Einfache Beseitigung von Hintergrundfluoreszenz in Formalin fixiert menschliche Gehirngewebe für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Zusammenfassung

Hintergrund Autofluoreszenz biologischer Proben erschwert oft Fluoreszenz basierende bildgebende Verfahren, vor allem im Alter menschlicher postmitotischen Gewebe. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Autofluoreszenz aus diesen Proben effektiv entfernt werden kann mit einer handelsüblichen Licht emittierende Diode Licht Quelle zu Photobleach die Probe vor Immunostaining.

Zusammenfassung

Immunfluoreszenz ist eine gängige Methode, verwendet um subzelluläre Kompartimente zu visualisieren und die Lokalisierung von bestimmten Proteinen innerhalb einer Gewebeprobe bestimmen. Ein großes Hindernis für die Übernahme von Bildern hoher Qualität Immunfluoreszenz ist endogene Autofluoreszenz des Gewebes durch Alterung Pigmente wie Lipofuszin oder gemeinsame Probe Verarbeitungsverfahren wie Aldehyd Fixierung. Dieses Protokoll beschreibt, wie Hintergrundfluoreszenz durch Immunofluoreszenz mit weißem Phosphor lichtemittierende Diode (LED) Arrays vor der Behandlung mit fluoreszierenden Sonden erheblich reduziert werden kann. Die Breitspektrum Emission von weißem Phosphor ermöglichen LEDs in einem Spektrum von Emission Gipfeln des Fluorophore bleichen. Immunofluoreszenz-Apparat aus Standardkomponenten zu sehr geringen Kosten aufgebaut werden kann und bietet eine zugängliche Alternative zu handelsüblichen chemischen stillt. Eine Immunofluoreszenz Vorbehandlung des Gewebes gefolgt von konventionellen Immunfluoreszenz Färbung erzeugt Bilder gratis Hintergrund Autofluoreszenz. Im Vergleich zu chemischen stillt die Sonde sowie Hintergrund reduziert Signale, Immunofluoreszenz Behandlung hatte keinen Einfluss auf Sonde Fluoreszenz-Intensität, während es effektiv Hintergrund und Lipofuszin Fluoreszenz reduziert. Obwohl Immunofluoreszenz mehr Zeit für die Vorbehandlung erfordert, können höhere Intensität LED-Arrays zur Immunofluoreszenz verkürzen. Diese einfache Methode kann potenziell zu einer Vielzahl von Geweben, insbesondere postmitotischen Gewebe, die ansammeln von Lipofuszin wie dem Gehirn und Herz- oder skelettartige Muskeln angewendet werden.

Einleitung

Fluoreszenz-Mikroskopie mit Antikörpern, die Ausrichtung auf bestimmte Proteine wird routinemäßig verwendet, um Proteine des Interesses in Zellkultur und Geweben zu visualisieren. Eine schwere Komplikation für den Erwerb der eindeutige und endgültige Bilder in Immunfluoreszenz ist Autofluoreszenz, die endogen im Säugetier-Gewebe durch die Alter Pigment Lipofuszin und Proteine wie Elastin und Kollagen^{1entstehen können, 2}. Andere Quellen der Autofluoreszenz können durch Vorbereitung Beispielschritte z. B. Aldehyd Fixierung³eingeführt werden. Lipofuszin-Granulat, hauptsächlich bestehend aus oxidativ modifizierten Protein- und Lipid-Abbau-Rückstände, reichern sich in langlebigen Zellen mit zunehmendem Alter². Dies bewirkt, dass Schwierigkeiten im Bereich der bildgebenden postmitotischen Gewebe wie Gehirn und Herz- oder skelettartige Muskeln, wie die Fluoreszenz Emissionsspektrum von Lipofuszin ist breit und variabel, oft zeitgleich mit der Emissionswellenlänge von gemeinsamen Fluorophore verwendet für ⁴Kennzeichnung. Diese Faktoren machen Bildgebung des menschlichen Hirngewebe von late-Onset neurodegenerativen Erkrankungen wie Frontotemporal lobar Degeneration (FTLD) besonders anspruchsvoll.

