Простой ликвидации фон флуоресценции в формалин Исправлена человеческий мозг ткани для микроскопии иммунофлуоресценции

Резюме

Фон аутофлюоресценция биологических образцов зачастую осложняет на основе флуоресценции методы визуализации, особенно в возрасте человека постмитотических тканей. Этот протокол описывает, как можно эффективно удалить аутофлюоресценция из этих образцов использование коммерчески доступных Светоиспускающий диод свет источника в photobleach образце до иммуноокрашивания.

Аннотация

Иммунофлюоресценции это общий метод, используемый для визуализации субцеллюлярные отсеков и определить локализацию специфических белков в образец ткани. Большим препятствием для приобретения иммунофлюоресценции изображения высокого качества — эндогенного аутофлюоресценция тканей, вызванных старения пигменты как липофусцин или общих процессов подготовки образцов таких как альдегид фиксации. Этот протокол описывает, как фон флуоресцирования можно значительно сократить через Фотообесцвечивание, с использованием белого фосфора Светоиспускающий диод (LED) массивов до лечения с флуоресцентных зондов. Широкий спектр эмиссии белого фосфора светодиоды позволяют для отбеливания флуорофоров по целому ряду пики выбросов. Аппарат Фотообесцвечивание могут быть построены из готовых компонентов по очень низкой цене и доступной альтернативой коммерчески доступных химических quenchers. Фотообесцвечивание Предварительная обработка ткани, следуют обычных иммунофлюоресценции пятнать генерирует изображения бесплатно аутофлюоресценция фон. По сравнению создан химических quenchers, которые сократили зонд, а также фон сигналов, Фотообесцвечивание лечения было не влияет на интенсивность флуоресценции зонда, в то время как она эффективно уменьшить фон и липофусцин флюоресценция. Хотя Фотообесцвечивание требует больше времени для предварительной обработки, более высокой интенсивности Светодиодные массивы могут использоваться для уменьшения времени Фотообесцвечивание. Этот простой метод потенциально может применяться в различных тканях, особенно постмитотических тканей, которые аккумулируют липофусцин например мозга и сердечной или скелетных мышц.

Введение

Микроскопии флуоресцирования, с использованием антител против специфические белки обычно используется для визуализации протеинов интереса в культуре клеток и тканей. Серьезным осложнением на приобретение ясного и окончательного изображения в иммунофлуоресценции, Аутофлюоресценция, которое может быть вызвано эндогенно в тканях млекопитающих возраст пигмент липофусцин и белков эластина и коллагена в^{1, 2}. Другие источники аутофлюоресценция могут быть введены через шаги подготовки образца как альдегид фиксации³. Липофусцин гранул, состоящий главным образом из окислительно модифицированных белков и липидов деградации остатков, накапливаются в Лонг живые клетки с повышенной возраст². Это вызывает трудности в imaging постмитотических тканей мозга и сердечной или скелетных мышц, как спектр липофусцин флюоресценция выбросов является широкой и переменных, часто совпадает с длиной волны выбросов общей флуорофоров, используется для Маркировка⁴. Эти факторы делают изображений человеческого мозга ткани от случаев позднего начала нейродегенеративных заболеваний, таких как frontotemporal Лобар дегенерация (FTLD) особенно сложной.

Чтобы уменьшить аутофлюоресценция, мы разработали технику, в которой мы облучить разделов слайд установлен ткани с белым Светоиспускающий диод (LED) массива с использованием бытовых стол лампа⁵. Этот простой метод предоставляет альтернативу методы, которые используют химические quenchers например CuSO₄ в Ацетат аммония, или коммерчески доступных, закалки красителей Судан черный B и Эриохром черный Т⁶. Она также имеет значительные экономии более многоспектральных привело лампа Фотообесцвечивание методы и избежать осложнений и артефакты, создаваемые цифровой аутофлюоресценция методы удаления как спектральные снимите смешивания^7,8. Белый фосфор светодиоды имеют широкий спектр излучения, высокая яркость и низкой стоимости производства, что делает их идеальными как готовый компонент для Фотообесцвечивание различных хромофоры^5,9.

