التحديد الكمي الوحيدات البشرية إنزيمية في المختبر واللمفاويات مورين الاتجار في فيفو

Summary

بروتوكولات للتقييم الكمي اللمفاويات إنزيمية والهجرة أدوات هامة لبحوث علم المناعة. ويرد هنا، بروتوكولا في المختبر أن التصاريح في الوقت الحقيقي، متعدد التقييم للهجرة الخلية، وكذلك تكميلية في فيفو تقنية تمكينية تتبع الخلايا الأصلية للطحال.

Abstract

إنزيمية هو الهجرة على طول تدرج كيميائية محددة¹. هي المستقطبات chemotactic السيتوكينات التي تشجع الاتجار بالهاتف الخلوي مع الخصائص التشريحية والزمانية². به وظيفة هامة من الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى التي يمكن أن تكون الكمية المقررة في المختبر. هذه المخطوطة يصف الأساليب التي تسمح بتقييم به، سواء في المختبر و في فيفو، لأنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك خطوط الخلايا والخلايا الأصلية. في المختبر، يسمح الشكل القائم على لوحة المقارنة بين شروط متعددة في وقت واحد في الوقت الحقيقي، ويمكن أن تنجز في غضون حاء – 1-4 في المختبر فحص ظروف ويمكن التلاعب بها لإدخال الخصوم، ويضع فضلا عن تميز به من تشيموكينيسيس، وحركة عشوائية. في فيفو الاتجار التقييمات، يمكن تسميته بالأصباغ الفلورية متعددة الخلايا المناعية والمستخدمة لنقل التبني. العلامات التفضيلية للخلايا يسمح للخلايا المختلطة السكان الأخذ في الحيوان نفسه، وبالتالي تقليل التباين وتقليل عدد الحيوانات اللازمة لتجربة تعمل بشكل ملائم. الهجرة في الأنسجة اللمفاوية تحدث في أقل من 1 ساعة، ويمكن أخذ عينات متعددة الأنسجة المقصورات. التدفق الخلوي عقب الحصاد الأنسجة يسمح بإجراء تحليل سريع والكمية لأنماط هجرة العديد من أنواع الخلايا.

Introduction

حصانة قوية يتطلب التنسيق المعقد الزماني والمكاني لعدد هائل أنواع الخلايا من أجل الاستجابة بشكل مناسب للإصابة والعدوى، وتوليد سيلفتوليرانسي. فقد اكتشفت عدة عشرات من مستقبلات تشيموكيني وعلى يغاندس المقابلة وتتسم الآليات الجزيئية تقدم بالخلايا المحددة التي يمكن أن تكون موجهة إلى أنسجة محددة في وقت محدد. وهكذا، دراسة إنزيمية والهجرة عنصرا لا غنى عنه لأبحاث علم المناعة. في الواقع، استخدمت مقايسة الموصوفة في المختبر مؤخرا كأداة لفحص لتحديد مساعد chemotactic أن يسرع به خلايا تي تجاه المستقطبات 19 و 21 ج-ج³. وغرض الأساليب الموصوفة هنا السماح بتقييمات كمية للخلايا المناعية إنزيمية في المختبر و في فيفو.

مقايسة الدائرة Boyden (الهجرة الخلية والغزو) أسلوب غير مكلفة واستنساخه والسريع لتقييم خلية الهجرة^4،5. في التحليل القياسي، مجلس الشيوخ هو المصنف مع الخلايا، ويتم فصل بواسطة إدراج مسامية من النواب، التي تهاجر الخلايا. وفي الوقت المطلوب، يمكن إصلاح الخلايا التي تم ترحيلها إلى الجانب السفلي الإدراج والملون كوانتيتاتيون بالفحص المجهري الخفيفة. ومع ذلك، هذه القياسات تحد من جمع البيانات إلى نقطة نهاية واحدة، مما يحول دون جمع البيانات الحيوية ويمكن أن تتطلب التحسين واسعة النطاق لتحديد نقطة الوقت الأمثل للتحليل. هنا، يتم وصف تعديلات عدة تسمح في الوقت الحقيقي، والكمية ومتعدد القياسات من إنزيمية في المختبر.