Um Autofluoreszenz zu reduzieren, haben wir eine Technik entwickelt, in der wir die Rutsche montiert Gewebeschnitte mit weißem Licht emittierende (LED)-Diodenarray mit einem Haushalt Schreibtisch Lampe⁵bestrahlen. Diese einfache Technik bietet eine Alternative zu Techniken, mit denen chemische stillt z. B. CuSO₄ in Ammoniumacetat, oder im Handel erhältlichen Farbstoffe wie Sudan schwarz-B und Eriochrome Schwarz T⁶abschrecken. Es hat auch erhebliche Kostenersparnis über multispektralen LED Lampe Immunofluoreszenz Techniken und vermeidet Komplikationen und Artefakte aus digitalen Autofluoreszenz Methoden der Haarentfernung wie spektrale un-Mischen^7,8erzeugt. Weißer Phosphor haben LEDs eine breite Emissionsspektrum, hohe Leuchtkraft und niedrige Herstellungskosten, eignen sich ideal als handelsübliche Komponente für Immunofluoreszenz verschiedener Chromophore^5,9.

In diesem Protokoll wir zeigen den Bau von einem Immunofluoreszenz-Apparat mit zugänglichen Komponenten und ein Fall von FTLD Gewebe mit Tau-positiver Einschlüsse (FTLD-T) mit einem Antikörper spezifisch für phosphorylierten Tau Immunofluoreszenz zuweisen. Wir zeigen die Wirkung der Immunofluoreszenz Fluoreszent-markierten Antikörpern beschäftigt zwei häufig verwendete Chromophore Imaging: Alexa 488 und Texas Red. Die Wirkung der Immunofluoreszenz im Vergleich zu unbehandelten Abschnitte oder die Behandlung mit einem kommerziellen chemische Quencher werden quantifiziert und verglichen. Diese Vorbehandlung Immunofluoreszenz kann in jedes standard Immunfluoreszenz-Färbung-Protokoll zu Autofluoreszenz in einer biologischen Probe entfernen aufzunehmen.

Protokoll

Hinweis: die vorliegende Arbeit wurde durchgeführt in Übereinstimmung mit den anerkannten internationalen Standards, einschließlich der internationalen Konferenz auf Harmonisierung (ICH), der Rat für internationale Organisationen der medizinischen Wissenschaften (zusammensetzte) , und den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki. Verwendung von menschlichem Gewebe wurde mit Zustimmung der Universität Health Network Research Ethics Board. Die menschliche Gehirn Proben wurden als Bestandteil der maritimen Brain Tissue Bank gesammelt. Zum Zeitpunkt der Erhebung war die Einwilligung aller Patienten.

1. bauen Immunofluoreszenz Apparate-und Lösungen

1. Stammlösungen vorbereiten.
   1. Bereiten Sie 1 L 1 x Lager Tris gepufferte Kochsalzlösung (1 X TBS) Lösung (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) durch auflösen 8,77 g NaCl und 6,06 g Tris in 800 mL DdH ₂ O und anpassen den pH-Wert 7,4 mit HCl. bringen die Lautstärke auf 1 L und Autoklaven. < / Li >
   2. 10 % (200 X bestand) Natriumazid durch Auflösen von 1 g Natriumazid in 10 mL DdH ₂ O (10 %, 200 X Lager) vorzubereiten.
2. Für 1-3 standard-Größe Folien, verwenden eine einzigen 100 x 100 mm transparent, quadratische Petrischale als Folie Kammer. Fügen Sie für eine einzelne Folie Kammer 0,25 mL 200 X Natrium-Azid Lager 50 mL 1 X TBS eine 0,05 % Natriumazid-TBS-Lösung zu machen hinzu. Stapeln Sie 2-3 Folie Kammern vertikal um weitere Folien zu verarbeiten. Bereiten Sie eine zusätzliche 50 mL-Azid-TBS-Lösung für jede Kammer.
3. Schaffen ein Gerüst um die Folie Kammer(n) zu erhöhen, so dass ein Leuchtenkopf darunter Platz haben.
   1. Für ein 100 mm x 100 mm Folie Kammer, Öffnungen in den Boden und die Seiten von einem 100 mm x 100 mm x 30 mm Kunststoff Essen-Container und Container zu invertieren. Sicherzustellen, dass die seitlichen Öffnungen sind groß genug, um fit eine LED-Lichtquelle und sichergestellt, die untere Öffnung ist groß genug, so dass Licht von der Lichtquelle die Probenkammer ohne Hindernis erreicht.
   2. Gelten Isolierband für das Gerüst, um den Griff zwischen Gerüst und die Probe Kammer/Benchtop zu erhöhen. Alternative Materialien, um das Gerüst zu bauen, so lange es sicher die Folie Kammer erhebt, ohne zu behindern das Licht vom Erreichen der Probenmaterials verwenden.
4. Entfernen Sie alle Diffusoren oder opaken Kunststoff von der Schreibtischlampe, die möglicherweise behindern das LED-Licht von der Probe direkt (wenn möglich) zu erreichen und das LED-Array nach oben zu orientieren. Legen Sie das Gerüst und Folie Kammer(n) über das LED-Array. Verwenden Sie eine Lampe mit einem flexiblen Hals für einfache Manipulation.
5. Konstrukt einer reflektierenden Kuppel decken für den Apparat durch Auskleidung der Innenseite der Schachtel groß genug, um die Folie Kammer und Gerüst mit Alufolie abdecken. Verwenden Sie eine 1 mL-Pipette-Info-Feld für eine einzelne Kammer oder eine 150 x 150 mm x 150 mm Karton für mehrere, vertikal gestapelt Kammern.

