القضاء بسيطة من الأسفار الخلفية في أنسجة المخ البشري الفورمالين--الثابتة للفحص المجهري الفلورة

Summary

وكثيراً ما يعقد أوتوفلوريسسينسي الخلفية من العينات البيولوجية تقنيات التصوير القائم على الأسفار، لا سيما في الأنسجة بوستميتوتيك البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين. هذا البروتوكول ويصف كيف يمكن إزالة أوتوفلوريسسينسي من هذه العينات فعالية استخدام ضوء متاحة تجارياً التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي المصدر إلى فوتوبليتش العينة قبل إيمونوستينينج.

Abstract

الفلورة الطريقة شائعة المستخدمة لتصور المقصورات سوبسيلولار وتحديد إضفاء الطابع المحلي على بروتينات محددة داخل عينة أنسجة. عقبة كبيرة للحصول على صور ذات جودة عالية الفلورة أوتوفلوريسسينسي الذاتية للأنسجة سبب أصباغ الشيخوخة مثل ليبوفوسسين أو بعينه إعداد العمليات الشائعة مثل التثبيت ألدهيد. ويصف هذا البروتوكول كيف يمكن تخفيض fluorescence الخلفية إلى حد كبير من خلال استخدام الفوسفور الأبيض الضوء التي تنبعث منها صفائف صمام ثنائي (LED) قبل المعالجة مع تحقيقات الفلورسنت فوتوبليتشينج. واسعة الطيف انبعاث الفوسفور الأبيض المصابيح تسمح للتبييض من فلوروفوريس عبر مجموعة من الحدود القصوى للانبعاثات. جهاز فوتوبليتشينج يمكن بناؤها من المكونات الجاهزة تكلفة منخفضة جداً ويوفر بديلاً موجوداً على كوينتشيرس الكيميائية المتاحة تجارياً. فوتوبليتشينج ما قبل معالجة من الأنسجة تليها تلطيخ الفلورة التقليدية يولد الصور خالية من أوتوفلوريسسينسي الخلفية. مقارنة للمنشأة قوينتشيرس الكيميائية التي خفضت التحقيق، فضلا عن خلفية الإشارات العلاج فوتوبليتشينج قد أي تأثير على كثافة fluorescence التحقيق في حين أنها خفضت فعالية الفلورية الخلفية وليبوفوسسين. على الرغم من أن فوتوبليتشينج يتطلب المزيد من الوقت لما قبل المعالجة، يمكن استخدام صفائف الصمام كثافة أعلى للحد من الوقت فوتوبليتشينج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسيط يحتمل أن تكون لمجموعة متنوعة من الأنسجة، ولا سيما بوستميتوتيك الأنسجة التي تتراكم lipofuscin مثل الدماغ وعضلات القلب أو الهيكل العظمى.

Introduction

الأسفار مجهرية باستخدام الأجسام المضادة لاستهداف البروتينات المحددة يستخدم بشكل روتيني أن تصور البروتينات ذات الاهتمام في زراعة الخلايا والأنسجة. مضاعفات رئيسية للحصول على صور واضحة ونهائية في الفلورة هو أوتوفلوريسسينسي، الذي يمكن أن يكون سبب اندوجينوسلي في أنسجة الثدييات lipofuscin الصباغ العمر والبروتينات مثل الايلاستين والكولاجين^{1، 2}. ويمكن إدخال مصادر أخرى من أوتوفلوريسسينسي من خلال خطوات إعداد عينة مثل التثبيت ألدهيد³. حبيبات Lipofuscin، تتكون أساسا من البروتين أوكسيداتيفيلي المعدلة والدهن تدهور المخلفات، تتراكم في الخلايا الحية منذ فترة طويلة مع زيادة السن². هذا يسبب صعوبات في التصوير بوستميتوتيك الأنسجة مثل الدماغ وعضلات القلب أو الهيكل العظمى، كما طيف انبعاث fluorescence lipofuscin الواسع والمتغير، غالباً ما تتزامن مع الطول الموجي الانبعاثات من فلوروفوريس الشائعة المستخدمة تصنيف⁴. وهذه العوامل تجعل تصوير أنسجة المخ البشري من حالات الإصابة بأمراض الأعصاب أواخر ظهور مثل انحطاط فصي فرونتوتيمبورال (فتلد) لا سيما تحدي.

