פשוט חיסול רקע זריחה ברקמת המוח האנושי פורמלין-קבוע עבור מיקרוסקופ Immunofluorescence

Summary

הרקע autofluorescence של דגימות ביולוגיות לעיתים קרובות מסבך מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית טכניקות הדמיה, במיוחד ברקמות בגילאי postmitotic האנושית. פרוטוקול זה מתאר איך autofluorescence מן הדגימות ניתן להסיר ביעילות באמצעות אור זמינים מסחרית פליטת אור דיודה המקור photobleach המדגם לפני immunostaining.

Abstract

Immunofluorescence היא שיטה נפוצה כדי להמחיש תאים subcellular וכדי לקבוע הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים בתוך דגימת רקמה. מכשול גדול כדי הרכישה של תמונות באיכות גבוהה immunofluorescence הוא autofluorescence אנדוגני של הרקמה שנגרם על ידי פיגמנטים הזדקנות כגון lipofuscin או תהליכים הכנה מדגם נפוצים כגון קיבוע אלדהיד. פרוטוקול זה מתאר כיצד רקע זריחה יכול להיות הקטנו דרך photobleaching באמצעות אור זרחן לבן פולטות נורית led מערכים לפני הטיפול עם הגששים פלורסנט. רחבת ספקטרום הפליטה של זרחן לבן נוריות לאפשר הלבנת של fluorophores על פני טווח של פליטת פסגות. המנגנון photobleaching יכול להיות בנוי רכיבים מדף במחיר נמוך מאוד, ומציע אלטרנטיבה נגיש זמין מסחרית quenchers כימי. טיפול קדם photobleaching של הרקמה ואחריו immunofluorescence המקובלת מכתים יוצר תמונות חינם של הרקע autofluorescence. בהשוואה ל הוקמה quenchers כימיים אשר מופחת בדיקה, כמו גם רקע אותות, טיפול photobleaching לא היתה השפעה על עוצמת קרינה פלואורסצנטית בדיקה בעוד הוא ביעילות מופחת קרינה פלואורסצנטית הרקע ואת lipofuscin. למרות photobleaching דורשת יותר זמן לטיפול מראש, מערכים LED בעוצמה גבוהה יותר עשוי לשמש כדי לצמצם את זמן photobleaching. ניתן להחיל שיטה פשוטה זו פוטנציאל למגוון של רקמות, במיוחד postmitotic הרקמות שנצברים lipofuscin כמו המוח והשרירים לב או השלד.

Introduction

קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באמצעות נוגדנים מיקוד חלבונים ספציפיים משמש באופן שגרתי כדי להמחיש חלבונים עניין בתרבית תאים ורקמות. סיבוך הגדולות רכישת תמונות ברורה ומוחלטת ב- immunofluorescence הוא autofluorescence, אשר יכולה להיגרם endogenously בתרבית של רקמה על ידי lipofuscin פיגמנט של הגיל על ידי חלבונים כגון אלסטין וקולגן^{1, 2}. יכול להיות הציג את מקורות אחרים של autofluorescence הצעדים הכנה מדגם כגון אלדהיד קיבוע³. Lipofuscin בגרגרים, המורכבת בעיקר חלבון oxidatively שונה, השומנים השפלה ומשקעים, להצטבר בתאים חיים ארוך עם גיל מוגבר². גורם לקשיים הדמיה postmitotic רקמות כגון את המוח ואת הלב או השלד השרירים, כפי ספקטרום הפליטה זריחה של lipofuscin הינו רחב ומשתנה, לעיתים קרובות בד בבד עם אורך הגל פליטה של fluorophores נפוץ המשמש תיוג⁴. גורמים אלה לבצע הדמיה של רקמת המוח האנושי מפני מקרים של מחלות ניווניות בגיל מאוחר כמו ניוון frontotemporal אוני (FTLD) מאתגר במיוחד.