В этом протоколе мы продемонстрировать строительство Фотообесцвечивание аппарат, с помощью доступных компонентов и применить Фотообесцвечивание к делу FTLD ткани, содержащие Тау положительных включений (FTLD-T) с использованием антител специфических для фосфорилированных Тау. Мы продемонстрировать влияние Фотообесцвечивание на визуализации дневно обозначенного антитела, используя два часто используемых хромофоры: Alexa 488 и Техас красный. Эффект Фотообесцвечивание по сравнению с необработанной секции или тех, кто лечится коммерческих химических утоления количественно и сравнить. Этот Фотообесцвечивание до лечения могут быть включены в любой стандартный иммунофлюоресценции окрашивание протокол для удаления аутофлюоресценция в биологическом образце.

протокол

Примечание: представленных работ была выполнена в соответствии с признанным международным стандартам, в том числе на международной конференции по гармонизации (мкг), Совет международных научно-медицинских организаций (СМНМО) и принципы Хельсинкской декларации. Использование тканей человека был с одобрения Совета этики научных исследований Университета здоровья сети. Человеческий мозг образцы были собраны как часть морского банка тканей мозга. Во время сбора, информированное согласие было получено от всех больных.

1. Строительство Фотообесцвечивание аппарат и решения

1. подготовка запасов решения.
   1. Подготовить 1 L 1 x запасов трис буфер солевой раствор (1 x TBS) раствор (150 мм NaCl, 50 мм трис-Cl, рН 7,4), растворяя 8.77 г NaCl и 6.06 г трис базы в 800 мл ddH ₂ O и скорректировать рН 7,4, с использованием HCl. Принесите вверх объемом 1 Л и автоклав. < / Li >
   2. подготовить азид натрия 10% (200 x бульон), растворяя 1 g азид натрия в 10 мл ddH ₂ O (10%, 200 x фондовой).
2. Для 1-3 Стандартный размер слайдов, использовать единый 100 мм x 100 мм прозрачный, квадратный Петри как слайд камеры. Один слайд камеры добавьте 0,25 мл акций азид натрия 200 x 50 мл 1 x TBS чтобы сделать азид TBS раствор 0,05%. Стек 2-3 слайд камер по вертикали, чтобы обрабатывать дополнительные слайды. Подготовить дополнительные 50 мл раствора азид TBS для каждой камеры.
3. Создать леску поднять слайд chamber(s), таким образом, что голова лампа может поместиться под.
   1. Для 100 мм x 100 мм слайд палата, вырезать отверстия в дне и по бокам 100 мм x 100 мм x 30 мм пластиковая еда контейнера и инвертировать контейнера. Обеспечить достаточно большой, чтобы соответствовать светодиодный источник света и обеспечить открытие нижней достаточно большой, таким образом, чтобы свет от источника света достигает палате образец без препятствий боковых отверстия.
   2. Применять Изоленты на эшафот увеличить сцепление между эшафот и образец камеры/benchtop. Использовать любые альтернативные материалы для построения леска до тех пор, пока он надежно поднимает камеру слайд без противодействия свет от достижения образца.
4. Удалить любой диффузоры или непрозрачного пластика из настольную лампу, которая может препятствовать светодиодный свет непосредственно добраться до образца (если возможно) и ориентировать светодиодов вверх. Место chamber(s) леску и слайд над светодиодов. Использовать лампы с гибким горлышком для легкой манипуляции.
5. Конструкция отражающих купол крышка для аппарата, подкладка внутри коробки достаточно большой, чтобы покрыть слайд камеры и леска с алюминиевой фольгой. Используйте поле наконечник пипетки 1 мл для одной камеры или 150 мм х 150 мм х 150 мм картонную коробку для нескольких, вертикально сложены камер.

2. Фотообесцвечивание Предварительная обработка разделов ткани

Примечание: раздел Подготовка тканей может варьироваться в зависимости от источник ткани и фиксации и внедрение методов, используемых. Здесь, было зафиксировано мозговой ткани (орбитофронтальной Извилин) от случай FTLD-T ~ 2 дня в формалин, запустить через градиент сахарозы, встроенные в OCT и сократить до 10 мкм толщиной разделов с помощью криостата.

1. В 4 ºC холодная комната, холодная кабинета или Холодильник, Ориент лампа под леску и поместить в камеру образец на эшафот. Залить 50 мл раствора азид TBS в камеру образец.
2. Submerge ткани разделы монтируются на стандартных стеклянных скольжениях микроскопа в камеру слайд, содержащие азид TBS, используя чистые пинцет. Для нескольких слайдов, убедитесь, что слайды размещены в камере в единственном слое.
3. Покрытия аппарат с отражающей купол, включите светодиодная лампа и инкубировать в течение 48 часов при температуре 4 °.

