İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması

Özet

Arka plan autofluorescence biyolojik örneklerin kez Floresans tabanlı görüntüleme teknikleri, özellikle yaşlı insan postmitotic doku zorlaştırmaktadır. Bu protokolü nasıl autofluorescence bu örnekler üzerinden etkin bir şekilde kaldırılabilir açıklar bir ticari olarak mevcut ışık yayan diyot ışık kullanarak örnek immunostaining önce photobleach için kaynak.

Özet

Ayirt hücre altı bölmeleri görselleştirmek ve doku örneği içinde belirli proteinlerin yerelleştirme belirlemek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Yüksek kaliteli ayirt görüntüler edinimi için büyük bir engel lipofuscin gibi yaşlanma pigmentler veya aldehit fiksasyonu gibi genel örnek hazırlık süreçlerini neden doku endojen autofluorescence var. Bu protokolü nasıl arka plan Floresans büyük ölçüde beyaz fosfor ışık yayan diyot (LED) diziler önce tedavi ile floresan problar kullanarak photobleaching ile giderilebilir açıklar. Beyaz fosfor geniş spektrumlu emisyon LED fluorophores emisyon doruklarına aralığında beyazlatma için izin verir. Photobleaching aparatı çok düşük maliyetle kapalı bileşenlerden oluşturulması ve piyasada bulunan kimyasal quenchers için erişilebilir bir seçenek sunar. Photobleaching ön arıtma geleneksel ayirt boyama tarafından takip doku görüntü arka plan autofluorescence ücretsiz oluşturur. Göre kurulan soruşturma yanı sıra arka plan azaltılmış kimyasal quenchers sinyalleri, photobleaching tedavi etkili arka plan ve lipofuscin floresan azaltılmış sonda floresan yoğunluğu üzerinde bir etkisi vardı. Photobleaching ön arıtma için daha fazla zaman gerektirir, ancak daha yüksek yoğunluklu LED diziler photobleaching süresini azaltmak için kullanılır. Bu basit yöntem doku, beyin gibi lipofuscin birikir özellikle postmitotic doku ve kardiyak veya iskelet kasları çeşitli için potansiyel olarak uygulanır.

Giriş

Floresans mikroskobu antikorlar spesifik proteinlerin hedefleme kullanarak düzenli olarak proteinler hücre kültürü ve dokuların ilgi görselleştirmek için kullanılır. Ayirt açık ve kesin Albümdeki edinimi için büyük bir komplikasyon endogenously memeli dokusunda yaş pigment lipofuscin ve elastin ve kolajen^{1gibi proteinler tarafından neden olabilir autofluorescence olduğunu, 2}. Autofluorescence ile ilgili diğer kaynakları aldehid fiksasyon³gibi örnek hazırlama adımlarda tanıttı olabilir. Lipofuscin granül, öncelikle oxidatively değiştirilmiş protein ve lipit bozulması artıkları, oluşan uzun-canlı hücreler artan yaş²birikir. Olarak lipofuscin floresan emisyon yelpazesi geniş ve değişken, genellikle ortak fluorophores için kullanılan emisyon dalgaboyu ile rastlayan bu beyin ve kalp veya iskelet kasları gibi postmitotic doku Imaging'de zorluğa neden oluyor ⁴etiketleme. Bu faktörler insan beyin dokusundan özellikle zor durumlarda da lobar dejenerasyonu (FTLD) gibi geç başlangıçlı nörodejeneratif hastalıkların görüntüleme olun.

Autofluorescence azaltmak için içinde biz beyaz bir ışık yayan diyot (LED) dizi bir ev Resepsiyon lamba⁵kullanarak slayt monte doku bölümleri ışınlatayım bir teknik geliştirmiştir. Bu basit tekniği kullanmak CuSO₄ gibi kimyasal quenchers amonyum asetat, veya piyasada bulunan boyalar Sudan Siyah B ve Eriochrome siyah T⁶gibi Şoklama teknikleri bir alternatif sağlar. Önemli maliyet tasarrufu bitti spektral have LED Lamba photobleaching teknikleri ve komplikasyonlar ve spektral un karıştırma^7,8gibi dijital autofluorescence kaldırma yöntemleri üretilen eserlerin önler. Beyaz fosfor photobleaching kromofor^5,9çeşitli için kapalı bir bileşeni olarak idealdir geniş emisyon spektrumlu, yüksek parlaklık ve düşük üretim maliyeti, LED var.