כדי לצמצם את autofluorescence, אנחנו המציאו טכניקה שבה אנחנו להאיר הסעיפים רקמות רכוב שקופיות עם אור לבן פולטות מערך דיודות (LED) באמצעות מנורת שולחן ביתי⁵. טכניקה פשוטה זו מספקת אלטרנטיבה טכניקות שמשתמשות quenchers כימיים כגון CuSO₄ אמוניום אצטט, או זמינים מסחרית שכבתה צבעי כגון סודאן שחור B ו- T שחורה Eriochrome⁶. יש לו גם יותר חסכוניים משמעותית מולטי ספקטריאליות הוביל המנורה photobleaching טכניקות ומונע סיבוכים וחפצי המופקים autofluorescence דיגיטלי שיטות להסרת כמו ספקטרלי ערבוב האו ם^7,8. זרחן לבן נוריות יש ספקטרום פליטה רחבה, עוצמת אור גבוהה עלות הייצור נמוך, הפיכתם ומהווה מרכיב מדף עבור photobleaching מגוון הן^5,9.

פרוטוקול זה, אנחנו מדגימים הקמת מנגנון photobleaching באמצעות רכיבי נגיש, photobleaching חלות על מקרה של רקמות FTLD המכיל הכללות טאו-חיוביות (FTLD-T) באמצעות של נוגדנים ספציפיים טאו phosphorylated. נדגים את השפעת photobleaching על הדמיה נוגדנים fluorescently התווית על-ידי העסקת שתי הנפוצות הן: אלקסה 488 ואדום טקסס. ההשפעה של photobleaching לעומת סעיפים שלא טופלו או כאלה שטופלו כ'חטיף כימי מסחרי לכמת, בהשוואה. טיפול קדם זה photobleaching שניתן לשלבן בכל פרוטוקול מוכתמים immunofluorescence סטנדרטי להסרת autofluorescence דגימה ביולוגית.

Protocol

הערה: העבודות שהוצגו נעשו בהתאם שזוהה בסטנדרטים בינלאומיים, הכולל את הכנס הבינלאומי על משלים (ICH), המועצה עבור הבינלאומי ארגוני של רפואי מדעי (CIOMS) , ואת עקרונות הצהרת הלסינקי. השימוש רקמה אנושית היה באישור דירקטוריון האתיקה של המחקר רשת בריאות האוניברסיטה. הדגימות המוח האנושי נאספו במסגרת של הבנק הימי של רקמות המוח. בזמנו של אוסף, הושגה הסכמה מדעת מחולים כל.

1-בניית פתרונות של המנגנון photobleaching

1. פתרונות מניות הכן.
   1. להכין 1 L 1 x מניות באגירה טריס תמיסת מלח (1 x TBS) פתרון (150 מ"מ NaCl, 50 מ מ טריס-קלרנית, pH 7.4) על ידי המסת 8.77 g של NaCl ו- g 6.06 של טריס בסס 800 מיליליטר ddH ₂ O ולהתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות HCl. הביאו את עוצמת הקול 1 ליטר, תא לחץ. < / li >
   2. להכין אזיד הנתרן 10% (200 x מניות) על ידי המסת 1g של אזיד הנתרן ב- 10 מ"ל של ddH ₂ O (10%, מניות 200 x).
2. 1-3 שקופיות בגודל סטנדרטי, לשימוש יחיד 100 מ"מ x 100 מ"מ שקוף, מרובע פטרי כמו תא שקופיות. עבור חדר שקופית בודדת, להוסיף 0.25 mL של מניות של אזיד הנתרן x 200 50 מ של x TBS 1 כדי להפוך פתרון אזיד-TBS 0.05%. מחסנית 2-3 שקופיות צ'יימברס אנכית כדי לעבד שקופיות נוספות. להכין של 50 מ ל נוספים של אזיד-TBS פתרון עבור כל תא.
3. צור לפיגום כדי לרומם את chamber(s) שקופיות כזה ראש המנורה יכולה להתאים מתחת.
   1. עבור 100 מ"מ x 100 מ"מ שקופית קאמרית, לחתוך פתחים התחתון ואת צדי 100 מ"מ x 100 מ"מ x מיכל מזון ממ פלסטיק 30 ו היפוך המכולה. להבטיח הפתחים בצד הם גדולים מספיק כדי להתאים מקור אור LED ולהבטיח הפתח התחתון הוא מספיק גדול כזה אור מקור האור מגיע תא הדגימה ללא מכשול.
   2. חלות איזולירבנד לגרדום כדי להגדיל את האחיזה בין לגרדום את הדגימה הקאמרית/benchtop. להשתמש בחומרים אלטרנטיביים מכל לבנות בפיגומים. כל עוד זה מעלה בצורה מאובטחת תא שקופית ללא הפגיעה האור מלהגיע המדגם.
4. להסיר מנורת השולחן עשוי לעכב את נורית ה-LED מלהגיע ישירות את המדגם, (במידת האפשר), אוריינט המערך LED כלפי מעלה כל רשתות ומפזרים או פלסטיק אטומה. מניחים את chamber(s) לגרדום והחלק מעל המערך LED. להשתמש מנורה עם צוואר גמיש עבור טיפול קל.
5. לבנות כיפה רפלקטיביים לחפות המנגנון על ידי רירית בתוך קופסה גדולה מספיק כדי לכסות את השקופית קאמרית לגרדום ברדיד אלומיניום. השתמש בתיבה עצה פיפטה 1 מ"ל תא יחיד או של 150 מ"מ x 150 מ"מ x קופסת קרטון מ מ 150 למרובים, אנכית מוערמים צ'יימברס.

