Simple élimination de Fluorescence de fond dans les tissus cérébraux humains fixés au formol pour la microscopie en Immunofluorescence

Résumé

Arrière-plan autofluorescence des échantillons biologiques complique souvent basés sur la fluorescence des techniques d’imagerie, en particulier dans les tissus de postmitotiques humains âgés. Ce protocole décrit comment l’autofluorescence de ces échantillons peut être efficacement enlevé avec une lampe disponible dans le commerce, émettant une lumière diode source vers photobleach l’échantillon avant immunostaining.

Résumé

Immunofluorescence est une méthode couramment utilisée pour visualiser les compartiments subcellulaires et déterminer la localisation des protéines spécifiques au sein d’un échantillon de tissu. Un grand obstacle à l’acquisition d’images de haute qualité immunofluorescence est endogène autofluorescence des tissus causés par des pigments de vieillissement tels que de lipofuscine ou par des procédés de préparation échantillon commun comme la fixation de l’aldéhyde. Ce protocole décrit comment la fluorescence de fond peut être considérablement réduit par le biais de photoblanchiment de l’utilisation de phosphore blanc luminescent baies de diode électroluminescente (del) avant le traitement avec des sondes fluorescentes. L’émission à large spectre de phosphore blanc LED permettre pour la décoloration des fluorophores dans un éventail de pics d’émission. L’appareil de photoblanchiment peut être construits à partir des composants sur étagère à très bas prix et offre une alternative accessible aux extincteurs chimiques disponibles dans le commerce. Un prétraitement de photoblanchiment du tissu suivi classique immunofluorescence souillant génère des images sans fond autofluorescence. Par rapport à mis en place des extincteurs chimiques qui réduit la sonde comme arrière-plan signale, photoblanchiment traitement n’a eu aucun effet sur l’intensité de fluorescence sonde alors qu’elle a effectivement réduit fluorescence de fond et de lipofuscine. Bien que photoblanchiment nécessite plus de temps pour le prétraitement, supérieur intensité LED tableaux peuvent servir à réduire le temps de photoblanchiment. Cette méthode simple peut potentiellement être appliquée à une variété de tissus, tissus particulièrement mitotiques qui s’accumulent lipofuscine tels que le cerveau et les muscles cardiaques ou squelettiques.

Introduction

La microscopie de fluorescence en utilisant des anticorps ciblant les protéines spécifiques est régulièrement utilisée pour visualiser les protéines d’intérêt dans la culture de cellules et de tissus. Une complication majeure à l’acquisition des images claires et définitives en immunofluorescence est autofluorescence, qui peut être causée endogène dans les tissus de mammifères de la lipofuscine de pigment d’âge et de protéines telles que l’élastine et du collagène^{1, 2}. Autres sources d’autofluorescence peuvent être introduits par étapes de préparation d’échantillon comme aldéhyde fixation³. Granules de lipofuscine, composés essentiellement de protéines modifiées par oxydation et résidus de dégradation des lipides, s’accumulent dans les cellules longue durée de vie accrue âge². Cela provoque des difficultés dans l’imagerie des tissus postmitotiques comme le cerveau et les muscles cardiaques ou squelettiques, comme le spectre d’émission de fluorescence de lipofuscine est large et variable, qui coïncide souvent avec la longueur d’onde d’émission des fluorophores courants utilisés pour ⁴l’étiquetage. Ces facteurs rendent l’imagerie des tissus cérébraux humains provenant de cas de maladies neurodégénératives tardives comme la dégénérescence lobaire fronto-temporale (FTLD) particulièrement difficile.