Bu iletişim kuralı, biz erişilebilir bileşenler kullanarak bir photobleaching aparatı inşaatı göstermek ve photobleaching FTLD dokusu fosforile tau ilişkin bir antikor özel kullanarak tau-pozitif kapanımlar (FTLD-T) içeren olgusu uygulanır. Biz iki yaygın olarak kullanılan kromofor istihdam fluorescently etiketli antikorlar Imaging üzerindeki etkisi photobleaching göstermek: Alexa 488 ve Texas kırmızı. Photobleaching tedavi edilmeyen bölümleri karşı etkisini veya ticari bir kimyasal içki ile tedavi sayılabilir ve karşılaştırıldığında. Bu photobleaching ön arıtma autofluorescence bir biyolojik örnek kaldırmak için herhangi bir standart ayirt boyama Protokolü içine dahil edilebilir.

Protokol

Not: Uluslararası Konferansı üzerinde uyumlaştırılması (Ich), Konsey için uluslararası kuruluşlar, tıbbi Bilimler (CIOMS) de dahil olmak üzere tanınan uluslararası standartlara uygun olarak sunulan çalışma gerçekleştirildi ve Helsinki Bildirgesi ilkeleri. İnsan dokusu kullanımı üniversite sağlık ağ araştırma Etik Kurulu onayı ile oldu. İnsan beyni örnekleri deniz beyin doku Bankası bir parçası olarak toplanmıştır. Toplanması sırasında tüm hasta Onam alındı.

1. photobleaching cihazları ve çözümleri inşaat

1. hazırla hisse senedi çözümleri.
   1. Hazırlamak 1 L / 1 x 8,77 g NaCl ve 6,06 g Tris eriterek tarafından hisse senedi Tris tamponlu tuz (1 x TBS) çözüm (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) temel GKD ₂ O 800 mL ve pH HCl. Bring sesi 1 L ve basınçlı kap kullanarak 7.4 için ayarlamak. < / li >
   2. % 10 (200 x hisse senedi) sodyum azid sodyum azid 10 ml GKD ₂ O (%10, 200 x hisse senedi) 1 g çözülerek hazırlayın.
2. 1-3 standart ölçü slaytlarını tek 100 mm x 100 mm şeffaf, kare petri kabına bir slayt odası kullanın. Bir tek slayt odası için 200 x sodyum azid stokunun 0.25 mL % 0.05 azid TBS çözüm yapmak için 1 x TBS için 50 mL ekleyin. Dikey olarak ek slaytları işlemek için 2-3 slayt chambers yığını. Her oda için bir ek 50 mL azid TBS çözeltisi hazırlamak.
3. Böyle bir lamba başlığında altında sığabilecek slayt chamber(s) yükseltmek için bir iskele oluşturmak.
   1. İçin bir 100 mm x 100 mm slayt odası, alt ve bir 100 x 100 mm x 30 mm plastik gıda konteyner kenarlarında açıklıklar kesmek ve konteyner tersine çevirin. Yan açıklıklar ve alt açıklıklı öyle ki ışık ışık kaynağından örnek odası engel olmadan ulaşır kadar büyük olduğundan emin olun bir LED ışık kaynağı uygun büyüklükte olduğundan emin olun.
   2. İskele artış kavrama iskele ve örnek odası/benchtop arasında Elektrik bandı uygulamak. Güvenli bir şekilde slayt odası ışık örnek ulaşmasını engelleyen olmadan yükseltir sürece iskele oluşturmak için alternatif herhangi bir malzeme kullanın.
4. Tüm Difüzörler ve opak plastik doğrudan örnek (mümkünse) ulaşmasını LED ışık engel ve LED dizi yukarı doğru yönlendirmek masa lambası kaldırın. LED dizi yukarıda iskele ve slayt chamber(s) yerleştirin. Bir lamba ile esnek bir boyun için kolayca idare kullanın.
5. Yapı yansıtıcı bir kubbe cihazları için slayt odası ve İskele alüminyum folyo ile karşılamak için büyük bir kutu içine astar tarafından kapsar. Kullanma a 1 mL pipet ucu kutu için tek bir oda ya da bir 150 x 150 mm x 150 mm karton kutu birden çok, dikey olarak üst üste Chambers'ı.

