8. 。

4。細胞表面の TCR Vβ 発現のフローサイトメトリー分析

注: これはセクション 2.6 から続行されます。抗体マウス TCR Vβ 2、3、4、5.1、5.2、6、7、8.1、8.2、8.3、9、10 b、11、12、13、14、17 a、商業的 TCR Vβ 式をテストできる

。
  1. TCR Vβ の検出、数回ピペッティングによる T 細胞培養プレートを取り除くし、管にセルを転送します
    2. 。
  2. 2 %fbs があり、0.1% アジ化ナトリウムと 2 mM PBS で EDTA を含む FACS バッファー (FB) で洗うです
    3. 。
  3. 1 x 10 5 3 x 10 の密度で V 下 96年ウェル プレートに転送細胞/ウェル 6 セルです。セルを複数井戸 (Vβ テスト中につき 1 つの井戸) に分散する必要があります Vβ パネル全体がテストされている場合
    4. 。
  4. は、壊死細胞によって公開されている無料のアミンと反応する LIVE/デッド性染料で染色、フローサイトメトリーによる解析から死んだ細胞を除外します。製造元に従う ' 遠心分離、再懸濁性染料のための指示。ステイニングが細胞全体の 10-20 分の氷の上を孵化させなさい、光から細胞を守る、氷の維持
  5. インキュベーション後、FB で一度プレートを洗います。TCR Vβ を検出するため FB の CD4 抗体の 1: 100 希釈を含むの 100 μ L のセルを中断 (RM4 5 クローン) と TCR Vβ。氷 15 60 分間インキュベート
  6. は FB で一度プレートを洗う、PBS で希釈した 4% パラホルムアルデヒドの 200 μ L を追加することでセルを修正します。氷の上に 20 分間インキュベートします。FB でプレートを洗浄し、フローサイトメトリーで分析します
    7. 。

5。サイトカイン産生細胞のフローサイトメトリー

  1. 細胞内サイトカイン染色 (ICS) のタンパク質輸送阻害剤試薬 (例えば、GolgiPlug) の縮尺希釈で T 細胞培養で扱う TCM、防ぐために IC の前に 4 hサイトカイン分泌。その時、蛋白質の生産を引き起こすために 50 ng/mL ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) と 500 ng/mL イオノマイシン T 細胞をアクティブにします
    2. 。
  2. 37 ° C で文化の 4 h 後上下、ピペッティングにより細胞培養プレートを取り除くし、遠心分離機管 (15 または 50 mL) に転送します
    3. 。
  3. FB を洗ってください。FB で 5 × 10 5 ウェルあたり 3 x 10 の 6 セルの密度で V 下 96年ウェル プレートに転送細胞を再懸濁します
    4. 。
  4. 染色細胞生存率染付 (セクション 4.2) 前述のよう。、孵化後 FB で一度プレートを洗うです。
  5. 表面マーカーの検出のための抗体を次のように追加:
    1. 表面マーカーの検出、CD4 の抗体の 1: 100 希釈を含む FB の 100 μ L のセルを中断 (RM4 5 クローン).
    2. はオプションで、b220 抗体を含める (30-F11 のクローン) と CD11b (M1/70 のクローン) B 細胞と単球/マクロファージ、それぞれゲートを改善するために 1: 100 希釈で。一般的に、PE Cy7 抗 cd4 抗体、FITC アンチ B220、PerCP Cy5.5 抗 CD11b はよく働きます。抗体/螢光色素複合体の選択は、分析に使用される流れの cytometer の構成によって導かれる必要があり、抗体の至適濃度は経験的に決定する必要があります
      3. 。
    3. 氷 15 60 分インキュベート
  6. FB を洗浄して氷の上に 20 分間固定/透過ソリューションを 200 μ l 添加の細胞を再懸濁します。これはセルを修正し、膜を permeabilize
    7. 。 細胞内染色中に細胞膜の透過を維持するために
  7. は、FB ではなくパーマ/洗浄バッファー (PW) (希釈 1:10 10 の X の在庫から) を使用します。PW の 200 μ L の洗浄です
    8. 。
  8. ICS の準備 1: 100 希釈抗体のインターフェロン (IFN)-γ IL 17A 1 を使用して、x PW。1 つのオプションは、APC アンチ-IFN-γ (クローン XMG1.2) と PE アンチ-イル-17A (クローン eBio17B7) よく働く。細胞抗体カクテルの 100 μ L の細胞を再懸濁し、少なくとも 15 分間インキュベートします。それはまた 4 で一晩染色を続行することが可能 ° C
  9. PW を 200 μ l 添加の井戸とフローサイトメトリー用 FB 濁洗う
    10. 。
  10. 並行して、無染色のサンプル (FB 抗体なしセル) を準備する検出器電圧とそれぞれの個々 の螢光色素は (すなわち、細胞または 1 つだけ抗体/螢光色素で染色補正ビーズ) の単染色サンプルを最適化補償スピル オーバー値を決定します
    11. 。
  11. 流れの cytometer を使用、≥ 10,000 のセル (イベント)、実行可能な (LIVE/死者-負) CD4 のゲート + 細胞。T 細胞の正確なゲートを確保するため、除外、B220 + と CD11b + 細胞 (B 細胞と単球/マクロファージ、それぞれ)。CD4 内 + T 細胞の亜集団、IFN-γ (Th1 系統) または IL-17A (th17 細胞系統) を発現する細胞の比率を入力します
    12. 。