للحد من أوتوفلوريسسينسي، وضعنا أسلوب الذي نحن تشعيع أقسام الأنسجة محمولة على الشريحة مع ضوء أبيض التي تنبعث منها مجموعة صمام ثنائي (LED) باستخدام مصباح مكتب منزلية⁵. يوفر هذا الأسلوب بسيطة كبديل للتقنيات التي تستخدم كوينتشيرس الكيميائية مثل CuSO₄ في خلات الأمونيوم، أو المتاحة تجارياً تبريد الأصباغ مثل "السودان ب أسود" و "أسود اريوتشرومي ر"⁶. كما أنها أكثر فورات كبيرة متعددة الأطياف قيادة مصباح فوتوبليتشينج التقنيات ويتجنب المضاعفات والآثار المتولدة من طرق إزالة أوتوفلوريسسينسي الرقمية مثل الطيفية خلط الأمم المتحدة^7،8. الفوسفور الأبيض لها المصابيح أطياف الانبعاث، والإضاءة العالية والتصنيع منخفضة التكلفة، يجعلها مثالية كأحد مكونات جاهزة لمجموعة متنوعة من صباغات^5،9فوتوبليتشينج.

في هذا البروتوكول، تثبت بناء جهاز فوتوبليتشينج باستخدام مكونات موجوداً، وتطبيق فوتوبليتشينج على حالة الأنسجة فتلد المحتوية على تاو-إيجابية تضمينات (فتلد-T) باستخدام جسم محددة تاو فوسفوريلاتيد. نظهر تأثير فوتوبليتشينج على تصوير الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي توظيف اثنين من صباغات المستخدمة بشكل شائع: 488 أليكسا وتكساس الأحمر. أثر فوتوبليتشينج مقابل المقاطع غير المعالجة أو تلك التي تعامل مع تقضي المواد كيميائية تجارية كمياً والمقارنة. هذا فوتوبليتشينج قبل العلاج يمكن إدراجها في أي بروتوكول المصبوغة الفلورة القياسية لإزالة أوتوفلوريسسينسي في عينة بيولوجية.

Protocol

ملاحظة: إنجاز الأعمال المقدمة وفقا للمعايير الدولية المعترف بها، بما في ذلك "المؤتمر الدولي" في مواءمة (معنوي)، مجلس الدولية المنظمات للعلوم (الطبية) ، ومبادئ "إعلان هلسنكي". وكان استعمال الأنسجة البشرية بموافقة "مجلس أخلاقيات البحث شبكة الصحة جامعة". تم جمع عينات الدماغ البشري كجزء من بنك أنسجة الدماغ البحرية. في وقت جمع، وكان الحصول على الموافقة المستنيرة من جميع المرضى.

1-بناء جهاز فوتوبليتشينج والحلول

1. تحضير حلول الأسهم.
   1. 1 إعداد ل 1 × الأسهم تريس مخزنة المالحة (1 x TBS) الحل (150 مم كلوريد الصوديوم، 50 مم تريس-Cl، درجة الحموضة 7.4) بتذويب 8.77 ز من كلوريد الصوديوم وز 6.06 من تريس قاعدة في 800 مل ddH ₂ س وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 استخدام HCl. إحضار يصل حجم 1 لتر والاوتوكلاف.
   2. إعداد أزيد الصوديوم 10% (200 x الأسهم) بإذابة 1 غ أزيد الصوديوم في 10 مل من ddH ₂ س (10%، الأسهم 200 x)-
2. للشرائح الحجم القياسي، 1-3 استخدام طبق بيتري شفافة، ومربع واحد 100 × 100 مم كغرفة لشريحة. إنشاء دائرة شريحة واحدة، إضافة 0.25 مل أسهم أزيد الصوديوم x 200 إلى 50 مل x TBS 1 لجعل حل أزيد-تبس 0.05%. المكدس عمودياً على عملية شرائح إضافية الدوائر الشريحة 2-3. إعداد 50 مل إضافية لحل أزيد-تبس لكل دائرة.
3. إنشاء سقالة للارتقاء الغرفة (ق) الشريحة مثل احتواء رأس مصباح تحت. قص الفتحات في الجانبين 100 مم × 100 مم × 30 مم من البلاستيك الغذائي الحاوية والسفلي
   1. 100 ملم × 100 ملم الشريحة الدائرة، وعكس الحاوية. ضمان الفتحات الجانبية كبيرة بما يكفي احتواء مصدر ضوء LED وضمان فتح أسفل كبيرة بما يكفي أن يصل الضوء من مصدر الضوء إلى الدائرة بعينه دون عائق.
   2. تطبيق الشريط الكهربائية على سقالة لزيادة القبضة بين السقالة وعينه الدائرة/benchtop. استخدام أي مواد بديلة لبناء السقالة طالما أنه يرفع بشكل أمن الدائرة الشريحة دون إعاقة الضوء من الوصول إلى العينة-
4. إزالة أي الناشرون أو بلاستيك معتمة من مصباح مكتب التي قد تعيق الصمام الخفيفة من الوصول مباشرة إلى العينة (إذا أمكن) وتوجيه الصفيف الصمام صعودا. ضع سقالة والشريحة الغرفة (ق) أعلاه الصفيف الصمام. استخدام مصباح برقبة مرنة للتلاعب السهل.
تغطية
5. بناء قبة الانعكاسية للجهاز ببطانة داخل مربع كبيرة بما يكفي لتغطية الدائرة الشريحة والسقالة مع رقائق الألومنيوم. استخدم مربع تلميح ماصة 1 مل لدائرة واحدة أو من 150 مم × 150 مم × 150 الورق المقوى مم متعددة، عمودياً مكدسة الدوائر.