2. Immunofluoreszenz Vorbehandlung von Gewebeschnitten

Hinweis: Gewebe Abschnitt Vorbereitung kann variieren, abhängig von der Quelle der Gewebe und Fixierung und Einbettungsmethoden verwendet. Hier wurde Hirngewebe (orbitofrontalen Windungen) Fall von FTLD-T ~ 2 Tage in Formalin, durchlaufen einen Farbverlauf von Saccharose, eingebettet im OAT und schneiden bis 10 µm dicke Abschnitte mit einem Kryostat behoben.

1. In ein 4 ° c kalten Raum, kalten Schrank oder Kühlschrank, die Lampe unter dem Schafott zu orientieren und legen die Probenkammer auf dem Schafott. Gießen Sie 50 mL-Azid-TBS-Lösung in die Probenkammer.
2. Submerge Gewebeschnitte auf standard-Glas-Objektträger in die Folie Kammer mit Azid-TBS mit sauberen Pinzette montiert. Für mehrere Folien, sicherzustellen, dass die Folien in der Kammer auf eine single Layer platziert werden.
3. Decken den Apparat mit der reflektierenden Kuppel, schalten Sie die LED-Lampe und 48 h bei 4 ° c inkubieren.

3. Immunfluoreszenz

1. Färben der Gewebe für phosphorylierten Tau mit DAPI Gegenfärbung und Alexa 488- und Texas Red-konjugierten Sekundärantikörper, zuerst erarbeiten Lösungen für Antigen-Retrieval, Permeabilisierung, blockieren und PV Antikörperbindung.
   1. Bereiten 500 mL Antigen-Retrieval-Puffer (10 mM Zitronensäure, 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure, 0,05 % Tween 20; pH 6.2) durch Auflösen von 0,92 g Zitronensäure und 0,37 g der Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in 500 mL DdH ₂ O. Stellen Sie den pH-Wert 6.2 mit NaOH und 0,25 mL Tween 20.
   2. Bereiten Sie 500 mL von 0,025 % Triton x-100 in TBS-Lösung (TBS-Triton) durch Zugabe von 0,125 mL Triton x-100 bis 500 mL 1 x El
   3. Bereiten Sie eine 1 % Rinderserumalbumin (BSA) Lösung in TBS (BSA-TBS Puffer) durch Auflösen von 0,1 g BSA in 10 mL TBS.
   4. Bereiten die blockierende Lösung durch Zugabe von 0,2 mL normalem Ziegenserum bis 1,8 mL von 1 % BSA/El
   5. Vorbereitung auf jede Folie, 150 µL Primärantikörper Lösung (1: 100 Verdünnung) pipettieren 1,5 µL Anti-Phospho-PHF-Tau pSer202 + Thr205 (AT8) Antikörper in 148,5 µL 1 % BSA-TBS Puffern und lassen auf Ice
2. Um Antigen-Retrieval durchzuführen, tauchen die Photobleached Folien vertikal in einem Dia-Kollektor mit 25 mL Antigen-Retrieval-Puffer. Fixieren Sie Kollektor mit Band und/oder Saiten, so dass der Sammler nicht in das Wasserbad fällt. Den Sammler in einem Wasserbad bei 90 º c für 30 min erhitzen und Kollektor auf 30 min bei Raumtemperatur abkühlen bevor Sie die Folien entfernen lassen. Nehmen Sie nicht die Folien sofort als es, dass die Abschnitte bewirkt austrocknen.
3. Übertragen die Folien aus dem Antigen-Retrieval-Kollektor in ein Färbung Glas, gefüllt mit 30 mL TBS-Triton und waschen Sie die Abschnitte für 5 min auf einem Orbitalschüttler mit sanft schütteln. Wiederholen Sie das Waschen einmal mit frischen TBS-Triton. Docht entfernt überschüssigen Puffer mit einem fusselfreien Tuch und das Gewebe mit einem hydrophoben Stift zu skizzieren. Achten Sie darauf, nicht die Folien austrocknen lassen.
