Semplice eliminazione di fluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano formalina per microscopia di immunofluorescenza

Riepilogo

Sfondo autofluorescenza dei campioni biologici complica spesso tecniche di imaging basata sulla fluorescenza, particolarmente in tessuti postmitotic umani invecchiati. Questo protocollo descrive come autofluorescence da questi campioni possa essere efficacemente rimosse utilizzando una luce disponibile in commercio che emette luce a diodi fonte a photobleach il campione prima della colorazione.

Abstract

L'immunofluorescenza è un metodo comunemente utilizzato per visualizzare compartimenti subcellulari e per determinare la localizzazione delle proteine specifiche all'interno di un campione di tessuto. Un grande ostacolo per l'acquisizione di immagini di alta qualità immunofluorescenza è endogeno autofluorescenza del tessuto causato da pigmenti di invecchiamento quali lipofuscin o da processi di preparazione del campione comuni quali fissazione dell'aldeide. Questo protocollo descrive come fluorescenza di fondo può essere notevolmente ridotto attraverso photobleaching utilizzando array di diodi (LED) prima del trattamento di luminescente fosforo bianco con sonde fluorescenti. L'emissione ad ampio spettro di fosforo bianco LED consentono per lo sbiancamento di fluorofori tutta una serie di picchi di emissione. L'apparato di photobleaching può essere costruito da componenti normalizzati a bassissimo costo e offre un'alternativa accessibile a quenchers chimici disponibili in commercio. Un photobleaching di pretrattamento del tessuto seguito da immunofluorescenza convenzionale genera immagini gratis di sfondo autofluorescence. Rispetto stabilito quenchers chimico che ha ridotto la sonda come sfondo segnali, photobleaching trattamento non ha avuto effetto sull'intensità di fluorescenza sonda mentre efficacemente ridotto fluorescenza di fondo e il lipofuscin. Anche se photobleaching richiede più tempo per il pre-trattamento, maggiore intensità LED Array può essere usato per ridurre tempo photobleaching. Questo metodo semplice potenzialmente può essere applicato ad una varietà di tessuti, tessuti particolarmente postmitotic che si accumulano lipofuscin come il cervello e i muscoli cardiaci o scheletrici.

Introduzione

Microscopia di fluorescenza usando gli anticorpi proteine specifiche di targeting è abitualmente utilizzata per visualizzare le proteine di interesse nella coltura delle cellule e dei tessuti. È una complicazione importante per l'acquisizione di immagini nitide e definitive in immunofluorescenza autofluorescenza, che può essere causato in modo endogeno in tessuti di mammiferi, di età pigmento lipofuscin e di proteine come collagene ed elastina^{1, 2}. Altre fonti di autofluorescence possono essere introdotto attraverso passaggi di preparazione del campione come aldeide fissazione³. Granelli di lipofuscin, composti principalmente da proteine oxidatively modificata e residui di degradazione dei lipidi, si accumulano nelle cellule longevi con età maggiore di². Questo provoca difficoltà in imaging postmitotic tessuti come il cervello e muscoli cardiaci o scheletrici, come lo spettro di emissione di fluorescenza del lipofuscin è vasto e variabile, spesso in concomitanza con la lunghezza d'onda di emissione di fluorofori comune utilizzato per ⁴di etichettatura. Questi fattori rendono la formazione immagine del tessuto di cervello umano da casi di malattie neurodegenerative di manifestazione tardiva come degenerazione lobare frontotemporale (FTLD) particolarmente impegnativo.

Per ridurre l'autofluorescenza, abbiamo messo a punto una tecnica in cui si irradiano le sezioni di tessuto montata con una luce bianca che emettono array di diodi (LED) utilizzando una scrivania della famiglia lampada⁵. Questa semplice tecnica fornisce un'alternativa alle tecniche che utilizzano chimica quenchers come CuSO₄ acetato di ammonio, o commercialmente disponibili tempra coloranti quali Sudan nero B e nero eriocromo T⁶. Ha anche un significativo risparmio di costi oltre multispettrali LED tecniche photobleaching lampada ed evita le complicazioni e gli artefatti generati da metodi di rimozione di autofluorescenza digitale come spettrale ONU-miscelazione^7,8. Fosforo bianco LED hanno un ampio spettro di emissione, ad alta luminosità e basso costo di produzione, che li rende ideali come componente COTS per photobleaching una varietà di cromofori^5,9.

In questo protocollo, dimostriamo la costruzione di un apparato di photobleaching utilizzando componenti accessibili e photobleaching di applicare a un caso di tessuto FTLD contenente inclusioni tau-positive (FTLD-T) utilizzando un anticorpo specifico per tau fosforilata. Dimostriamo l'effetto di photobleaching su imaging con etichetta fluorescente anticorpi che impiegano due cromofori comunemente utilizzati: Alexa 488 e Texas Red. L'effetto di photobleaching contro sezioni non trattate o quelli trattati con un quencher chimico commercio sono quantificati e rispetto. Questo pretrattamento photobleaching può essere incorporato in qualsiasi protocollo di colorazione di immunofluorescenza standard per rimuovere autofluorescence in un campione biologico.

Protocollo

Nota: il lavoro presentato è stato effettuato in conformità alle norme internazionali, tra cui la conferenza internazionale sull'armonizzazione (ICH), il Consiglio per internazionale organizzazioni di Medical Sciences (CIOMS) e i principi della dichiarazione di Helsinki. Uso di tessuti umani è stato con l'approvazione della University Health Network Research Ethics Board. I campioni di cervello umano sono stati raccolti come parte della banca del tessuto cerebrale marittimo. Al momento della raccolta, il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti.

1. costruzione di photobleaching apparecchi e soluzioni

1. preparare soluzioni di riserva.
   1. Preparare 1 L di 1 x soluzione di soluzione fisiologica tamponata stock (1 x TBS) (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) sciogliendo 8,77 g di NaCl e 6,06 g di Tris base in 800 mL di ddH ₂ O e regolare il pH a 7.4 utilizzo HCl. portare il volume a 1 L e autoclave. < / li >
   2. preparare 10% (stock x 200) sodio azide sciogliendo 1 g di sodio azide in 10 mL di ddH ₂ O (10%, 200 x stock).
2. Per diapositive di formato standard 1-3, utilizzare una piastra Petri singolo 100 x 100 mm trasparente, quadrato come una camera di diapositiva. Per una camera singola diapositiva, è possibile aggiungere 0,25 mL di Stock in 200 di azoturo di sodio x a 50 mL di 1 x TBS per ottenere una soluzione di TBS azide 0.05%. Pila 2-3 camere di diapositiva verticalmente per elaborare ulteriori diapositive. Preparare un ulteriore 50 mL di soluzione di azide-TBS per ogni camera.
3. Creare un'impalcatura per elevare la camera diapositiva tale che una testa della lampada può andare bene sotto. Camera di diapositiva di
   1. per un 100 x 100 mm, tagliare le aperture nella parte inferiore e i lati di un 100 mm x 100 mm x 30 mm plastica contenitore e invertire il contenitore. Garantire le aperture laterali sono grandi abbastanza per montare una sorgente di luce LED e garantire l'apertura inferiore è abbastanza grande, tale che la luce dalla sorgente di luce raggiunge la camera di campionamento senza impedimento.
   2. Applicare nastro isolante al patibolo per aumentare l'aderenza tra il patibolo e la camera/benchtop del campione. Utilizzare qualsiasi materiali alternativi per costruire l'impalcatura fintanto che si eleva in modo sicuro la camera di diapositiva senza ostacolare la luce di raggiungere il campione.
4. Rimuovere qualsiasi diffusori o plastici opachi dalla lampada di scrittorio che può ostacolare la luce LED raggiungano direttamente il campione (se possibile) e orientare verso l'alto la matrice di LED. Posizionare la camera dell'impalcatura e far scorrere sopra la matrice di LED. Utilizzare una lampada con un collo flessibile per una facile manipolazione.
5. Costrutto una cupola riflettente coprire per l'apparato di rivestimento interno di una scatola abbastanza grande da coprire la camera di diapositiva e il patibolo con carta stagnola. Utilizzare una casella di punta di pipetta da 1 mL per una camera singola o un 150 mm x 150 mm x 150 mm cartone per più verticalmente impilati chambers.

2. Photobleaching pre-trattamento delle sezioni del tessuto

Nota: preparazione di tessuti sezione può variare a seconda dell'origine del tessuto e la fissazione e l'incorporamento di metodi utilizzati. Qui, il tessuto cerebrale (orbitofrontal gyri) da un caso di FTLD-T è stato risolto per ~ 2 giorni in formalina, eseguire attraverso un gradiente di saccarosio, incorporata in OCT e tagliare a µm 10 sezioni spesse utilizzando un criostato.

1. Freddo º c in un 4 camera, freddo armadietto o frigorifero, orientare la lampada sotto il patibolo e posizionare la camera di campione sul patibolo. Versare 50 mL di soluzione di azide-TBS nel pozzetto di misurazione.
2. Submerge tessuto sezioni montate su vetrini standard nella camera di diapositiva contenente azide-TBS usando il forcipe pulito. Per più diapositive, assicurarsi che le diapositive vengono inserite nella camera di un singolo livello.
3. Coprire l'apparecchio con la cupola riflettente, accendere la lampada a LED e incubare per 48 ore a 4 ° c.

3. Immunofluorescenza

1. a macchiare il tessuto per tau fosforilata usando il colorante di contrasto DAPI e Alexa 488 - e anticorpi secondari coniugati Texas Red, preparare soluzioni per ricupero dell'antigene, la permeabilizzazione, il blocco e la primaria grippaggio dell'anticorpo.
   1. Preparare 500 mL di ricupero dell'antigene buffer (10 mM acido citrico, acido etilendiamminotetracetico di 2 mM, 0.05% Tween 20; pH 6,2) sciogliendo 0,92 g di acido citrico e 0,37 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in 500 mL di ddH ₂ O. regolare il pH a 6.2 con NaOH e aggiungere 0,25 mL di Tween 20.
   2. Preparare 500 mL di 0.025% Triton X-100 in soluzione TBS (TBS-Triton) aggiungendo 0,125 mL di Triton X-100 a 500 mL 1 x TBS.
   3. Preparare una soluzione di 1% albumina di siero bovino (BSA) in TBS (tampone BSA-TBS) sciogliendo 0,1 g BSA in 10 mL di TBS.
   4. Preparare una soluzione di blocco con l'aggiunta di 0,2 mL di siero di capra normale a 1,8 mL di 1% BSA/TBS.
   5. Per ogni diapositiva, preparare 150 µ l di soluzione di anticorpo primario (diluizione 1: 100) di pipettaggio 1,5 µ l di anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) anticorpo in 148,5 µ l di 1% BSA-TBS buffer e lasciare sul ghiaccio
2. Per eseguire il ricupero dell'antigene, immergere i vetrini photobleached verticalmente in un collettore di diapositiva contenente 25 mL di tampone di ricupero dell'antigene. Fissare il collettore con nastro e/o stringhe tale che il collettore non rientra nel bagno di acqua. Scaldare il collettore in un bagno di acqua a 90 ° c per 30 min e consentire al collector raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti prima di rimuovere le diapositive. Non rimuovere le diapositive immediatamente come essa causerà le sezioni ad asciugarsi.
3. Trasferire gli scivoli dal raccoglitore di ricupero dell'antigene in una vaschetta di colorazione riempita con 30 mL di TBS-Triton e lavare le sezioni per 5 minuti su agitatore orbitale con agitazione delicata. Ripetere il lavaggio una volta con fresco TBS-Triton. Stoppino via tampone in eccesso con un panno privo di lanugine e delineare il tessuto con una penna idrofobica. Fare attenzione a non per lasciare le diapositive asciugare.
   1. Per ogni diapositiva, bloccare il tessuto di pipettaggio 200 µ l di soluzione sul tessuto di blocco e porre il vetrino in una camera umidificata. Costruire la camera inserendo un portavetrini all'interno di una casella di punta della pipetta contenente un tovagliolo di carta bagnato. Incubare a temperatura ambiente per 2 h su una superficie piana. Garantire che la soluzione bloccante copre completamente il tessuto.
4. Eliminare la soluzione bloccante tramite aspirazione e pipettare 100-150 µ l di soluzione di anticorpo primario sul tessuto. Assicurare un volume sufficiente di anticorpo è presente e che la sezione sia su una superficie piana per evitare la messa in comune di soluzione di anticorpo ad un lato. Incubare a 4 ° c durante la notte in una camera umidificata.
5. Preparare la miscela di anticorpo secondario e il colorante di contrasto DAPI nucleare.
   1. Per ogni diapositiva, preparare 150 µ l di miscela di anticorpo secondario (diluizioni 1: 100) con l'aggiunta di 1,5 µ l di anti-topo di capra Alexa 488 e 1,5 µ l di anti-topo di capra Texas Red a 147 µ l di BSA-TBS e lasciare sul ghiaccio.
   2. Preparare 0,1 µ g/mL DAPI colorante di contrasto di diluizione seriale. Mescolare accuratamente la soluzione di riserva e diluire 1 µ l di stock 5 mg/mL DAPI nel 999 di TBS per fare 1 mL di soluzione di 5 µ g/mL. Per ogni diapositiva, diluire 3 µL 5 µ g/mL di soluzione con 147 µ l di TBS a una concentrazione finale di 0.1 µ g/mL.
      Attenzione: DAPI è un noto agente mutageno e deve essere maneggiato con cura.
6. Rimuovere l'anticorpo primario dall'aspirazione. Immergere i vetrini in un vetro colorazione barattolo contenente 30 mL di TBS-Triton e lavaggio per 5 min con miscelazione delicata su agitatore orbitale. Ripetere la fase di lavaggio con fresco TBS-Triton. Stoppino via l'eccesso TBS-Triton e pipettare 100 a 150 µ l di miscela di anticorpo secondario per ogni diapositiva.
   1. Assicurarsi che il tessuto è completamente coperto dalla miscela dell'anticorpo. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente nella camera umidificata al buio.
7. Eliminare la miscela di anticorpo secondario tramite aspirazione e trasferire la diapositiva in un vetro colorazione barattolo contenente 30 mL di TBS (nessun Triton). Lavare per 5 min con miscelazione delicata su agitatore orbitale. Ripetere la fase di lavaggio con TBS. fresco applicare 100 a 150 µ l di colorante di contrasto di 0,1 µ g/mL DAPI a ogni diapositiva e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
8. Trasferire i vetrini di un vetro colorazione barattolo contenente TBS e lavare 3 volte con miscelazione delicata per 5 minuti ciascuno, utilizzando freschi TBS per ogni lavaggio. Tampone in eccesso assente stoppino.
9. Applicare 3 gocce di mezzo di montaggio acquoso al tessuto. Usando il forcipe, abbassare delicatamente un coprioggetto in vetro pulito sul tessuto, iniziando con un bordo e lentamente abbassando l'altro bordo per evitare l'intrappolamento di bolle d'aria. Fare attenzione a non per rimuovere il vetrino coprioggetto se imaging immediatamente. In caso contrario, consentire il mezzo di montaggio a secco prima della conservazione a 4 ° c al buio.

4. Microscopia a fluorescenza

1. Disabilita la lampada a fluorescenza, il microscopio e il computer e attendere che la lampada si riscaldi per 15 min. posto il tessuto macchiato i vetrini nel tavolino del microscopio di fluorescenza. Utilizzare il campo luminoso immagine per individuare il tessuto a 10 ingrandimenti.
2. Applicare una goccia di ddH ₂ O sulla superficie del vetrino coprioggetto e utilizzare un obiettivo di 20 x acqua immersione (NA = 1.0). Selezionare la scansione 4-linea aereo media impostazione. Impostare la dimensione del foro stenopeico 1 unità arioso che dà una fetta ottico di ~ 3 micron. Selezionare lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione laser per ogni fluoroforo in tracce separate per il miglior segnale.
   Nota: Alexa 488: λ _ex = 488 nm (laser ad argon) λ _em = 493-570 nm; Texas Red: λ _ex = 561 nm (laser di DPSS 561 nm), λ _em = 601-635 nm; DAPI: λ _ex = 405 nm (laser diodo 405), λ _em = 410-507 nm.
   1. Regolare la potenza del laser e di ottenere le impostazioni per ottimizzare l'intensità del segnale per ogni traccia. Raccogliere l'immagine composita e salvare. Utilizzare le stesse impostazioni di laser per confrontare l'intensità di fluorescenza in un'altra diapositiva.
3. Per la visualizzazione di intensità di fluorescenza in ogni canale, installare la macro di strumenti profilo RGB per ImageJ ¹⁰. Salvare la macro dalla pagina Web come file di testo (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Selezionare il menu ImageJ plugin - > macro - > installare; Selezionare il file di testo per installare lo strumento di profili RGB.
   1. Aprire il file di immagine confocale in ImageJ e convertire le immagini composite da 3 pile a RGB procedendo come segue: immagine - > colore - > strumento di canale. Selezionare " composito " dal menu a discesa e controllare tutti i tre canali. Quindi, selezionare immagine - > tipo - > di colore di RGB.
   2. Selezionare l'icona di strumenti profilo RGB e tracciare una linea attraverso la sezione nell'immagine da profilare. Salvare i dati di intensità come un foglio di calcolo per la stampa.

Risultati

Il passo di pre-trattamento photobleaching può essere aggiunto per un protocollo di immunofluorescenza standard immediatamente prima di ricupero dell'antigene e immunostaining (Figura 1A). Il montaggio dell'apparecchiatura photobleaching può essere eseguito anche utilizzando vari, poco costosi, disponibile immediatamente componenti (Figura 1B). Lo spettro di emissione del fosforo bianco LED copre una vasta gamma di lunghezze d'...

Discussione

Il photobleaching e pre-trattamento dei tessuti descritto in questo manoscritto permette per l'efficace eliminazione di autofluorescenza utilizzando componenti normalizzati. Il protocollo descrive la formazione immagine di immunofluorescenza degli aggregati di tau fosforilata nel tessuto formalina-fisso cervello umano usando anticorpi secondari coniugati a Alexa 488 e Texas Red, con DAPI come una colorazione nucleare. Per applicare il metodo ad altri tessuti, si consiglia di eseguire un pre-trattamento di 48 h photobleac...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Sodium Choloride	Sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric Acid	Caledon Laboratory Chemicals	1506656
Sodium Azide	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	All components of photobleacher can be substituted based on availability
6 W LED Dimmable Desk Lamp	DBPower	DS501	All components of photobleacher can be substituted based on availability
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Sodium Hydroxide	BioShop Canada	SHY700.1
Water bath	Haake Fisons	K15
Slide collector	FisherScientific	12-587-17B
Staining Jar	FisherScientific	E94
Orbital Shaker	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Bovine Serum Albumin	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting medium	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710
Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	Software accompanies the Confocal Microscope
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Commercial chemical quencher	Biotum	23007