Pour réduire l’autofluorescence, nous avons mis au point une technique dans laquelle nous irradier les sections de tissu monté sur glissière avec une lumière blanche émettant réseau de diodes (LED) à l’aide d’une lampe de bureau domestique⁵. Cette technique simple fournit une alternative aux techniques qui utilisent des extincteurs chimiques telles que CuSO₄ dans l’acétate d’ammonium, ou disponible dans le commerce de trempe des colorants tels que le Soudan noir B et noir d’ériochrome T⁶. Il dispose également d’importante économies sur multispectral conduit techniques de photoblanchiment de lampe et évite les complications et les objets générés à partir des méthodes d’épilation autofluorescence numérique comme spectrale non mélange^7,8. Phosphore blanc LEDs ont un large spectre d’émission, une haute luminosité et un coût de fabrication faible, ce qui les rend idéales comme une composante standard de photoblanchiment une variété de chromophores^5,9.

Dans ce protocole, nous démontrer la construction d’un appareil de photoblanchiment utilisant des composants accessibles et appliquent le photoblanchiment à un cas de tissu FTLD contenant des inclusions tau-positive (FTLD-T) à l’aide d’un anticorps spécifique de la protéine tau phosphorylée. Nous démontrons l’effet de photoblanchiment sur l’imagerie des anticorps fluorescent marqués employant deux chromophores couramment utilisés : Alexa 488 et Texas Red. L’effet de photoblanchiment versus sections non traitées ou ceux traités avec un extincteur chimique commercial sont quantifiés et comparés. Ce prétraitement photobleaching peut être incorporé à n’importe quel protocole de coloration standard immunofluorescence pour enlever l’autofluorescence dans un échantillon biologique.

Protocole

Remarque : le travaux présenté ont été réalisés en conformité avec les normes internationales reconnues, y compris la Conférence internationale sur l’harmonisation (CIH), le Conseil des organisations internationales des Sciences médicales (CIOMS) et les principes de la déclaration d’Helsinki. Utilisation de tissus humains a été avec l’approbation du University Health Network Research Ethics Board. Le cerveau humain ont été échantillonnés dans le cadre de la Banque de tissus de cerveau Maritime. Au moment de la collecte, le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients.

1. construction d’appareils de photoblanchiment et solutions

1. préparation des solutions mères.
   1. Préparer 1 L de solution stock tampon Tris salin (1 x TBS) (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) en dissolvant 8,77 g de NaCl et 6,06 g de Tris 1 x base dans 800 mL de ddH ₂ O et ajuster le pH à 7.4 à l’aide de HCl. amener le volume à 1 L et autoclave. < / Li >
   2. préparer l’azoture de sodium 10 % (stock de 200 x) dissoudre 1 g de l’azide de sodium dans 10 mL de ddH ₂ O (10 %, stock 200 x).
2. Pour les lames de 1-3 de taille standard, utiliser un seul 100 x 100 mm transparent, carré Pétri comme une chambre de la diapositive. Pour une chambre seule diapositive, ajouter 0,25 mL de 200 actions de l’azoture de sodium x à 50 mL de 1 x TBS pour faire une solution d’azoture-TBS de 0,05 %. Empiler les 2-3 chambres de glisser verticalement pour traiter des diapositives supplémentaires. Préparer une supplémentaire 50 mL de solution d’azoture-TBS pour chaque chambre.
3. Créer un échafaudage pour élever les glissière ou des chambres, telle qu’une tête de la lampe peut s’adapter sous. Chambre de diapositive
   1. pour un 100 mm x 100 mm, découper des ouvertures dans le fond et les côtés d’un 100 mm x 100 mm x 30 mm en plastique alimentaire contenant et renverser le conteneur. S’assurer que les ouvertures latérales sont assez grands pour s’adapter à une source lumineuse de LED et de garantir l’ouverture inférieure est assez grand, telles que la lumière de la source lumineuse atteigne le compartiment de mesure sans entrave.
   2. Appliquer du ruban adhésif électrique à l’échafaud pour augmenter l’adhérence entre l’échantillon chambre/portatifs et d’établi l’échafaud. Utiliser des matériaux alternatifs pour construire l’échafaud tant qu’il élève solidement la chambre diapositive sans empêcher la lumière d’atteindre l’échantillon.
4. Retirer des diffuseurs ou plastique opaque de la lampe de bureau qui peut entraver la lumière LED de parvenir directement à l’échantillon (si possible) et orienter la matrice de LED vers le haut. Placer l’échafaudage et la faire glisser ou des chambres au-dessus de la matrice de LED. Utiliser une lampe avec un cou flexible pour une manipulation facile.
5. Construire un dôme réfléchissant couvre pour l’appareil de doublure à l’intérieur d’une zone assez large pour couvrir la chambre diapositive et échafaudage avec du papier aluminium. Utilisez une boîte de pointe de pipette de 1 mL pour une seule chambre ou un 150 mm x 150 mm x 150 mm carton multiples, verticalement empilés chambres.