6。養子の転送の病原性 AQP4 特異的 T 細胞

注: このステップ セクション 2.5 から続くよう: T 細胞文化および炎症性 T 細胞の分極

。
  1. 回復を上下にずらす、ピペッティングして 50 mL のチューブに移し 12 ウェルのプレートからセルの偏光。Maintain 注射まで氷の上
    2. 。
  2. はセルをカウント、冷 PBS で 2 回洗浄し、PBS で 1 × 10 8 セル/mL の懸濁液を準備します。一般的に、時間内でセルを挿入します
    3. 。
  3. は軽く旋回でセルを混合し、射出時に 1 mL の注射器に転送。静脈内のセル (2 x 10 7) 200 μ L を管理 (静注) 各マウスは、尾静脈
    4. 。
  4. 注入 200 では各受信者のマウスに i の. p. その日の 2 日後、百日咳 毒素の ng が 200 μ L の PBS で希釈しました。臨床疾患の兆候を毎日マウスを監視します
    5. 。

7。臨床評価の ATCA

  1. 確認受信者マウス中枢神経系の自己免疫疾患の臨床症状の毎日。一般的にマウスが AQP4 特異的 T 細胞の養子転送後 5-8 日中枢神経系の自己免疫疾患の徴候を表示します。マウス神経機能障害の臨床症状が表示されます。マウスの通常の能力を定義する単純なマウスの評価を実行すると便利です
    2. 。
  2. テールの損失を評価マウス トーン。尾の基部に軽くマウスを保持、まっすぐ持ち上げます。継続的に尾の損失として記述されている、ドループ尾トーン (1 のスコア)。尾音の損失は、しばしば臨床病気の最初の兆候です
    3. 。 平らな面に背中にマウスを置くことによって
  3. を正すためテスト反射。体幹失調の印である遅い立ち直り (2 得点)。素朴なマウスが完全に障害として権利能力の任意の遅さを獲得するので、背中にそれを配置しように抵抗します。この反射の 3-4 倍のマウスをテストする方が一般的です
    4. 。
  4. 評価姿勢と歩行。低下の結果または歩行中に腰のドラッグの姿勢で変化を示すマウスを開始 (2.5 のスコア)。さらに病気の結果 1 つハインドの完全麻痺、単麻痺の上肢 (3.0 のスコア)、麻痺、両後肢の完全麻痺上肢 (3.5 のスコア)。前方の非常にゆっくりした動きに適度な quadraparesis、すべての四肢の脱力結果 (4 のスコア)。深刻な quadraparesis は前方移動できますほとんどない (4.5 のスコア)。最後に、重症な瀕死になるかは死ぬ (5 得点).
  5. 管理使用流体補充できなくなる代わりに、流体や固体の食品 1 mL の生理食塩水の i. p. の 5% ブドウ糖を取得するマウスにゲルの脱水と絶食に対抗するカップ、高カロリーのゲルとベーコン softies。瀕死の状態のマウスを安楽死させる
    6. 。