2. Photobleaching ön arıtma doku bölümlerinin

Not: doku bölümü hazırlık doku ve fiksasyon ve kullanılan yöntemler katıştırma kaynağına bağlı olarak farklı olabilir. Burada, beyin dokusundan FTLD-T Olgusu (orbitofrontal gyri) ~ 2 gün içinde formalin, sukroz degrade çalıştırmak, Ekim gömülü ve bir cryostat kullanarak 10 µm kalınlığında bölümlerine kesmek için tespit edildi.

1. Bir 4 ºC soğuk oda, soğuk dolap veya buzdolabı, iskele altında lamba yönlendirmek ve örnek odası iskele üzerinde yerleştirin. 50 mL azid TBS çözeltisi örnek odanın içine dökün.
2. Submerge doku bölümler standart cam mikroskop slaytlar azid TBS temiz forseps kullanarak içeren slayt odasına monte. Birden çok slayt için slaytları tek bir katmanda odasında yerleştirilir emin olmak.
3. Aparatı ile yansıtıcı kubbe kapak, LED Lamba açmak ve 4 ºC, 48 h için kuluçkaya.

3. Ayirt

fosforile tau DAPI counterstain ve Alexa 488 - ve ikincil antikorlar Texas kırmızı Birleşik kullanarak doku leke, ilk çözümleri antijen alma, permeabilization, engelleme ve ilköğretim için hazırlamak için