   1. Für jede Folie, das Gewebe zu blockieren, indem Pipettieren 200 µL Lösung auf das Gewebe zu blockieren und legen Sie die Folie in eine feuchte Kammer. Konstruieren Sie die Kammer durch platzieren Regales Folie in eine Pipette Tipp-Box mit einem feuchten Papiertuch. Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h auf einer ebenen Fläche. Sicherzustellen, dass die blockierende Lösung Gewebe deckt.
4. Die blockierende Lösung durch Absaugen entfernen und pipette 100-150 µL Primärantikörper Lösung auf das Gewebe. Ausreichendes Volumen an Antikörper vorhanden ist und, dass der Abschnitt auf einer ebenen Fläche zu vermeiden, Bündelung der Antikörperlösung auf der einen Seite ist zu gewährleisten. Bei 4 ° c über Nacht in eine feuchte Kammer inkubieren.
5. Bereiten die Sekundärantikörper Mischung und das DAPI nuklearen Gegenfärbung.
   1. Für jede Folie 150 µL Sekundärantikörper Mischung (1: 100 Verdünnung) durch Zugabe von 1,5 µL Ziege Anti-Maus Alexa 488 und 1,5 µL Ziege Anti-Maus Texas rot bis 147 µL des BSA-TBS zubereiten und lassen auf Eis.
   2. Vorbereiten 0,1 µg/mL DAPI Gegenfärbung durch serielle Verdünnung. Mischen Sie die Stammlösung gründlich und verdünnen Sie 1 µL Lager 5 mg/mL DAPI 999 von TBS 1 mL 5 µg/mL Lösung zu machen. Verdünnen Sie für jede Folie 3 µL 5 µg/mL Lösung mit 147 µL TBS, eine Endkonzentration von 0,1 µg/mL.
      Achtung: DAPI ist ein bekannter Mutagen und sollten mit Vorsicht behandelt werden.
6. Den primären Antikörper durch Absaugen entfernen. Tauchen Sie die Folien in einem Glas JAR-Datei mit 30 mL TBS-Triton und Wäsche für 5 min mit schonendes Mischen auf einem Orbitalschüttler Färbung. Wiederholen Sie die Waschschritt mit frischen TBS-Triton. Docht entfernt überschüssige TBS-Triton und pipette 100 bis 150 µL der Sekundärantikörper Mischung zu jeder Folie.
   1. Stellen Sie sicher das Gewebe vollständig durch die Antikörper-Mischung bedeckt ist. 2 h bei Raumtemperatur in die feuchte Kammer im Dunkeln inkubieren.
7. Sekundärantikörper Mischung durch Aspiration entfernen und in ein Glas JAR-Datei mit 30 mL TBS (keine Triton) Färbung die Folie zu übertragen. Für 5 min mit schonendes Mischen auf einem Orbitalschüttler waschen. Wiederholung der Waschschritt mit frischen TBS gelten 100 bis 150 µL von 0,1 µg/mL DAPI Gegenfärbung für jede Folie und 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
8. Übertragen die Folien zu einem Glas JAR-Datei mit TBS Färbung und 3 Mal mit schonendes Mischen für jeweils 5 min mit frischen TBS für jede Wäsche waschen. Docht entfernt überschüssigen Puffer.
9. Gelten 3 Tropfen der wässrigen Montage Medium des Gewebes. Mit Pinzette, vorsichtig senken Sie ein sauberes Glas Deckglas auf das Gewebe, beginnend mit einer Kante und langsam senken die andere Kante, Trapping von Luftblasen zu vermeiden ab. Achten Sie darauf, nicht um das Deckglas zu verdrängen, wenn sofort imaging. Ansonsten erlauben das Eindeckmittel vor der Lagerung bei 4 ° c im Dunkeln trocknen.