8。ティッシュの準備学

  1. 100 mg/kg のケタミン 10 mg/kg キシラジンとマウスを麻酔し、郭清の掲示板に各足蹠をピンします
    2. 。
  2. オープン、胸を心を公開します。血液流出を許可する肝臓を切開します。蝶針を PBS と 10% ホルマリンの別のため池を利用した miniflow の可変的な速度ポンプのチューブに取り付けます。心臓の左心室に針を挿入し、5 ml の PBS、10% ホルマリンの 25 の mL に続いての灌流します
    3. 。
  3. 頭し目を削除します。プロセスの目と網膜 20 を前述のよう。目のソケットを横切って、はさみを鼻に挿入、両側後方前方頭蓋骨をカットします。
    1. 頭蓋骨を削除、公開視神経、視交叉をカット、カセット 2 の泡パッドの間に配置します
      2. 。
    2. 70% のエタノールに転送しますと、50% エタノール (24 h) (24 h)、10% ホルマリンに浸します
      3. 。
  4. 脳と脊柱を取り外し、10% ホルマリンで配置。コロナの平面の連続セクション脳矢状のセクション脊髄コード (約半分) およびシリアル冠状面 (マウスあたり約 20 断面).
  5. パラフィン包埋を日常的にプロセス CNS サンプル。ヘマトキシリンとエオシン (視神経) またはルクソール高速青ヘマトキシリンとエオシン (脳と脊髄) の 8 μ m 厚いセクションを染色します
    6. 。
  6. 神経と周囲髄膜 (視神経炎) の内でまたは主に (光 perineuritis) の周辺の髄膜に炎症が存在する視神経を評価します
    7. 。
  7. 髄膜と実質炎症巣をカウント (> 10 クラスター化された単核細胞) 各マウスの脳・脊髄組織サンプルで
    8. 。

9。生体内で網膜光干渉断層計 (OCT) によるイメージング

注: 一貫性のある眼を達成するために業務用機器 (例えば TruTrack 目の追跡者と Spectralis) を使用してマウスのスペクトル領域 OCT 網膜イメージングを実行方向運動の成果物を減らすと

。
  1. 画像、前に 5 分は 1% トロピカミド (目ごとに 1 つのドロップ) と生徒を拡張し、2 リットル分 (1.5% イソフルラン) の安定した流れを提供する麻酔誘導室でイメージを作成するのには、マウスを配置します。熱マットをオンにし、麻酔後回復ケージを準備します
    2. 。
  2. イメージングのシリンダー上にマウスを置くし、それに応じて麻酔フローのリダイレクトします。0.3% ヒドロキシプロピルメチル セルロース、目の潤いを保つと、屈折の継続性を確保するために目を保護します。カスタム コンタクト レンズを検討する目に配置します
    3. 。
  3. 赤外線眼底画像による誘導は、梁、視神経乳頭を中心に確保する、目にレーザーを直接します。垂直方向と水平方向の OCT スキャンは、網膜レーザーに垂直を産むことを確認してください
    4. 。
  4. 高分解能モードで 30 からラスタライズを行う 25 B-スキャン、スキャンの平均です
    5. 。
  5. 両方の目をイメージング後コンタクト レンズを削除し、ゲル状目薬を適用します。暖かい回復ケージ内マウスを残しています
    6. 。

10。10 月の処理と解析

  1. イメージング自動セグメンテーションのためのソフトウェア モジュールを使用します。
    1. 手動で正しいセグメント内側の膜 (ILM) と内側の網状層 (IPL) の制限に対応する、(IRL) 21 層の内部の網膜の限界を表すします
      2. 。
    2. 網膜神経線維層 (視神経) と神経節細胞層 (GCL) IRL の限界内に存在し、重複しないことを確認します
      3. 。
  2. IRL の計算厚さ 1、2、および視神経乳頭とスプレッドシート ファイルへの輸出を中心に 3 mm の直径を持つ初期治療糖尿病性網膜症研究 (ETDRS) 2 グリッドを使用します。ソフトウェアは、各グリッドのセクターを平均することによってそれぞれの網膜の層の厚さを計算します。このため、視神経乳頭に対応する中央のセグメントを除外します
    3. 。
  3. は、各時点でグループ間の統計的な差異を分析します。一般化推定方程式を用いた交換相関行列と相関関係間目内部 21 の調整を使用して、それぞれのマウスの両方の目を分析します
    4. 。