2. Photoblanchiment prétraitement des sections de tissu

Remarque : préparation du tissu section peut varier selon la provenance du tissu et fixation et incorporation des méthodes utilisées. Ici, les tissus cérébraux (orbitofrontal gyri) d’un cas de FTLD-T a été fixé pour environ 2 jours dans du formol, traversent un gradient de sucrose, incorporé en OCT et couper à 10 µm de coupes épaisses à l’aide d’un cryostat.

1. Froid ° c dans un 4 chambre, armoire froide ou réfrigérateur, orienter la lampe sous l’échafaud et placer la chambre de mesure sur l’échafaud. Verser 50 mL de solution d’azoture-TBS dans le compartiment de mesure.
2. Des sections de tissu Submerge monté sur lames de microscope standard verre dans la chambre de la diapositive contenant l’azoture-TBS avec une pincette propre. Pour plusieurs diapositives, assurez-vous que les lames soient placés dans la chambre sur une seule couche.
3. Couvrir l’appareil avec la coupole réfléchissante, allumez la lampe LED et incuber pendant 48 h à 4 ° c.

3. Immunofluorescence

1. à tacher le tissu pour la protéine tau phosphorylée utilisant contre-colorant DAPI et Alexa 488 - et anticorps secondaires conjugué Texas Red, d’abord préparer des solutions pour la recherche d’antigène, perméabilisation, blocage et primaire liaison de l’anticorps. Tampon de
   1. préparer 500 mL de recherche d’antigène (acide citrique 10 mM, 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique, 0,05 % Tween 20 ; pH 6.2) en dissolvant 0,92 g d’acide citrique et 0,37 g de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans 500 mL de ddH ₂ O. ajuster le pH 6.2 avec NaOH et ajouter 0,25 mL de Tween 20.
   2. Préparer 500 mL de 0.025 % X-100 Triton dans la solution du SCT (SCT-Triton) en ajoutant 0,125 mL de Triton X-100 à 500 mL 1 x directives du SCT.
   3. Préparer une solution de 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) au SCT (tampon BSA-TBS) dissoudre 0,1 g de BSA dans 10 mL de directives du SCT.
   4. Préparer une solution de blocage en ajoutant 0,2 mL de sérum de chèvre normal à 1,8 mL de 1 % BSA/directives du SCT.
   5. Pour chaque diapositive, préparer 150 µL de solution d’anticorps primaire (dilution 1 : 100) en pipettant : 1,5 l d’anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) anticorps dans 148,5 µL de 1 % BSA-TBS tampon et laisser sur glace
2. Pour effectuer la recherche d’antigène, submerger les diapositives photobleached verticalement dans un collecteur de diapositive contenant 25 mL de tampon d’extraction antigène. Fixer le collecteur avec du ruban et/ou chaînes telles que le collecteur ne tombe pas dans l’eau du bain. Chauffer le collecteur dans un bain d’eau à 90 ° c pendant 30 min et laisser le collecteur refroidir à température ambiante pendant 30 min avant de retirer les lames. Ne supprimez pas les diapositives immédiatement car il provoquera les sections à se dessécher.
3. Transférer les lames du collecteur de récupération de l’antigène dans un pot de coloration contenant 30 mL de SCT-Triton et laver les sections pendant 5 min dans un agitateur orbital avec agitant doucement. Répéter le lavage une fois avec frais de SCT-Triton. Évacue l’excès de tampon à l’extérieur avec un chiffon non pelucheux et contournez le tissu avec un stylo hydrophobe. Prendre soin de ne pas pour laisser les diapositives à sécher.
   1. Pour chaque diapositive, bloquer le tissu par pipetage 200 µL de solution sur le tissu de blocage et placez la lame dans une chambre humidifiée. Aménager la chambre en plaçant une grille coulissante à l’intérieur d’une boîte de pointe de pipette contenant une serviette de papier humide. Incuber à température ambiante pendant 2 h sur une surface plane. S’assurer que la solution de saturation couvre entièrement le tissu.
4. Enlever la solution de saturation par aspiration et distribuer 100-150 µL de solution d’anticorps primaire sur le tissu. Assurer un volume suffisant d’anticorps est présent et que la section est sur une surface plane afin d’éviter la mise en commun de la solution d’anticorps d’un côté. Incuber à 4 ºC pendant la nuit dans une chambre humidifiée.
5. Préparer le mélange de l’anticorps secondaire et le contre-colorant nucléaire DAPI.
   1. Pour chaque diapositive, préparer 150 µL du mélange d’anticorps secondaire (dilution au 1/100) en ajoutant 1,5 µL de chèvre anti-souris Alexa 488 et 1,5 µL de chèvre anti-souris Texas Red à 147 µL de BSA-TBS et laisser sur la glace.
   2. Prepare 0,1 µg/mL DAPI contre-coloration par dilution en série. Bien mélanger la solution étalon et diluer 1 µL de stock 5 mg/mL DAPI dans 999 du SCT pour faire 1 mL de 5 µg/mL de solution. Pour chaque diapositive, diluer 3 µL de 5 µg/mL de solution avec 147 µL du SCT à une concentration finale de 0,1 µg/mL.
      ATTENTION : DAPI est un mutagène connu et doit être manipulé avec soin.
6. Enlever l’anticorps primaire par aspiration. Plonger les lames dans un verre de coloration jar contenant 30 mL de SCT-Triton et lavage pendant 5 min avec un mélange doux dans un agitateur orbital. Répétez l’étape de lavage avec frais de SCT-Triton. Mèche extérieur excédentaire du SCT-Triton et distribuer 100 à 150 µL du mélange d’anticorps secondaire à chaque diapositive.
   1. S’assurer que le tissu est entièrement couvert par le mélange d’anticorps. Incuber pendant 2 h à température ambiante dans la chambre humidifiée dans le noir.
7. Enlever le mélange d’anticorps secondaire par aspiration et transférer la lame dans un verre à coloration jar contenant 30 mL du SCT (aucun Triton). Laver pendant 5 min avec un mélange doux dans un agitateur orbital. Répéter l’étape de lavage avec frais SCT. déposer 100 à 150 µL de contre-colorant DAPI 0,1 µg/mL dans chaque diapositive et incuber pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
8. Transférer les diapositives à un verre bocal contenant du SCT de coloration et laver 3 fois avec un mélange doux de 5 min chacun, à l’aide du SCT frais pour chaque lavage. Excès loin de tampon mèche.
9. Appliquer 3 gouttes de milieu de montage aqueux pour le tissu. À l’aide de pinces, abaissez doucement une lamelle de verre propre sur le tissu, en commençant par un bord et abaisser lentement l’autre bord pour éviter le piégeage de bulles d’air. Prendre soin de ne pas pour déloger la lamelle si imagerie immédiatement. Sinon, laisser sécher avant de les stocker à 4 ° c dans l’obscurité, le milieu de montage.