للدراسات في فيفو ، يتم استخدام نقطة نهاية فنية، إلا وهي تراكم الخلايا في حجرة أنسجة معينة محددة. يتم إدخال الخلايا المسماة من قبل الجهات المانحة إلى الحيوانات المستفيدة من خلال نقل التبني. يمكن بعد ذلك تحديد هذه الخلايا المانحة التدفق الخلوي بعد الحصاد أنسجة المتلقي. وقدم أيضا هو استراتيجية التوسيم المشترك الذي يسمح لتحديد الاتجار بأنواع الخلايا المختلفة داخل حيوانا مستلم واحد. هذا الأسلوب يلغي الاختلاف بين الحيوانات من حقن الخلايا، وحسابات للتقلب بين الحيوان الفسيولوجية.

Protocol

جميع إجراءات أقرتها جامعة روكفلر ' s "رعاية الحيوان المؤسسية" و "استخدام اللجنة". تم إيواء جميع الحيوانات تحت ظروف معينة خالية من مسببات المرض.

1-إنزيمية في المختبر

1. الثقافة THP-1 الخلايا ⁶ في روزويل بارك التذكاري معهد 1640 (RPMI 1640) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و (2-هيدروكسيثيل)-1-4- حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (حبيس؛ 25 مم) (إتمام الإعلام)، الحفاظ على الكثافة بين 0.5-1.0 × 10 ⁶ خلايا/مل.
طبق
2. في 35 مم خلية ثقافة، تسمية 3.5 × 10 ⁵ THP-1 الخلايا كل حالة مع أسيتوكسيميثيل كالسين (كالسين-صباحا؛ 2.5 ميكرومتر) أو أخرى صبغة الفلورسنت مناسب في وسائل الإعلام كاملة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30
   ملاحظة: يجب أن تكون الأصباغ نفاذية غشاء الخلية ومتوافقة مع وسم الخلية يعيش.
3. الحارة قبل قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: بالإضافة إلى التحكم في درجة الحرارة، وظيفة الأسفل القراءة مطلوباً أيضا. راجع الخطوة 1.10.2 عن بديل لقارئ لوحة للتحديد الكمي لترحيل الخلايا.
4. بينما يتم تسمية الخلايا، تعد لوحة المقايسة ومجلس النواب- لوحة
   1. استخدام ثقافة الأنسجة 24-جيدا، مع شرط واحد كل بئر. أداء كل شرط في ثلاث نسخ.
   2. ميليلتر إضافة 750 من هانك ' s خفف الملح الحل (حبس) مخزنة مع 25 مم حبيس و 0.1% البقري ألبومين المصل (BSA) للوحة 24-جيدا. وهذا بمثابة شرط التحكم القاعدية. آبار
      1. استخدام أخرى لشروط المقارنة، دائماً الحفاظ على الحجم الإجمالي في الدائرة السفلي في 750 ميليلتر.
         ملاحظة: في هذا المثال، يخدم البشرية الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1) كعنصر إيجابي إنزيمية ⁷.
         1. تجميع خليط كاشف عن طريق الجمع بين حبس مع 25 مم حبيس، جيش صرب البوسنة (0.1%)، والعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 (75 نانوغرام/ملليلتر). استخدام مصل بقرى الكبار (2.7% v/v) مع العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 كعنصر إيجابي إضافي.