結果

このプロトコルでは、C57BL/6 AQP4-/-マウスからドナー T 細胞を使用しました。これら 2 つのペプチド誘導くらい弱い T 細胞に対し、病原性 T 細胞エピトープを含む、AQP4 p135 153 と p201-220、これらのマウスの皮下接種はドレイン リンパ節 (図 1)、強い増殖性 T 細胞反応を誘発WT マウスで増殖します。比較では、AQP4 p91-110、免疫非病原性 AQP4 T の細胞決定の13、またはモグ p35-55、実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE)22,23 を引き起こす T 細胞を活性化するミエリン ペプチドを含む ,24, 誘発 AQP4-/-と WT マウスの T 細胞増殖の同じような大きさ。流れの cytometry の汚損によって TCR 使用率の分析の個々 の Vβ または Vβ の家族を示した AQP4-/-マウスから p135 153- と p201-220-特定の T 細胞がユニークな TCR レパートリーを利用します。選択的ハイパー増殖 AQP4 p135 153 と AQP4-/-マウスだけでなく、ユニークな TCR 使用率 (図 2)、p201 220 の胸腺負定め通常病原性 T 細胞応答これらの決定要因に、示されています。選択は、このプロトコルで AQP4-/-ドナー T 細胞を使用しての重要性を強調します。

ATCA の誘導の養子転送前に AQP4 ペプチドされたマウスからリンパ節細胞の体外培養 3 日間 th17 細胞や Th1 偏光条件で。程度ドナー CD4 の偏波+ T 細胞は細胞内サイトカイン染色 (ICS) によって確認され、フローサイトメトリー (図 3) を用いています。2 x 107ドナー AQP4 ペプチド特異的 T 細胞を静脈内注入した素朴な受信者マウス。約 6 日後ほぼ受信者マウスの 100% はぐったりの尾と後肢の麻痺 (図 4) を含む中枢神経系の自己免疫疾患の臨床徴候を開発しました。AQP4 特異的 T 細胞の th17 細胞偏極による Th1 偏光 AQP4 特異的 T 細胞よりもより厳しい臨床病。Th17 AQP4 ペプチド特異を受信し、完全な後肢麻痺 (麻痺) を開発した代表的なマウスは、ビデオ 1に表示されます。EAE を開発したモグ固有 Th17 細胞の投与後のマウスとは異なり受信者マウスは AQP4 固有 Th17 細胞による臨床病気から回復しました。モグ p35 固有 55 Th17 細胞による惹起、AQP4 p135 153 固有でによる臨床病や Th17 細胞 p201-220 CNS の実質および髄膜 (図 5) の単核細胞の浸潤と関連していた。豊かな AQP4 固有 Th17 細胞による中枢神経系の自己免疫の実質のより髄膜病変。

組織学的評価とシリアル 10 月 AQP4 特定によって視神経の関与を示したし、モグ固有 Th17 細胞は単核球細胞の存在によって特徴付けられた両方の引き起こされた視神経炎症。AQP4 固有 Th17 細胞は、光 perineuritis を引き起こされるに対し、MOG 固有 Th17 細胞誘導重症視神経炎 (図 5) です。シリアル OCT を使用すると、視神経の炎症腫脹によって明らかになった、AQP4 固有または特定のモグ Th17 細胞 (図 6) による臨床疾患の網膜内層 (IRL) 厚みが増加します。AQP4 th17 細胞による中枢神経系の自己免疫疾患、臨床病気から回復 IRL 厚さマウスとしてベースラインに返されます。対照的に、モグ固有 th17 細胞による EAE の永続性は IRL の菲薄化と対応し、先ほど我々 説明した17、網膜神経節細胞の損失と関連していた。