2. טיפול קדם Photobleaching סעיפים רקמת

הערה: הכנה בסעיף רקמות עשויים להשתנות בהתאם המקור של רקמות, קיבוע, הטמעה השיטות. כאן, רקמת מוח (orbitofrontal gyri) ממקרה של FTLD-T היה קבוע ~ 2 ימים בפורמלין, לרוץ דרך מעבר הדרגתי סוכרוז, המוטבעות OCT, ולחתוך 10 מיקרומטר עבה למקטעים באמצעות cryostat.

1. קר ºC 4 חדרים, הקבינט קר או מקרר, אוריינט המנורה מתחת לגרדום ולמקם תא הדגימה על הגרדום. שופכים 50 מ של אזיד-TBS פתרון לתוך תא הדגימה.
2. Submerge רקמות מקטעים רכוב על שקופיות מיקרוסקופ רגיל זכוכית אל החדר השקופית המכילה אזיד-TBS באמצעות מלקחיים נקי. עבור שקופיות מרובות, ודא כי השקופיות ממוקמים בבית הבליעה בשכבה אחת.
3. מכסים את המנגנון עם הכיפה רפלקטיביים, להדליק את מנורת LED, תקופת דגירה של 48 שעות-4 ºC.

3. Immunofluorescence

1. כדי להכתים את הרקמה phosphorylated טאו באמצעות דאפי counterstain ו אלקסה 488 - רד טקסס מצומדת נוגדנים משניים, להכין תחילה פתרונות אחזור אנטיגן, permeabilization, חסימה של ראשי כריכת נוגדן. מאגר
   1. להכין 500 מל אנטיגן ההחזרה (10 מ מ חומצת לימון, חומצה ethylenediaminetetraacetic 2 מ מ, 0.05% Tween 20; pH 6.2) על ידי המסת 0.92 g של חומצה ציטרית ו- 0.37 g ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) 500 מ"ל של ddH ₂ O. התאם ה-pH כדי 6.2 עם NaOH ולהוסיף 0.25 mL Tween 20-
   2. הכנת 500 מ"ל של 0.025% טריטון X-100 בתמיסה TBS (TBS-Triton) על-ידי הוספת מ ל 0.125 של טריטון X-100 500 מ ל 1 x TBS.
   3. הכן פתרון 1% אלבומין שור (BSA) ב- TBS (BSA-TBS מאגר) על ידי המסת 0.1 g BSA ב 10 מ"ל TBS.
   4. להכין פתרון חסימה על-ידי הוספת 0.2 מ של עז נורמלית בסרום 1.8 מ של 1% BSA/TBS.
   5. עבור כל שקופית, להכין µL 150 של נוגדן ראשוני פתרון (דילול מטריים) על-ידי pipetting 1.5 µL pSer202 אנטי-פוספו-PHF-טאו + Thr205 (AT8) נוגדן לתוך µL 148.5 של 1% BSA-TBS מאגר ולהשאיר על קרח
2. כדי לבצע אחזור אנטיגן, להטביע את השקופיות photobleached אנכית אספן השקופית המכילה 25 מ של אנטיגן אחזור מאגר. לאבטח האספן עם הקלטת ו/או מחרוזות כך האספן לא נופל לתוך האמבט במים. מחממים האספן באמבט מים-90 ºC למשך 30 דקות ולאפשר האספן להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני הסרת את השקופיות. האם לא להסיר השקופיות באופן מיידי כפי שהוא יגרום הסעיפים להתייבש.
3. להעביר את השקופיות האספן אחזור אנטיגן לתוך צנצנת מכתימים מלא עם 30 מ של TBS-טריטון ולשטוף הסעיפים למשך 5 דקות על תפקודי לב / נשימה עם טלטול עדין. חזור על לשטוף את פעם אחת עם TBS טריים-טריטון. הפתיל מאגר עודף משם עם רקמת נטולת מוך, המתאר הרקמה עם עט הידרופובי. . שמור על עצמך לא לתת את השקופיות להתייבש.