2. ما قبل المعالجة فوتوبليتشينج لأقسام الأنسجة

ملاحظة: إعداد قسم الأنسجة قد تختلف تبعاً للمصدر من الأنسجة وتثبيت وترسيخ الأساليب المستخدمة. هنا، تم إصلاح أنسجة المخ (جيري أوربيتوفرونتال) من حالة من فتلد-T ~ 2 يوما في الفورمالين، تشغيل من خلال تدرج سكروز والمضمنة في أكتوبر، وقص على 10 أقسام ميكرومتر سميكة كريوستات باستخدام-

غرفة

1. في 4 درجة مئوية الباردة، الباردة مجلس الوزراء، أو الثلاجة، توجيه المصباح تحت السقالة ووضع الدائرة عينة على السقالة. صب 50 مل من محلول أزيد-تبس في قاعة عينة-
أقسام الأنسجة سوبميرجي
2. شنت على الزجاج القياسية مجهر الشرائح في قاعة الشريحة التي تحتوي على أزيد-تبس استخدام الملقط نظيفة. لشرائح متعددة، وضمان أن يتم وضع الشرائح في قاعة في طبقة واحدة-
3. تغطي على الجهاز مع قبة العاكسة وتشغيل مصباح LED واحتضانها ح 48 في درجة مئوية 4-