            ملاحظة: يتوقف تركيز تشيموكيني وتشيموكيني على المحور تشيموتاكتيك قيد الدراسة. هو حراكه العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 المجففة بالتبريد في الماء المقطر مع جيش صرب البوسنة (0.1 ٪) لجعل حل أسهم بتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. وهذا يمكن أن تضعف في المياه لإيجاد حل عملي من 10 ميكروغرام/مل. إضافة ميكروليتر 5.6 هذا الحل إلى مجلس النواب-
   3. بعد اكتمال تشكيل الدوائر أسفل مكان إدراج مسامية في كل بئر، ضمان أن الإدراج علامات تبويب محاذاة مع الشقوق اللوحة.
      ملاحظة: اختر حجم المسام المناسبة لإدراج. وحيدات الخلايا الليمفاوية، وحجم مسام ميكرومتر 3 أداء جيدا. قد تتطلب بعض أنواع الخلايا و/أو أنظمة تشيموكيني على سطح معدني مغلف بمصفوفة للهجرة المثلى. على سبيل المثال، لقياس THP-1 الوحيدات به نحو العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1, فيبرونيكتين أو إدراج المغلفة بالكولاجين ينصح. يجب أن يكون الإدراج لوحة للقارئ كوانتيتاتيون، طلاء ضوء إيمبيرميانت، مثل البولي ايثلين، لمنع الكشف عن عدم ترحيل الخلايا في الجزء العلوي للدائرة ⁸.
5. بعد حضانة الخلايا لمدة 30 دقيقة مع كالسين صباحا، نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. فحص خلايا أجهزة الطرد المركزي في 1,000 ز x للحد الأدنى 2 بصريا الخلايا للتأكد من الإقبال على كالسين-صباحا ( الشكل 1).
6. بعناية إزالة المادة طافية باستخدام الشافطة فراغ. أغسل المسمى خلايا خالية من المصل ربمي 1640 تستكمل مع حبيس 25 مم. الطرد المركزي خلايا في 1,000 س ز 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية.
7. الخلايا ريسوسبيند في المصل خالية ربمي 1640 تستكمل مع حبيس 25 مم. حساب عدد الخلايا وضبط مستوى الصوت حيث تكون الخلايا بتركيز نهائي من 1.0-1.5 × 10 ⁶ خلايا/مل.
8. الاستغناء عن 250 ميكروليتر من تعليق خلية في الإدراج (مجلس الشيوخ)-
9. بعد جميع الدوائر العليا قد ملئت، بلطف رفع اللوحة، وفحص الجزء السفلي من فقاعات الهواء التي قد تتداخل مع الهجرة والكشف عن وجود. لإزالة فقاعة، أول محاولة إزالة ثم إعادة تعيين موضع الإدراج. إذا فشل، استخدم إبرة ز 27 لثقب الفقاعة، وثم إعادة تحديد موضع الإدراج.
10. بوضع اللوحة في قارئ لوحة قبل حرارة 37 درجة مئوية.
    1. الحصول على قراءات الأسفار من أسفل عند فواصل زمنية دقيقة 1-3. عند استخدام كالسين-صباحا، تعيين الأسفار أطوال موجية الإثارة والانبعاثات في 485 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي. الاعتماد على نظام تشيموكيني ونوع الخلية، تحدث به عادة ما يزيد على 1-4 ح ( الشكل 2A).
    2. كبديل للقياسات المستمرة باستخدام قارئ لوحة، صورة الآبار باستخدام مقلوب فلورسنت مجهر ( الشكل 2) قادرة على الإثارة والكشف عن الضوء في 485 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي. استخدم تكبير منخفض لالتقاط معظم الجانب السفلي الإدراج. تحديد الخلايا بمعالجة الصور مع إيماجيج أو برامج مماثلة ⁹.