1. antikor bağlama.
   1. Hazırlamak 500 mL antijen alma arabellek (10 mM sitrik asit, 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit, % 0.05 arası 20; pH 6.2) 0,92 g sitrik asit ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 500 mL GKD ₂ O. ayarlama pH 0.37 g eriterek tarafından 6.2 NaOH ile için ve ara 20 0.25 mL ekleyin.
   2. 500 mL % 0,025 hazırlamak Triton X-100 Triton X-100 0,125 mL 500 mL 1 ekleyerek TBS çözüm (TBS-Triton) TBS. x
   3. Hazırlık %1 sığır serum albumin (BSA) çözeltilerine 0.1 g 10 ml TBS. BSA eriterek tarafından TBS (BSA-TBS arabellek)
   4. Engelleyen bir çözüm için 1,8 mL %1 0.2 mL normal keçi serum ekleyerek hazırlamak BSA/TBS.
   5. Her slayt için birincil antikor çözümü (1: 100 seyreltme) 150 µL tarafından anti-fosfo-PHF-tau pSer202 + Thr205 pipetting 1,5 µL hazırlamak (AT8) antikor 148,5 µL BSA-TBS tampon ve buz üzerinde bırakın % 1 içine
2. Antijen alma gerçekleştirmek için dikey olarak antijen alma arabelleği 25 mL içeren bir slayt toplayıcı photobleached slaytları daldırın. Öyle ki toplayıcı su banyosu düşmek değil toplayıcısı teyp ve/veya dizeleri ile güvenli. Toplayıcı için 30 dk 90 ºC, bir su banyosu içinde ısı ve toplayıcı slaytları kaldırmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika soğuması izin. Yapmak değil Kaldır slaytlar hemen olarak bölümler kurumasına neden olur.
3. Slaytları TBS-Triton 30 mL ile dolu bir boyama kavanoza antijen alma toplayıcı aktarım ve nazik sallayarak ile bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 5 min için bölümler yıkayın. Yıkama taze TBS-Triton ile bir kez yineleyin. Wick bir hav bırakmayan dokusu ve anahat hidrofobik kalem ile doku ile dış görev aşırı arabellek. Slaytlar kurumasına izin vermemeye özen.
   1. Her slayt için doku doku üzerine çözüm engelleme pipetting 200 µL tarafından blok ve slayt oksijen bir odaya koyun. Odası ıslak kağıt havlu içeren bir pipet ucu kutusunun içinde bir slayt raf yerleştirerek oluşturmak. Bir yüzeyin 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. Engelleme çözüm tam olarak doku kapsar olun.
4. Aspirasyon tarafından engelleme çözümü kaldırmak ve 100-150 µL birincil antikor çözüm doku üzerine pipette. Yeterli miktarda antikor mevcuttur ve bölüm antikor çözüm bir yana havuzu oluşturma önlemek için bir yüzeyin üzerinde olduğundan emin olun. Oksijen odasında gecede 4 ºC, kuluçkaya.
5. İkincil antikor karışımı ve DAPI nükleer counterstain hazırlayın.
   1. Her slayt için karışımı keçi Anti-fare Alexa 488 1,5 µL ve keçi Anti-fare BSA-TBS 147 µL Texas kırmızı 1,5 µL ekleyerek ikincil antikor (1: 100 dilutions) 150 µL hazırlamak ve buz üzerinde bırakın
   2. Hazırlama 0,1 µg/mL DAPI seri seyreltme tarafından counterstain. Hisse senedi çözüm iyice karıştırın ve 1 µL olarak hisse senedi 5 mg/mL 5 µg/mL solüsyon 1 mL yapmak TBS 999 DAPI oranında seyreltin. Her slayt için seyreltik 3 µ5 µg/mL solüsyon L ile TBS 147 µL son konsantrasyonu olarak 0.1 µg/mL.
      Dikkat: DAPI bilinen bir alkil olduğunu ve dikkatle ele alınmalıdır.
6. Aspirasyon tarafından birincil antikor kaldırın. TBS-Triton ve nazik bir orbital Çalkalayıcı karıştırma ile 5 min için yıkama 30 mL içeren kavanoz boyama bir cam slayt daldırın. Taze TBS-Triton ile yıkama adımı yineleyin. Dış görev aşırı TBS-Triton fitil ve 100-150 µL her slayt için ikincil antikor karışımı pipet.
   1. Emin olun doku tarafından antikor karışım tamamen kaplıdır. Karanlıkta oksijen odasında oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
7. Ve slayt içeren TBS (Triton) 30 mL kavanoz boyama cam içine transfer aspirasyon tarafından ikincil antikor karışımı çıkarın. Nazik bir orbital Çalkalayıcı karıştırma ile 5 dakika yıkayın. Taze TBS. yıkama adımla 0.1 µg/mL DAPI counterstain 100-150 µL her slayta uygulamak ve karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya Yinele.
8. Slaytları bir cam kavanoz TBS içeren boyama transfer ve 3 kez nazik 5 min her, taze TBS her yıkama için kullanarak için karıştırma ile yıkayın. Fitil uzakta aşırı arabellek.
9. Sulu montaj orta doku olarak uygulamak 3 damla. Forseps kullanarak, bir temiz cam coverslip bir kenar ile başlayan ve yavaş yavaş diğer kenarına hava kabarcıkları yakalama önlemek için düşürücü dokusu üzerine yavaşça indirin. Coverslip hemen Imaging Eğer çıkarmak değil için dikkat ediniz. Aksi takdirde, karanlıkta 4 ºC, saklamadan önce kuru montaj orta izin.