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図 1: AQP4 p135 153 と p201 220 AQP4-/-マウスがなく、WT マウスで堅牢な T 細胞の増殖を引き出します。接種した sc の CFA で示されたペプチドです。11 日後、リンパ節の除去、ないのいずれかの抗原または予防接種用ペプチドを培養します。3H-チミジン取り込み (平均 ± 5 実験の代表的な SEM) によって増殖を測定しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 2: AQP4-/-マウスから AQP4 特異的 T 細胞を利用一意の TCR レパートリー 。AQP4-/-と WT マウスは、示されたペプチドで免疫しました。11 日後、リンパ節除去し、予防接種に使用されるペプチドで培養されました。セルを収穫されました。TCR Vβ 利用したフローサイトメトリーで分析した (意味 ± SEM は、n = 5)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 3: ドナー AQP4 特異的 T 細胞の炎症性偏光。AQP4 p135 153 または p201-220、接種後 11 日間リンパ節細胞収穫, 非偏光条件、Th1 や Th17 偏光条件で予防接種に使用されるペプチドで培養された.Th17 細胞や th1 細胞の分極によって調べた ICS とフローサイトメトリー IL 17 の IFN-γ、それぞれ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 4: Th17 偏光 AQP4 特異的 T 細胞誘導 WT 受信者マウスで麻痺します。WT 受信者マウスは、AQP4-/-マウスから 2 x 107ドナー Th17 偏光 AQP4 p135 153 または p201 220 特異的 T 細胞を受け取った。モグ特異的 T 細胞の th17 細胞偏光はポジティブ コントロールとして提供しています。8 実験の結果が (n = 5/グループ)。* p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 5: AQP4 固有 Th17 細胞は WT マウスで opticospinal 炎症を誘発する。受信者のマウスは 2 x 107ドナー Th17 AQP4 p135 153 または p201-220-先読み Th17 細胞 AQP4-/-マウスや Th17 モグ p35-55-特定の細胞を受け、10 日後が犠牲になった。脊髄と視神経組織が準備され、H に染まった & E/LFB 炎症、脱髄の証拠を評価するには、それぞれ。結果は、5 マウス/グループの代表です。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 6: 縦断的網膜 10 月、AQP4 固有 Th17 細胞による視神経の炎症を監視できますWT 受信者マウスは、0 日目に 2 × 107ドナー Th17 偏光 AQP4 p201-220-特定やモグ p35-55-特定の T 細胞を受け取りました。10 月 0 日目 (T 細胞の管理) の前に検討されたとし、日 4、7、8、9 10 11 14 と 21。IRL の厚さは、測定 (平均 ± SEM) だった。統計は、単純なコントロールとの比較を示します。結果は、3 実験 (5 マウス/グループ) の代表です。* p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

AQP4 は、2005年3NMO IgG の主なターゲットとして識別されました。その後、中枢神経系の自己免疫の AQP4 対象動物モデルを確立することが重要になることが認められました。このようなモデルは、AQP4 固有 T および B 細胞が中枢神経系の自己免疫疾患の開発に参加する方法を調査して、NMO の治療薬候補をテストする役に立つかもしれません。ただし、野生型マウスのエピトープは 2010 年13、それらの抗原に応答する T 細胞で初めて報告されました AQP4 特異的 T 細胞の同定の臨床的または組織学的疾患14,17を発生していません。AQP4 に対する免疫反応に基づく中枢神経系の自己免疫疾患のモデルを生成することができないときに 2015年まで謎に残ったジョーンズら25は、AQP4-/-マウスからドナー AQP4 p135 先読み 153 T 細胞が WT マウスにおける中枢神経系の自己免疫疾患の臨床的および組織学的徴候を引き起こすことができることを発見しました。関心の AQP4 p135 153 は親和性が高い17MHC II (- Ab) をバインドと予測されます。1 つだけ他 AQP4 アミノ酸シーケンス、201-220 は、バインド - Abと同様の高い親和性と予測されます。確かに、その AQP4 の p135 153 ・ p201-220 両方引き出す AQP4-/-、しかしない WT、マウスで堅牢な増殖を観察しました。ここでは、我々 はどのように 1 つを分離でき、AQP4-/-マウスから encephalitogenic Th17 AQP4 p135 153 と p201-220-反応性 T 細胞の拡大を示しています。WT 受信者マウスに転送、ドナー AQP4 反応性 Th17 細胞誘導麻痺、脊髄と視神経の単核細胞浸潤を伴っていた。求心性の視覚システムの損傷は AQP4 抗体陽性 NMOSD26症例でよく知られています。ここでは、AQP4 反応やモグ反応性 Th17 細胞による視神経の炎症だったを見ました。AQP4 固有 Th17 細胞は、光 perineuritis を誘導に対しモグ固有 Th17 細胞は重症視神経炎を誘導しました。シリアル 10 月 AQP4 固有とモグ特異的 T 細胞による視神経の炎症を監視に使用する技術も説明しました。他の研究者は、ATCA の発症機構に焦点を当てた独自の研究を進めるためにはここで説明したプロトコルを適用することができるはずです。