4. Fluoreszenz-Mikroskopie

1. Wendung auf die Fluoreszenz Lampe, das Mikroskop und die Computer und lassen Sie die Lampe aufgewärmt gefärbte Gewebe in der Fluoreszenz-Mikroskop-Stufe gleitet 15 min. Platz. Verwenden Sie das Hellfeld-Bild, um das Gewebe bei 10facher Vergrößerung zu finden.
2. Geben Sie einen Tropfen des DdH ₂ O an die Oberfläche des Deckglases und verwenden Sie ein Objektiv 20 X Wasser eintauchen (NA = 1,0). Wählen Sie die 4 durchschnittliche Linienebene Scan einstellen. Legen Sie die Lochkamera Größe auf 1 luftig Einheit, die eine optische Scheibe ~ 3 Mikrometer gibt. Wählen Sie die Laserwellenlängen Anregung und Emission für jedes Fluorophor in separate Spuren für beste Signal.
   Hinweis: Alexa 488: λ _ex = 488 nm (Argonlaser) λ _Em = 493-570 nm; Texas Red: λ _ex = 561 nm (DPSS 561 nm Laser), λ _Em = 601-635 nm; DAPI: λ _ex = 405 nm (405 Diode Laser), λ _Em = 410-507 nm.
   1. Passen Sie die Laserleistung und gain-Einstellungen um die Signalstärke für jeden Track zu optimieren. Das zusammengesetzte Bild erfassen und speichern. Die gleichen Lasereinstellungen verwenden, um Fluoreszenz-Intensitäten in eine andere Folie vergleichen.
3. Zur Visualisierung der Fluoreszenzintensität in jedem Kanal, das RGB-Profil Werkzeuge Makro für ImageJ ¹⁰ zu installieren. Speichern Sie das Makro aus der Webseite als Text-Datei (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Wählen Sie im Menü ImageJ Plugins - > Makros - > installieren; Wählen Sie die Textdatei, die RGB-Profile-Tool zu installieren.
   1. In ImageJ die konfokale Image-Datei öffnen und konvertieren die zusammengesetzten Bilder von den 3 Stapeln zu RGB durch Ausführen der folgenden: Bild - > Farbe - > Channel-Tool. Wählen Sie " Composite " aus dem Dropdown-Menü und prüfen Sie alle drei Kanäle. Wählen Sie Bild - > Typ - > RGB-Farben.
   2. Wählen Sie die RGB-Profil-Werkzeug-Symbol und ziehen Sie eine Linie über den Abschnitt in das Bild, um ein Profil erstellt werden. Sichern Sie die Intensitätsdaten als Tabelle zum Plotten.

Ergebnisse

Immunofluoreszenz Vorbehandlung Schritt kann ein standard Immunfluoreszenz-Protokoll unmittelbar vor der Antigen-Retrieval und Immunostaining (Abbildung 1A) hinzugefügt werden. Montage des Gerätes Immunofluoreszenz kann auch durchgeführt werden, mit Hilfe verschiedener, preiswerte, handelsübliche Komponenten (Abbildung 1 b). Das Emissionsspektrum von weißem Phosphor LEDs deckt ein breites Spektrum von Wellenlängen macht sie...

Diskussion

Die Immunofluoreszenz Vorbehandlung des Gewebes in diesem Manuskript beschrieben ermöglicht eine effektive Beseitigung der Autofluoreszenz mit Standardkomponenten. Das Protokoll beschreibt Immunfluoreszenz Bildgebung der phosphorylierten Tau Aggregate in Formalin fixiert menschliche Gehirngewebe mit sekundären Antikörper konjugiert, Alexa 488 und Texas Red mit DAPI als eine nukleare Gegenfärbung. Um die Methode zu anderen Geweben anwenden, empfehlen wir eine 48 h Immunofluoreszenz Vorbehandlung der Probe als Ausgangs...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Sodium Choloride	Sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric Acid	Caledon Laboratory Chemicals	1506656
Sodium Azide	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	All components of photobleacher can be substituted based on availability
6 W LED Dimmable Desk Lamp	DBPower	DS501	All components of photobleacher can be substituted based on availability
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Sodium Hydroxide	BioShop Canada	SHY700.1
Water bath	Haake Fisons	K15
Slide collector	FisherScientific	12-587-17B
Staining Jar	FisherScientific	E94
Orbital Shaker	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Bovine Serum Albumin	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting medium	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710
Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	Software accompanies the Confocal Microscope
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Commercial chemical quencher	Biotum	23007