4. Floresans mikroskobu

1. dönüş floresan lamba, mikroskop hem de bilgisayarda ve 15 dk. lekeli doku slaytlar floresan mikroskop aşamasında yer için ısıtmak lamba sağlar. 10 x büyütme oranında dokuyu bulmak için parlak alan görüntü kullanın.
2. Bir damla GKD ₂ O coverslip yüzeye uygulamak ve bir 20 x su daldırma objektif lens kullanmak (NA = 1,0). 4-line ortalama uçak tarama ayarı seçin. İğne deliği boyutu ~ 3 mikron optik bir dilim veren 1 havadar birimini ayarlayın. Lazer uyarma ve emisyon dalga boylarında her fluorophore için en iyi sinyal için ayrı parça seçin.
   Not: Alexa 488: λ _ex 488 nm (argon lazer) λ _em = 493-570 nm; = λ Texas kırmızı: _ex 561 = nm (DPSS 561 nm lazer), λ _em 601-635 nm; = λ DAPI: _ex = 405 nm (diyot 405 lazer), λ _em 410-507 nm =.
   1. Lazer güç ayarlamak ve sinyal şiddeti her parça için en iyi duruma getirmek için ayarları kazanç. Bileşik görüntü toplayabilir ve kaydedebilirsiniz. Floresans yoğunluklarda farklı bir slayt içinde karşılaştırmak için aynı lazer ayarları kullanın.
3. Floresan yoğunluğu her kanaldaki görselleştirme için RGB profil araçları makro ImageJ ¹⁰ için yükleyin. Makroyu Microsoft Web sitesinden (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt) metin dosyası olarak kaydedin. ImageJ menüde Eklentiler - > makrolar - > yüklemek; RGB profillerini aracını yüklemek için metin dosyasını seçin.
   1. İçinde ImageJ confocal görüntü dosyasını açın ve bileşik görüntüler 3 yığınları RGB'ye aşağıdakileri gerçekleştirerek dönüştürmek: görüntü - > renk - > kanal aracı. Seçin " kompozit " açılır menü ve onay tüm üç kanal. Sonra görüntü - seçin > türü - > RGB renk.
   2. RGB profil Araçları simgesini seçin ve profiled için görüntünün bölümünde arasında bir çizgi çizin. Komplo için bir elektronik tablo olarak yoğunluğu verileri kaydetmek.

Sonuçlar

Photobleaching ön arıtma adım standart ayirt protokolü hemen önce antijen alımı ve immunostaining (şekil 1A) eklenebilir. Derleme photobleaching cihazları da çeşitli, kullanarak gerçekleştirilebilir ucuz, kapalı bileşenleri (şekil 1B). Beyaz fosfor emisyon spektrum LED'ler kapsar geniş menzilli photobleaching için uygundur dalga boyu geniş bir yelpazesi ile önceki raporlar (şekil 1 c

Tartışmalar

Bu el yazması açıklanan dokuların photobleaching ön arıtma kapalı bileşenleri kullanarak autofluorescence etkili eleme için sağlar. Protokol ayirt görüntüleme fosforile tau toplamları insan beyninin formalin sabit doku ikincil antikorlar Alexa 488 ve Texas kırmızı, DAPI bir nükleer counterstain olarak Birleşik kullanarak açıklar. Diğer dokulara yöntemi uygulamak için bir başlangıç noktası olarak örnek bir 48 h photobleaching ön arıtma yapmak tavsiye. Photobleaching sonra için iletişim kur...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Sodium Choloride	Sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric Acid	Caledon Laboratory Chemicals	1506656
Sodium Azide	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	All components of photobleacher can be substituted based on availability
6 W LED Dimmable Desk Lamp	DBPower	DS501	All components of photobleacher can be substituted based on availability
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Sodium Hydroxide	BioShop Canada	SHY700.1
Water bath	Haake Fisons	K15
Slide collector	FisherScientific	12-587-17B
Staining Jar	FisherScientific	E94
Orbital Shaker	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Bovine Serum Albumin	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting medium	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710
Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	Software accompanies the Confocal Microscope
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Commercial chemical quencher	Biotum	23007