3. Иммунофлюоресценции

1. пятно тканей для фосфорилированных Тау, используя DAPI изображение и Alexa 488 - и Техас красно-конъюгированных вторичные антитела, сначала подготовить решения для антигена, permeabilization, блокировка и первичной антитела binding.
   1. Подготовить 500 мл антигена извлечения буфер (лимонная кислота 10 мм, 2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота, 0,05% 20 анимации; рН 6,2) путем растворения 0,92 г лимонной кислоты и 0,37 г Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в 500 мл ddH ₂ O. Adjust pH 6.2 с NaOH и добавить 0,25 мл анимации 20.
   2. Подготовить 500 мл 0,025% Тритон X-100 в растворе (TBS-Тритон) TBS, добавив 0,125 мл Тритон X-100 500 мл 1 x TBS.
   3. Подготовить раствор 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в TBS (BSA-TBS буфера), растворяя 0,1 г BSA в 10 мл TBS.
   4. Подготовить блокирующие решение путем добавления 0,2 мл сыворотки нормальной коза 1,8 мл 1% BSA/TBS.
   5. Для каждого слайда, подготовьте 150 мкл раствора первичного антитела (разбавления 1: 100), дозирования 1.5 мкл анти фосфо PHF-Тау pSer202 + Thr205 (AT8) антител в 148.5 мкл 1% BSA-TBS буфер и оставить на льду
2. Для выполнения поиска антигена, погрузите photobleached слайды вертикально в коллекторе слайд, содержащий 25 мл буфера получения антигена. Закрепите коллектор с ленты и/или строки таким образом, что коллектор не попадают в водяной бане. Тепла коллекционера в водяной бане при температуре 90 ° для 30 мин и позволяют сборщику остыть до комнатной температуры на 30 минут перед удалением слайды. ДУ не удалить слайды сразу же, как он вызовет разделы высыхать.
3. Передачи слайды из коллектора извлечения антигена в окрашивание банку заполнены с 30 мл TBS-Тритона и мыть в разделах 5 мин на орбитальный шейкер с нежным встряхивания. Повторите один раз промыть свежим TBS-Тритон. Фитиль от избыточного буфер безворсовой салфеткой и наметить ткани с гидрофобным пера. Будьте осторожны, не допустить слайды высохнуть.
   1. Для каждого слайда, блокировать ткани, дозирования 200 мкл блокирования раствор на ткань и место слайда в камере увлажненной. Постройте камеры, поместив слайд стойку внутри коробки наконечник пипетки, содержащий влажной салфеткой. Инкубации при комнатной температуре на 2 ч на ровной поверхности. Убедитесь, что блокирование решение полностью покрывает ткань.
4. Удалить блокирующий решение путем аспирации и Пипетка 100-150 мкл раствора первичного антитела на ткани. Обеспечить достаточное количество антител присутствует и что раздел находится на ровной поверхности, чтобы избежать объединения раствор антител в одну сторону. Инкубируйте на 4 ° c на ночь в камере увлажненные.
5. Подготовить смесь вторичного антитела и DAPI ядерной изображение.
   1. Для каждого слайда, подготовить 150 мкл вторичное антитело смесь (1: 100 разведений) путем добавления 1,5 мкл коза анти мыши Alexa 488 и 1,5 мкл коза анти мыши Техас красного до 147 мкл BSA-TBS и оставить на ДВС.
   2. Подготовка 0,1 мкг/мл DAPI изображение путем последовательного растворения. Стоковый раствор тщательно перемешать и разбавить 1 мкл акций 5 мг/мл DAPI в 999 TBS сделать 1 мл 5 мкг/мл раствора. Для каждого слайда разбавьте 3 мкгL 5 мкг/мл раствора с 147 мкл TBS в конечной концентрации 0,1 мкг/мл.
      Предупреждение: DAPI является известный мутагены и должны быть обработаны с осторожностью.
6. Удаления основного антитела путем аспирации. Опускайте слайды в стакане, окрашивание jar, содержащий 30 мл TBS-Тритон и мыть за 5 мин с нежным смешивания на орбитальный шейкер. Повторите шаг мыть с свежими TBS-Тритон. Фитиль от избыточного TBS-Тритон и Пипетка 100-150 мкл смеси вторичного антитела к каждому слайду.
   1. Обеспечить ткани полностью охватываются смесь антител. Проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре в увлажненные камере в темноте.
7. Снимите смесь вторичного антитела путем аспирации и передача слайд в стакан пятнать jar, содержащий 30 мл TBS (не «Тритон»). Мыть за 5 мин с нежным смешивания на орбитальный шейкер. Повторите шаг мыть с TBS. свежие применить к каждому слайду 100-150 мкл рабочего раствора 0,1 мкг/мл DAPI изображение и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре в темноте.
8. Передачи слайдов на стакан, окрашивание jar, содержащий TBS и мыть 3 раза с нежным смешивания 5 минут каждый, с использованием свежих TBS для каждой стирки. Фитиль от избыточного буфера.
9. Применить 3 капли водный монтажа средних тканей. С помощью щипцов, аккуратно опустите чистого стекла coverslip на ткани, начиная с одного края и медленно снижение другой край, чтобы избежать захвата воздушных пузырьков. Будьте осторожны, не выбить coverslip если изображений сразу. В противном случае, позволяют монтаж среднего высохнуть, прежде чем хранить при 4 ° c в темноте.