4. La microscopie en fluorescence

1. tournant sur la lampe à fluorescence, le microscope et l’ordinateur et laisser réchauffer pendant 15 min. Place le tissu taché les lames dans le stade de microscope de fluorescence de la lampe. L’image du champ lumineux permet de localiser le tissu à un grossissement de 10 x.
2. Une goûte de ddH ₂ O à la surface de la lamelle couvre-objet et utilisez un objectif d’immersion de l’eau 20 x (NA = 1,0). Sélectionnez le scan de plan moyen 4 lignes définissant. Définir la taille de trou d’épingle à 1 unité aérée qui donne une tranche optique de ~ 3 microns. Choisissez les laser d’excitation et d’émission longueurs d’onde pour chaque fluorophore dans des pistes séparées pour la meilleure qualité de signal.
   NOTE : Alexa 488 : λ _ex = 488 nm (laser à l’argon) λ _em = 493-570 nm ; Texas Red : λ _ex = 561 nm (laser de DPSS 561 nm), λ _em = 601-635 nm ; DAPI : λ _ex = 405 nm (laser Diode 405), λ _em = 410-507 nm.
   1. Régler la puissance du laser et réglages pour optimiser l’intensité du signal pour chaque piste de gain. Collecter l’image composite et sauver. Utiliser les mêmes paramètres de laser pour comparer les intensités de fluorescence dans une diapositive différente.
3. Pour la visualisation de l’intensité de la fluorescence dans chaque canal, installer la macro d’outils profil RVB pour ImageJ ¹⁰. Enregistrez la macro à partir de la page Web comme un fichier texte (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Dans le menu de ImageJ, sélectionnez Plugins - > Macros - > installer ; Sélectionnez le fichier texte pour installer l’outil de profils RVB.
   1. Ouvrir le fichier image confocale dans ImageJ et convertir les images composites depuis les 3 piles en RVB en procédant comme suit : Image - > Color - > outil de canal. Sélectionnez " Composite " depuis le menu déroulant et vérifier tous les trois canaux. Puis, sélectionnez Image - > Type - > couleur RVB.
   2. Sélectionner l’icône d’outils profil RVB et tracez une ligne à travers la section dans l’image que nous vous présentons. Enregistrer les données d’intensité dans une feuille de calcul pour le traçage.

Résultats

L’étape de prétraitement photobleaching peut être ajoutée à un protocole standard d’immunofluorescence immédiatement avant la recherche d’antigène et immunostaining (Figure 1 a). Assemblage de l’appareil de photoblanchiment peut également être effectuée à l’aide de divers, composants sur étagère peu coûteux (Figure 1 b). Le spectre d’émission du phosphore blanc LED couvre un large éventail de longueurs...

Discussion

Le prétraitement de photoblanchiment de tissus visés dans ce manuscrit permet une élimination effective d’autofluorescence utilisant des composants sur étagère. Le protocole décrit l’imagerie immunofluorescence des agrégats de protéine tau phosphorylée dans les tissus fixés au formol un cerveau humain en utilisant des anticorps secondaires conjugués à Alexa 488 et Texas Red, au DAPI comme contre-colorant nucléaire. Pour appliquer la méthode à d’autres tissus, nous recommandons de procéder à un trai...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Sodium Choloride	Sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric Acid	Caledon Laboratory Chemicals	1506656
Sodium Azide	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	All components of photobleacher can be substituted based on availability
6 W LED Dimmable Desk Lamp	DBPower	DS501	All components of photobleacher can be substituted based on availability
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Sodium Hydroxide	BioShop Canada	SHY700.1
Water bath	Haake Fisons	K15
Slide collector	FisherScientific	12-587-17B
Staining Jar	FisherScientific	E94
Orbital Shaker	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Bovine Serum Albumin	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting medium	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710
Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	Software accompanies the Confocal Microscope
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Commercial chemical quencher	Biotum	23007