1 つは簡単に我々 のプロトコルで 3 つの潜在的な落とし穴を回避できます。ATCA の最初、養子の転送には、AQP4-/-ドナーのマウスから AQP4 特異的 T 細胞の使用が必要です。具体的には、ドナー WT AQP4 p135 153 特異的 T 細胞では、受信者の WT マウスの ATCA は発生していません。第二に、AQP4-/-マウス (プロトコル手順 1.5) の予防接種前にペプチド/CFA エマルジョンのドロップで「水テスト」を実行することが重要です。乳剤はする必要がありますそれが皮下注射に適した水に分散されず。エマルジョンの分散は、エマルジョンをもう一度混ぜて、再び寒さ水テストを繰り返します必要があります 1 つ。最後に、中枢神経系活性ドナー抗原特異的 T 細胞は T 細胞を安静時よりもより効率的に中枢神経系の自己免疫疾患を誘発します。1 つは、視覚的に養子転送ドナー T 細胞を収穫する前に光の顕微鏡の下でそれらの文化を検査しました。急速に細胞分裂を容易に識別のクラスターを形成できます。また、文化には、活性化 T 細胞多くにはが含まれて、メディアはオレンジや黄色、pH の減少によるピンクから移行があります。プロトコルの手順 3 で説明した 1 つは3H-チミジン取り込みによってドナー AQP4 プライミング リンパ節 T 細胞増殖の活性化を評価することも。

我々 の発見は、2 つの病原性 AQP4 T 細胞エピトープ (1) 予測される高親和性 MHC II をバインドし、(2) AQP4-/-、ない WT でも強力な増殖反応を誘発する、マウスは、これらの要因を対象とする T 細胞は、通常を示唆しています。胸腺の負の淘汰17によって制御されます。AQP4 p135 153 と AQP4-/-マウスの p201 220 の認識のために利用する TCR レパートリーがユニーク (図 2) また、胸腺髄質上皮細胞によって仲介されたクローンの削除に一貫しています。他の免疫寛容のメカニズムは通常 AQP4 に対する免疫応答を抑制するかもしれない。私たちの最初の報告の17、それに続く別のグループは、AQP4 p201 220 に、encephalitogenic T 細胞決定27が含まれていることをまた示した。Α/β (TCRα-/-) T 細胞欠損マウスが AQP4-/- CD4 と再構成されたとき+ T 細胞、encephalitogenic AQP4 固有の T 細胞の応答では、しかしない、AQP4 固有体液性応答の意味を引き出すことはでしたWT マウス AQP4 特異 B 細胞応答、AQP4 固有の T 細胞の応答のようは、負の選択が適用されます。確かに、AQP4 特異的 T 細胞による ATCA と WT マウスで観察されなかった、脊髄軸索と、Rgc の損失は、病原性の特定の AQP4 抗体の関与を必要があります。それは明らか AQP4 をターゲットとした中枢神経系の自己免疫のマウス ・ モデルは通常 AQP4 特異的 T 細胞および B 細胞の免疫を制御する免疫寛容のメカニズムについての詳細を学ぶように進化をし続けます。