4. Микроскопии флуоресцирования

1. поворот на люминесцентная лампа, микроскоп и компьютер и разрешить лампы тепло за 15 мин место окрашенных тканей слайды в флуоресценции микроскопа. Используйте светлые области изображения для поиска ткани при 10-кратном.
2. Применять капли ddH ₂ O на coverslip поверхность и использовать объектив погружения воды 20 x (NA = 1.0). Выберите настройки сканирования 4-строчный средняя плоскость. Задайте размер обскуры 1 Эйри единица, которая дает оптических ломтик ~ 3 мкм. В отдельных треков для лучших сигнала выберите лазерного возбуждения и выбросов длин волн для каждого Флюорофор.
   Примечание: Alexa 488: λ _ex = 488 нм (аргоновый лазер) λ _ет = 493-570 Нм; Техас красный: λ _ex = 561 Нм (СППЗ 561 Нм лазер), _Эм λ = 601-635 нм; DAPI: λ _ex = 405 нм (лазерный диод 405), _Эм λ = 410-507 Нм.
   1. Отрегулировать мощность лазера и получить параметры для оптимизации интенсивности сигнала для каждого трека. Собирать составное изображение и сохранить. Используйте те же параметры лазера для сравнения интенсивности флуоресценции в другой слайд.
3. Для визуализации интенсивности флуоресценции в каждом канале, установить макрос инструменты профиля RGB для ImageJ ¹⁰. Сохраните макрос из веб-страницы в виде текстового файла (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). ImageJ меню, выберите плагины - > макросы - > установки; Выберите текстовый файл, чтобы установить средство профили RGB.
   1. Открыть файл конфокальное изображение в ImageJ и преобразования композитных изображений из 3 стеки в RGB, выполнив следующие действия: изображение - > цвет - > канал инструмент. Выберите " композитных " из раскрывающегося меню и проверьте все три каналы. Затем, выберите изображение - > тип - > цвет RGB.
   2. Выберите значок инструменты профиль RGB и нарисовать линию через раздел в изображении для профилирования. Сохранить интенсивность данных как электронную таблицу для черчения.

Результаты

На этапе предварительной обработки Фотообесцвечивание могут добавляться стандартный иммунофлюоресценции протокола непосредственно до получения антигена и иммуноокрашивания (рис. 1A). Ассамблея Фотообесцвечивание аппарата может также выполняться с ...

Обсуждение

Фотообесцвечивание Предварительная обработка тканей, описанные в этой рукописи позволяет для эффективной ликвидации аутофлюоресценция, с использованием готовых компонентов. Протокол описывает иммунофлюоресценции изображений фосфорилированных Тау агрегатов в формалин Исправлена ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Sodium Choloride	Sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric Acid	Caledon Laboratory Chemicals	1506656
Sodium Azide	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	All components of photobleacher can be substituted based on availability
6 W LED Dimmable Desk Lamp	DBPower	DS501	All components of photobleacher can be substituted based on availability
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Sodium Hydroxide	BioShop Canada	SHY700.1
Water bath	Haake Fisons	K15
Slide collector	FisherScientific	12-587-17B
Staining Jar	FisherScientific	E94
Orbital Shaker	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Bovine Serum Albumin	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting medium	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710
Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	Software accompanies the Confocal Microscope
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Commercial chemical quencher	Biotum	23007