3. الفلورة

1. بوصمة عار الأنسجة تاو فوسفوريلاتيد باستخدام كونتيرستاين DAPI واليكسا 488-والأجسام المضادة الثانوية مترافق "الأحمر تكساس"، أولاً بإعداد حلول لاسترجاع مستضد permeabilization وعرقلة، والابتدائية جسم ملزمة. المخزن المؤقت
   1. إعداد 500 مل من استرجاع مستضد (حمض الستريك 10 مم، 2 مم الإيثيلين حمض، 0.05% 20 توين؛ ودرجة الحموضة 6.2) بتذويب 0.92 غ حمض الستريك وز 0.37 حمض الإيثيلين (يدتا) في 500 مل من ddH ₂ O. ضبط درجة الحموضة إلى 6.2 مع هيدروكسيد الصوديوم وإضافة 0.25 مل 20 توين.
   2. إعداد 500 مل من 0.025% X-100 تريتون في حل تبس (TBS-تريتون) عن طريق إضافة مل 0.125 من Triton X-100 إلى 500 مل 1 × tbs.
   3. تحضير حلاً ألبومين المصل بقرى 1% (BSA) في تبس (جيش صرب البوسنة-تبس المخزن المؤقت) بتذويب ز 0.1 جيش صرب البوسنة في 10 مل tbs.
   4. إعداد حل حظر بإضافة 0.2 مل مصل الماعز العادي إلى 1.8 مل من 1% جيش صرب البوسنة/tbs.
   5. لكل شريحة، تعد 150 ميليلتر من جسم الابتدائي الحل (تخفيف 1: 100) من ميليلتر 1.5 بيبيتينج المضادة-والرمات-هوكي-تاو pSer202 + Thr205 الأجسام المضادة (AT8) في ميليلتر 148.5 1% جيش صرب البوسنة-تبس المخزن المؤقت وترك على مدت
2. لتنفيذ استرداد مستضد، تغرق الشرائح فوتوبليتشيد عمودياً في جامع شريحة التي تحتوي على 25 مل من المخزن المؤقت لاسترجاع مستضد. تأمين وجامع مع الشريط و/أو سلاسل مثل أن لا تقع المجمع في حوض ماء. الحرارة في المجمع في حمام مائي في 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة والسماح في مجمع لتبرد بدرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل إزالة الشرائح. هل عدم إزالة الشرائح الفور لأنها سوف تتسبب في الفروع لتجف.
نقل الشرائح من جامع استرجاع مستضد في جرة المصبوغة مليئة 30 مل تبس-تريتون
3. وتغسل الأجزاء لمدة 5 دقائق في شاكر مداري مع الهز لطيف. تكرار الغسيل مرة واحدة مع تريتون تبس الطازجة. الفتيل العازلة الزائدة بعيداً مع أنسجة خالية من الوبر ومخطط الأنسجة بقلم مسعور. الحرص على عدم السماح للشرائح تجف.
   1. لكل شريحة، كتلة الأنسجة التي بيبيتينج ميليلتر 200 من عرقلة الحل على الأنسجة ووضع الشريحة في دائرة هوميديفيد. بناء قاعة بوضع حامل شرائح داخل مربع تلميح ماصة تحتوي على منشفة ورقية رطبة. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 2 على سطح مستوى. التأكد من أن الحل حظر كامل يغطي الأنسجة.
4. إزالة الحل حظر بالطموح و "الماصة؛" 100-150 ميليلتر من محلول جسم الأولية على الأنسجة. التأكد من حجم كاف من جسم موجود وأن القسم على سطح مستو لتجنب تجميع حل جسم لجانب واحد. احتضان في درجة 4 مئوية بين عشية وضحاها في قاعة هوميديفيد-
5. إعداد خليط جسم الثانوية وكونتيرستين النووية DAPI.
   1. لكل شريحة، تعد 150 ميليلتر من خليط جسم الثانوي (تخفيف 1: 100) بإضافة 1.5 ميليلتر من الماعز المضادة الماوس 488 أليكسا و 1.5 ميليلتر من الماعز المضادة الماوس "الأحمر تكساس" إلى 147 ميليلتر من جيش صرب البوسنة-تبس وترك على مدت
   2. تحضير 0.1 ميكروغرام/مل DAPI كونتيرستين بإضعاف المسلسل. مزيج الحل الأسهم جيدا وتمييع 1 ميليلتر من الأسهم 5 ملغ/مل DAPI في 999 تبس جعل 1 مل من 5 ميكروغرام/مل محلول. لكل شريحة، يضعف 3 μL من 5 ميكروغرام/مل الحل مع 147 ميليلتر من TBS بتركيز نهائي من 0.1 ميكروغرام/ملليلتر-
      تنبيه: DAPI مطفر معروف وينبغي التعامل معها بحذر-
6. إزالة الأجسام المضادة الأولية بالطموح. غمر الشرائح في زجاج تلطيخ جرة تحتوي على 30 مل تريتون TBS والغسيل لمدة 5 دقائق مع خلط لطيف على شاكر مداري. كرر الخطوة يغسل مع تريتون تبس الطازجة. فتيلة تبس الزائدة بعيداً-تريتون و "الماصة؛" 100 إلى 150 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية لكل شريحة.
   1. ضمان الأنسجة مغطى تماما بخليط جسم. احتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة في قاعة هوميديفيد في الظلام-
7. إزالة الخليط جسم الثانوية بالطموح ونقل الشريحة في زجاج تلطيخ جرة تحتوي على 30 مل TBS (لا تريتون). المياه والصرف الصحي لمدة 5 دقائق مع خلط لطيف على شاكر مداري. كرر الخطوة يغسل مع tbs جديد. تنطبق 100 إلى 150 ميليلتر من 0.1 ميكروغرام/مل DAPI كونتيرستين على كل شريحة واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام-
8. نقل الشرائح إلى زجاج تلطيخ جرة تحتوي على TBS ويغسل 3 مرات مع خلط لطيف لمدة 5 دقائق كل، استخدام تبس الطازجة لكل غسل. المخزن المؤقت الزائدة بعيداً الفتيل.
9. تطبيق 3 قطرات من تصاعد المائية المتوسطة والأنسجة. استخدام الملقط، أقل بلطف ساترة زجاجية نظيفة على الأنسجة، بدءاً من حافة واحدة وخفض الحافة الأخرى لتجنب الملائمة لفقاعات الهواء ببطء. الحرص على عدم إزاحة ساترة إذا التصوير فورا. وبخلاف ذلك، تسمح المتوسطة المتصاعدة لتجف قبل تخزينها في 4 درجة مئوية في الظلام-