   1. עבור כל שקופית, חסום את הרקמה pipetting µL 200 של חסימת פתרון אל הרקמה ולמקם את השקופית בתוך תא humidified. בנו התא על-ידי הצבת ארון שקופיות בתוך קופסא עצה פיפטה המכיל מגבת נייר רטובה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים על משטח הרמה. ודאו כי הפתרון חסימה מלאה מכסה הרקמה.
4. להסיר את הפתרון חסימה על ידי השאיפה, pipette µL 100-150 של נוגדן ראשוני פתרון אל הרקמה. ודא נפח מספיק של נוגדן קיים בסעיף על משטח רמת להימנע איגום של נוגדן פתרון לצד אחד. דגירה-ºC 4 לילה ב תא humidified.
5. להכין לתערובת נוגדנים משניים counterstain הגרעין של דאפי.
   1. עבור כל שקופית, להכין µL 150 תערובת נוגדנים משניים (בטחונות דילולים) על-ידי הוספת µL 1.5 של עז אנטי עכבר אלקסה 488 µL 1.5 של עז העכבר נגד טקסס אדומה µL 147 של BSA-TBS, להשאיר על קרח
   2. הכנת 0.1 µg/mL דאפי counterstain על ידי דילול טורי. לערבב את הפתרון מניות ביסודיות, לדלל 1 µL של מניות 5 מ"ג למ"ל דאפי ב 999 של TBS לעשות 1 מ"ל של 5 פתרון µg/mL. עבור כל שקופית, לדלל ממוצע 3L של פתרון µg/mL 5 עם µL 147 של TBS כדי ריכוז סופי של 0.1 µg/mL.
      התראה: דאפי היא מוטגן ידוע ויש לטפל בזהירות.
6. להסיר את הנוגדן העיקרי על ידי השאיפה. להטביע את השקופיות בכוס מכתימה את הצנצנת המכילה 30 מ של TBS-טריטון ושטוף במשך חמש דקות עם ערבוב עדין על תפקודי לב / נשימה. חזור על השלב לשטוף עם TBS טריים-טריטון. לפתיל משם עודף TBS-טריטון, פיפטה 100 עד 150 µL של נוגדנים משניים תערובת לכל שקופית.
   1. ודא הרקמה מכוסה במלואה על ידי התערובת נוגדן. תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר בבית הבליעה humidified בחושך.
7. להסיר את התערובת נוגדנים משניים על ידי השאיפה ולהעביר את השקופית לתוך כוס מכתימה את הצנצנת המכילה 30 מ של TBS (אין Triton). רחץ במשך חמש דקות עם ערבוב עדין על תפקודי לב / נשימה. חזור על השלב לשטוף עם TBS. טריים להחיל 100 עד 150 µL של 0.1 µg/mL דאפי counterstain כל שקופית, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
8. להעביר את השקופיות כוס מכתימה את הצנצנת המכילה TBS ולשטוף 3 פעמים עם ערבוב עדין למשך 5 דקות כל אחד, באמצעות TBS טריים עבור כל כביסה. מאגר עודף משם וויק.
9. להחיל 3 טיפות של הרכבה מימית בינוני לרקמות. באמצעות מלקחיים, והורד בעדינות coverslip זכוכית נקי אל הרקמה, מתחיל עם קצה אחד והורדת לאט לקצה השני כדי להימנע לכידה של בועות אוויר. לטפל לא כדי לסלק את coverslip אם הדמיה באופן מיידי. אחרת, לאפשר המדיום הרכבה להתייבש לפני אחסון ב- 4 ºC בחושך.

4. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

1. התור על המנורה פלורסצנטיות, המיקרוסקופ למחשב ולאפשר את המנורה לחמם עד 15 דקות במקום הרקמה מוכתם שקופיות על הבמה מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. להשתמש בתמונה שדה בהיר כדי לאתר את הרקמה בהגדלה x 10-
2. להחיל טיפת ddH ₂ O השטח coverslip ולהשתמש עדשה המטרה 20 x טבילה במים (NA = 1.0). בחר את הסריקה המטוס בממוצע ארבע שורות הגדרת. הגדר את גודל חריר 1 יחידה אוורירי נותן פרוסה אופטי של ~ 3 מיקרון. בחר לייזר עירור, פליטה אורכי הגל עבור כל fluorophore מסלולים נפרדים עבור האות הטוב ביותר.
   הערה: אלקסה 488: λ _ex = λ 488 ננומטר (לייזר ארגון) _em = 493-570 ננומטר; טקסס אדום: λ _ex = 561 nm (DPSS 561 ננומטר לייזר), λ _em = 601-635 ננומטר; דאפי: λ _ex = 405 ננומטר (405 דיודת לייזר), λ _em = 410-507 ננומטר.
   1. להתאים את עוצמת הלייזר ולהשיג הגדרות כדי למטב את עוצמת האות של כל רצועה. לאסוף תמונה מורכבת ולשמור. להשתמש באותן הגדרות לייזר כדי להשוות עוצמות קרינה פלואורסצנטית בשקופית שונה.
3. עבור ויזואליזציה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית בכל אחד מהערוצים, להתקין את המאקרו כלים פרופיל RGB ImageJ ¹⁰. לשמור את המאקרו של דף האינטרנט כקובץ טקסט (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). מתפריט ' ImageJ ', בחר תוספים - > מאקרו - > להתקין; בחר את קובץ הטקסט כדי להתקין את הכלי פרופילי RGB.
   1. לפתוח את קובץ התמונה קונאפוקלית ב ImageJ ו להמיר את התמונות ללא הפרדות צבע הערימות 3 ל- RGB על-ידי ביצוע הפעולות הבאות: תמונה - > צבע - > ערוץ כלי. בחר " ללא הפרדות צבע " מתוך התפריט הנפתח ולבדוק כל שלושה ערוצי. לאחר מכן, בחר תמונה - > סוג - > צבע RGB.
   2. בחר בסמל כלים פרופיל RGB, לצייר קו לרוחב החלק בתמונה כדי להיות מתועדים. לשמור את נתוני עוצמת כגיליון להתוויה.

תוצאות

ניתן להוסיף שלב טרום טיפול photobleaching פרוטוקול סטנדרטי immunofluorescence מייד לפני אחזור אנטיגן ו- immunostaining (איור 1 א'). הרכבה של המנגנון photobleaching ניתן גם לבצע שימוש שונים, רכיבים זולים, מדף (איור 1B). ספקטרום הפליטה של זרחן לבן נוריות מכסה מגוון רחב של אור...

Discussion

הטיפול מראש photobleaching של רקמות תיאר כתב יד זה מאפשר לחיסול יעיל של autofluorescence באמצעות רכיבי מדף. הפרוטוקול מתאר immunofluorescence הדמיה של טאו phosphorylated אגרגטים ברקמת המוח האנושי פורמלין-קבוע באמצעות נוגדנים משניים מצומדת 488 אלקסה, רד טקסס, עם דאפי כמו גרעיני counterstain. כדי להחיל את השיטה על רקמות אחרות, אנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Sodium Choloride	Sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric Acid	Caledon Laboratory Chemicals	1506656
Sodium Azide	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	All components of photobleacher can be substituted based on availability
6 W LED Dimmable Desk Lamp	DBPower	DS501	All components of photobleacher can be substituted based on availability
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Sodium Hydroxide	BioShop Canada	SHY700.1
Water bath	Haake Fisons	K15
Slide collector	FisherScientific	12-587-17B
Staining Jar	FisherScientific	E94
Orbital Shaker	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Bovine Serum Albumin	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting medium	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710
Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	Software accompanies the Confocal Microscope
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Commercial chemical quencher	Biotum	23007