AQP4 をターゲットとした中枢神経系の自己免疫の他のモデルも開発6,16,をされている28,29,30。各は、NMO の病態に関連する特定の側面を勉強のための利点があります。AQP4 特異的 T 細胞は、WT ラット6,16,29で識別されています。それら AQP4 特異的 T 細胞が自己免疫の中枢神経系の組織学的変化を引き起こされるが、マウスの観察と同様に、WT ラット AQP4 特異的 T 細胞が発生しない臨床病気の重要なサイン。したがって、WT マウスの T 細胞と B 細胞の AQP4 固有免疫応答を制限する耐性のメカニズム、ラットの運用も。関係なく、1 つは病気の病因に関与するメカニズムを研究するためのマウスモデルを使用しての力を過小評価しないでください。ノックアウト、トランスジェニックとレポーター マウスの富を有利にすることができます。また、自己免疫疾患のいくつかの基本的な発見は EAE マウスモデルを使用して行われたことを認識すべき。デモその T 細胞クローンの自己抗原のための特定することができます自己免疫疾患31,32, T 細胞共刺激が引き起こす自己免疫33の役割との発見の同定を仲介するなど、th17 細胞分化34発達経路は最初マウス EAE モデルを使用して記述されていた。私たちが開発した ATCA のマウスモデルを使用して、1 つになりました生体内で病原性の AQP4 特定の免疫反応の発展と規制を検討するための手段 NMO の病態に重要な洞察力を提供する必要があります。

開示事項

S. a. サガン、A. クルス エランス ・、c. m. スペンサー、PP の Ho、L. Steinman、A.J. グリーン、R.A. ソーベル開示報告なし。S. s. Zamvil は、神経学、神経免疫学、Neuroinflammationの副編集長で国際機関誌社会諮問委員会のメンバーであります。彼は臨床調査のジャーナル、免疫学ジャーナルおよび神経学的な科学のジャーナルの編集委員を務めて、国立衛生研究所の助成金審査委員会の創立会員をされています健康 (NIH) の臨床神経免疫と脳腫瘍 (CNBT) のセクションおよび国立多発性硬化症協会 (NMS) を検討します。彼はコンサルタントとして役立ったが、ビオゲン Idec、EMD Serono、ジェンザイム、ノバルティス、ジェネンテック/ロシュ、テバ製薬株式会社から謝礼金を受け取ったと務めてまたはデータ安全性モニタリング ・ ボードのリリー、BioMS、テバ、Opexa 治療を提供しています。現在、博士 Zamvil は、NIH、NMS、Maisin 財団、バイオジェンとセルジーンから研究助成金サポートを受け取ります。

謝辞

ガシーレンカージャパン ジャクソン慈善財団、Maisin 財団全国多発性硬化症協会 (RG 4768、RG 5179 と RG 5180) サポートは S.S.Z. に、国立衛生研究所 (RO1 AI073737、RO1 NS092835-01) によって提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
M. tuberculosis H37RaBD Difco231141Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's AdjuvantBD Difco263910
AQP4 peptide p135-153GenemedCustom SynthesisPeptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220GenemedCustom SynthesisPeptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55Genemed / AuspepCustom SynthesisPeptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way StopcockKimble420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized)GE Healthcare Life SciencesSH30071
Recombinant Mouse IL-23R&D Systems (BioTechne)1887-ML
Recombinant Mouse IL-6R&D Systems (BioTechne)406-ML
Recombinant Mouse IL-12R&D Systems (BioTechne)419-ML
Thymidine [Methyl-3H]PerkinElmerNET027
Glass Fiber FiltermatsPerkinElmer1450-421
Anti-mouse antibodieseBioscience (Affymetrix)[various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening PanelBD Biosciences557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell StainThermoFisher Scientific[various]
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlugBD Biosciences555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-AldrichP8139
Iomomycin (calcium salt)Sigma-AldrichI0634
Pertussis Toxin from B. pertussisList Biological Laboratories181
10% FormalinVWR89370-094
Variable-Flow Peristaltic PumpFisher Scientific13-876-2
Foam Biopsy Pads, RectangularFisher Scientific22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP)Henry Schein Animal Health050033NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)AkornNDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging PlatformHeidelberg Engineering

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