4. مجهر الأسفار

1. بدوره على مصباح الأسفار والمجهر وجهاز الكمبيوتر والسماح للمصباح الحارة ل 15 دقيقة مكان النسيج الملون الشرائح في مرحلة مجهر الأسفار. استخدام صورة مشرقة الحقل لتحديد موقع الأنسجة في التكبير x 10-
2. تطبيق قطره ddH ₂ س على السطح ساترة واستخدام عدسة هدف غمر مياه 20 x (NA = 1.0). حدد التفحص الطائرة متوسط 4-خط الإعداد. تعيين حجم الثقب 1 وحدة المشرقة التي تعطي شريحة ضوئية ~ 3 ميكرون. حدد موجات الإثارة وانبعاث الليزر لكل فلوروفوري في مسارين منفصلين لإشارة أفضل.
   ملاحظة: أليكسا 488: λ _ت = 488 نانومتر (الأرجون ليزر) λ _م = 493-570 نانومتر؛ تكساس الأحمر: λ _ت = 561 نانومتر (561 والعسف نانومتر الليزر)، λ _م = 601-635 نانومتر؛ DAPI: λ _ت = 405 نانومتر (405 صمام ثنائي ليزر)، λ _م = 410 507 نانومتر. ضبط السلطة الليزر
   1. والحصول على الإعدادات لتحسين كثافة إشارة لكل مسار. جمع صورة مركبة وحفظها. استخدام نفس إعدادات الليزر مقارنة كثافات fluorescence في شريحة مختلفة-
3. للتصور، من شدة الأسفار في كل قناة وتثبيت الماكرو الأدوات الشخصية RGB ل ImageJ ¹⁰. حفظ الماكرو من صفحة ويب كملف نصي (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). حدد من القائمة إيماجيج، الإضافات-> وحدات الماكرو-> تثبيت؛ حدد الملف النصي لتثبيت الأداة ملفات RGB. افتح ملف الصورة [كنفوكل] في إيماجيج
   1. وتحويل الصور المركبة من الكدسات 3 إلى RGB بالقيام بما يلي: صورة-> لون-> "أداة القناة". حدد " مركب " من القائمة المنسدلة والتحقق من جميع القنوات الثلاثة. ثم، حدد الصورة-> نوع-> لون RGB.
   حدد رمز أدوات الشخصية RGB
   2. ورسم خط عبر المقطع في أن يكون لمحة عن الصورة. حفظ كثافة البيانات كجدول بيانات للتآمر.

النتائج

يمكن إضافة في الخطوة ما قبل المعالجة فوتوبليتشينج لبروتوكول قياسي الفلورة فورا قبل استرداد antigen وإيمونوستينينج (الشكل 1A). الجمعية جهاز فوتوبليتشينج يمكن أن يؤديها أيضا استخدام مختلف مكونات رخيصة، والجاهزة للاستخدام (الشكل 1B). طيف انبعاث ?...

Discussion

يسمح بالمعالجة المسبقة فوتوبليتشينج للأنسجة الموصوفة في هذه المخطوطة للقضاء الفعلي على أوتوفلوريسسينسي باستخدام العناصر الجاهزة للاستخدام. وصف البروتوكول تصوير الفلورة المجاميع تاو فوسفوريلاتيد في أنسجة المخ البشري الفورمالين--الثابتة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق 488 ألي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Sodium Choloride	Sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric Acid	Caledon Laboratory Chemicals	1506656
Sodium Azide	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	All components of photobleacher can be substituted based on availability
6 W LED Dimmable Desk Lamp	DBPower	DS501	All components of photobleacher can be substituted based on availability
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Sodium Hydroxide	BioShop Canada	SHY700.1
Water bath	Haake Fisons	K15
Slide collector	FisherScientific	12-587-17B
Staining Jar	FisherScientific	E94
Orbital Shaker	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Bovine Serum Albumin	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting medium	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710
Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	Software accompanies the Confocal Microscope
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Commercial chemical quencher	Biotum	23007