2. نقل التبني "لمفاوية مورين"

1. 1. أنيسثيتيزي 8-12 أسبوع من إعداد الخلايا المانحة-الفئران الذكور المانحة C57BL/6J القديمة مع isoflurane التخدير (1-3%) باستخدام المبخر. تأكيد عمق المناسبة للتخدير بأصبع القدم-قرصه-
   2. ضع الماوس في موقف ضعيف. جعل شق خط الوسط مع مشرط وتحديد موقع الطحال في الفضاء البريتوني الأيسر العلوي. المكوس الطحال كلها وفي وسائل الإعلام كاملة (RPMI تستكمل مع 10% FBS و 25 مم هيبيس؛ 1 مل/الطحال) على الجليد. Euthanize الحيوانات تخديره من الجهات المانحة بقطع الرأس-
   3. طحن أنسجة الطحال بلطف من خلال 40 ميكرون النايلون في وسائط كاملة (1 مل/spleen) باستخدام نهاية المكبس حقنه لجعل تعليق خلية واحدة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
   4. 4 إضافة كميات من كلوريد الأمونيوم البوتاسيوم (ACK) تحلل المخزن المؤقت واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة الكريات الحمراء.
   5. الطرد المركزي الخلايا في 1,000 س ز 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية. إذا بقيت الكريات الحمراء في بيليه، ريسوسبيند في المخزن المؤقت لتحلل ACK، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي خلايا في غ س 1,000 لمدة 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية.
   6. ريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام كاملة بتركيز 2-5 × 10 ⁷ خلايا/مل، ثم سلالة تعليق خلية عن طريق شبكة نايلون 40 ميكرون لإزالة الحطام الخلية.
   يعيش
   7. التسمية 1 × 10 ⁷ خلايا والمتلقي الماوس مع صبغة فلورسنت متوافقة مع الخلايا، والتي سيتم الاحتفاظ عند التثبيت لاحقاً، مثل 5-تشلوروميثيلفلوريسسين اسيتات (تركيز نهائي 2 ميكرومتر) ¹⁰ . احتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30
      ملاحظة: لتعقب السكان خلية واحدة أو أكثر، استخدم الأصباغ الفلورية الأخرى مع السكان خلية إضافية. سبيل، يمكن أن توصف بجزء من خلايا المانحين مع البنزويل 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) الأمينية) تيتراميثيلرهوداميني (تركيز نهائي 2 ميكرومتر) ¹¹-
   8. إضافة 4 وحدات حبس تكملها 25 مم هيبيس، ثم الطرد المركزي في س 1,000 ز 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه في حبس وتستكمل مع حبيس 25 مم بتركيز 1 × 10 ⁸ خلايا/مل نهائي.
      1. في حالة استخدام أكثر من صبغة الفلورسنت، إبقاء السكان خلية منفصلة حتى قبل الحقن مباشرة.
      2. نقل من قاسمة صغيرة (10 ميكروليتر) من الخلايا لكل لون إلى حل مثبت (1 مل) تعويض اللاحقة التدفق الخلوي-
2. ونقل الخلايا الليمفاوية
   1. تخدير الأسبوع 8-12-القديمة C57BL/6J ذكور الفئران المستفيدة مع إيسوفلوراني (1-3%) باستخدام المبخر؛ تأكيد عمق التخدير عن طريق رشة إصبع القدم. تطبيق مرهم البيطرية للحيوان ' العيون s لمنع تجفيف.
   2. بإيجاز دوامة المانحة الخلايا (1 ثانية) ونقل إلى 1 مل حقن حقنه مع 27 غ، 0.5 في إبرة، الجمع بين السكان خلية مسماة متفاوتاً، إذا كان ذلك ممكناً.
      1. نقل من قاسمة صغيرة (10 ميكروليتر) من الخلايا المختلطة إلى حل مثبت (1 مل) لتحليل تدفق اللاحقة الخلوي-
   3. مكان الحيوانات المانحين في موقف المعرضة. تطبيق الضغط والذيلية خفيفة على الجلد الظهرية للعين، مما تسبب في مقلة العين نتا قليلاً.
   4. المباشر الإبرة ميديالى وحقن 100 ميليلتر من تعليق الخلية المانحة الرجعية أوربيتالي كل الماوس المتلقية. ويمكن أيضا حقن الخلايا عن طريق الوريد الذيل.
   5. تدريجيا سحب إبرة حقن وضع الماوس وحدها في قفص انتعاش. مراقبة الحيوانات حتى قد وعيه؛ عودة مرة تماما المستردة الحيوان للإسكان الاجتماعي-
3. جمع وتحليل
   1. بعد ح 1، تخدير الفئران المستفيدة مع التخدير إيسوفلوراني (1-3%) باستخدام المبخر؛ وتأكيد عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين. حصاد الطحال (أو الأنسجة الأخرى للفائدة) (الخطوة 2.1.2.) من كل مستلم الماوس والمكان إلى وسائط كاملة (1 مل والمتلقي). Euthanize الحيوانات تخديره بقطع الرأس-
      ملاحظة: سوف تزيد فترات أطول قبل الحصاد الأنسجة تراكم الأنسجة من خلال على الأقل 24 h.
   2. طحن أنسجة الطحال بلطف من خلال 40 ميكرون النايلون في وسائط كاملة باستخدام نهاية المكبس حقنه لجعل تعليق خلية واحدة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
   المخزن المؤقت
   3. 4 إضافة مجلدات من تحلل ACK واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي من تعليق خلية في 1,000 س ز 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل المادة طافية.
   المخزن المؤقت
   4. الخلايا ريسوسبيند في تلطيخ (المالحة مخزنة الفوسفات وتستكمل مع 1% FBS). حساب عدد الخلايا وضبط لتركيز نهائي من 3 × 10 ⁷ خلايا/مل. نقل 100 ميليلتر من تعليق خلية إلى 96-فضلا عن جولة أسفل لوحة.
   5. الخلايا وصمة عار لعلامات المطلوب (انظر الجدول للمواد) لتحليل التدفق الخلوي. إضافة الأجسام المضادة مترافق fluorophore (انظر "الجدول للمواد") ضد علامات المرجوة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. إضافة 100 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت، الطرد المركزي خلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق وتجاهل المادة طافية.
   6. ريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت، الطرد المركزي خلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق وتجاهل المادة طافية.
   المخزن المؤقت
   7. ريسوسبيند بيليه في تلطيخ ميليلتر 125 والحصول على العينات باستخدام سيتوميتير تدفق استخدام إجراءات معيارية.
      ملاحظة: صبغة الأخضر هو متحمس بليزر 488 نانومتر ويتم الكشف عن الانبعاثات مع المرشحات مزدوج اللون 505 و 530/30. صبغة اللون البرتقالي هو متحمس من 561 الكشف عن شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات بواسطة عامل تصفية مزدوج اللون 582/15.
      1. استخدام حفظ الخلايا من 2.1.8.2 للتعويض عن كل صبغة الفلورسنت.
         ملاحظة: استخدام التعويض على أساس حبة مع fluorophores مطابقة بالإثارة وأطياف الانبعاث من الأصباغ التوسيم سيؤدي في التعويض دون المستوى الأمثل.
      2. استخدام خلايا الإدخال المحفوظة من الخطوة 2.2.2.1 لدقة تحديد النسبة الأثران المسمى خلايا الإدخال في حالة استخدام واحد أو أكثر من السكان المسمى ( الشكل 3). حساب الأنسجة الهجرة محددة استناداً إلى النسبة المسمى للخلايا غير مسمى ( الشكل 4).

النتائج

عند استخدام صبغة كالسين-صباحا، سيؤكد التفتيش البصري لخلايا امتصاص التسمية (الشكل 1). سوف تتبع القراءات الفلورسنت الآلي الهجرة كخلايا العبور على الجانب السفلي من الإدراج على مر الزمن. هذه البيانات تظهر بوضوح تنظيم دورات تعريفية للهجرة الخلية نحو العملية ا...

Discussion

التحديد الكمي للهجرة الخلية المناعية يمكن إنجازه باستخدام بسيطة وسريعة فحوصات في المختبر و في فيفو. نظهر إنزيمية في المختبر من وحيدات البشرية استجابة للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 التدرج والتعزيز بالمصل. في فيفو، كان متفاوتاً المسمى المانحة مورين سبلينوسيتيس ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer