Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Resumo

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Resumo

Quimiotaxia é a migração ao longo de um gradiente químico específico¹. Quimiocinas são Quimiotáticos citocinas que promovem o tráfico celular com especificidade anatómica e temporal². Quimiotaxia é uma função crítica de linfócitos e outras células do sistema imunológico que podem ser quantitativamente avaliada em vitro. Este manuscrito descreve métodos que permitem a avaliação da quimiotaxia, tanto in vitro e em vivo, para tipos de diversas células incluindo linhas celulares e células nativas. O em vitro, formato baseado na placa permite a comparação das várias condições simultaneamente em tempo real e pode ser concluída dentro de 1-4 h. em vitro ensaio condições podem ser manipuladas para introduzir-se como agonistas e antagonistas, bem como diferencia quimiotaxia de chemokinesis, que é o movimento aleatório. Na vivo avaliação do tráfico, de células do sistema imunológico podem ser rotuladas com vários corantes fluorescentes e usadas para transferência adotiva. A rotulagem diferencial de células permite a populações de células mistas a ser introduzido o mesmo animal, assim, diminuindo a variância e reduzindo o número de animais necessários para uma experiência adequadamente alimentada. Migração no tecido linfoide ocorre em menos de 1h, e vários compartimentos de tecido podem ser saboreados. Citometria de fluxo após a colheita de tecidos permite uma análise rápida e quantitativa dos padrões migratórios de vários tipos de células.

Introdução

Imunidade robusta requer a coordenação temporal e espacial complexa de uma miríade de tipos de células, a fim de responder adequadamente a uma lesão, infecção e gerar auto-tolerância. Várias dezenas de receptors do chemokine e seus ligantes correspondentes foram descobertos e caracterizados fornecendo mecanismos moleculares pelos quais células específicas podem ser direcionados em um tecido específico em um tempo específico. Assim, estudar a quimiotaxia e a migração é um componente indispensável de pesquisa de Imunologia. Com efeito, o ensaio descrito em vitro recentemente foi usado como uma ferramenta de triagem para identificar um cofactor quimiotático que acelera a quimiotaxia de células T em direção de quimiocinas, 19 e 21 C C³. A finalidade dos métodos descritos aqui são para permitir avaliações quantitativas de célula imune quimiotaxia em vitro e in vivo.

O ensaio de câmara Boyden (migração celular e invasão) é um método barato, reprodutível e rápido para avaliar a migração de células^4,5. No ensaio de padrão, a câmara superior é semeada com células e é separada por uma inserção porosa de uma câmara inferior, na qual as células migram. No momento desejado, células que migraram para a parte inferior da inserção podem ser fixo e manchadas para quantificação por microscopia de luz. No entanto, tais medições restringem a coleta de dados para um único ponto de extremidade, o que impede a coleta de dados dinâmico e podem exigir a otimização extensiva para determinar o ponto ideal de tempo para análise. Aqui, várias adaptações são descritas que permite medições em tempo real, quantitativas e multiplexadas de quimiotaxia em vitro.

Estudos em vivo , é usado um ponto de extremidade funcional, ou seja, o acúmulo específico de células em um compartimento de determinado tecido. Células de doador previamente rotulado são introduzidas animais destinatários através de transferência adotiva. Estas células de doador posteriormente podem ser identificadas por citometria de fluxo após a colheita de tecidos destinatário. Também apresentado é uma estratégia co rotulagem que permite a determinação do tráfico de diferentes tipos de células dentro de um único animal de destinatário. Esse método elimina a variação entre animais da injeção de célula, contas e variabilidade fisiológica de animal para animal.

Protocolo

todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade Rockefeller ' s institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização. Todos os animais estavam alojados em condições específicas isentos de organismos patogénicos.

1. quimiotaxia In Vitro e

1. cultura THP-1 células ⁶ em Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 4-(2-hidroxietil) -1- piperazineethanesulfonic ácido (ácido HEPES 25mm) (completar a mídia), mantendo a densidade entre 0,5-1,0 x 10 ⁶ células/mL.
2. Cultura de células em um 35 mm prato, etiqueta 3.5 x 10 ⁵ THP-1 células por condição com acetoximetil calceína (calceína-AM; 2,5 µM) ou outra apropriada tintura fluorescente em mídia completa a 37 ° C por 30 min.
   Nota: Corantes devem ser permeável a membrana celular e compatível com live-célula rotulagem.
3. Pré-aquecer um leitor de placas a 37 ° C.
   Nota: Além do controle de temperatura, funcionalidade de leitura de fundo também é necessária. Consulte a etapa 1.10.2 para uma alternativa para um leitor de placas para quantificação de migração células.
4. Enquanto as células estão rotulando, preparar a placa de ensaio e câmara inferior. Placa
   1. uso de cultura de tecido 24-bem, com uma condição por bem. Realizar cada condição em triplicado.
   2. Adicionar 750 µ l de Hank ' s solução de sal de tampão (HBSS) tamponada com 25mm HEPES e 0,1% albumina de soro bovino (BSA) para a placa de 24. Isto serve como condição o controle basal.
      1. Uso outro poços para condições de comparador, mantendo sempre o volume total na câmara inferior a 750 µ l.
         Nota: Neste exemplo, monócitos humanos quimiotático proteína-1 (MCP-1) serve como o controle positivo para quimiotaxia ⁷.
         1. Montar a mistura reagente combinando HBSS com 25mm HEPES, BSA (0,1%) e MCP-1 (75 ng/mL). Usar soro bovino adulto (2,7% v / v) com 1-MCP como um controle positivo adicional.
            Nota: Concentração Chemokine e chemokine dependerá do eixo quimiotático sob estudo. MCP-1 liofilizado é resuspended em água destilada com BSA (0,1%) tornar-se uma solução com uma concentração final de 50 μg/mL. Isto pode ser diluído em água para uma solução de trabalho de 10 μg/mL. Adicionar 5.6 μL desta solução à câmara inferior.
   3. Após a composição das câmaras de fundo estiver concluída, coloque uma inserção porosa em cada poço, garantindo que as guias do inserto de alinham com os entalhes da placa.
      Nota: Escolha o tamanho de poro adequado para as inserções. Para monócitos e linfócitos, um tamanho de poro de 3 μm executa bem. Alguns tipos de células e/ou sistemas de chemokine podem exigir uma superfície revestida de matriz para migração ideal. Por exemplo, para medir a quimiotaxia de monócitos THP-1 no sentido de MCP-1, fibronectina ou inserções de colágeno-revestido são recomendadas. Para o leitor de placas para quantificação, a inserção deve ter um revestimento impermeant-luz, como o tereftalato de polietileno, para evitar a deteção de não-migração células na parte superior de câmara ⁸.
5. Após incubação de células por 30 min com calceína-AM, transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15mL. Células de centrifugar a 1.000 x g por 2 min. inspecionam visualmente as células para confirmar a aceitação de calceína-AM ( Figura 1).
6. Remover cuidadosamente o sobrenadante usando um aspirador a vácuo. Lave pilhas etiquetadas em soro livre RPMI 1640 suplementado com HEPES 25mm. Centrifugar as células a 1.000 x g por 2 min e descartar o sobrenadante.
7. Os eritrócitos em soro livre RPMI 1640 suplementado com HEPES 25mm. Contar as células e ajustar o volume para que as células estão em uma concentração final de 1.0-1.5 x 10 ⁶ células/mL.
8. Dispensar 250 μL da suspensão de células para a inserção (câmara superior).
9. , Depois de todas as câmaras superiores foram preenchidas, delicadamente levantem a placa e inspecionam a parte inferior para a presença de bolhas de ar que podem interferir com a migração e a deteção. Para remover uma bolha, primeiro tente remover em seguida re-posicionamento da inserção. Se malsucedido, usar uma agulha 27G para perfurar a bolha e, em seguida, coloque novamente a inserção.
10. Coloque a placa no leitor de placa previamente aquecido a 37 ° C.
    1. Leituras de fluorescência Acquire do fundo em intervalos de 1-3 min. Ao usar calceína-AM, defina a fluorescência excitação e emissão de comprimentos de onda em 485 nm e 520 nm, respectivamente. Dependendo do sistema de tipo e chemokine de célula, quimiotaxia ocorre tipicamente mais de 1-4 h ( Figura 2A).
    2. Como uma alternativa para medições contínuas usando um leitor de placas, imagem dos poços usando um fluorescente microscópio invertido ( Figura 2B) capaz de excitação e detecção de luz em 485 nm e 520 nm, respectivamente. Use uma baixa ampliação para capturar a maioria da parte inferior da inserção. Quantificar as células, processando as imagens com ImageJ ou similares de software ⁹.

2. Transferência adotiva de linfócitos de murino

1. preparação de células de doador
   1. Anesthetize semana de 8-12-ratos de doador masculino C57BL/6J velhos com isoflurano anestesia (1-3%), usando um vaporizador. Confirmar a profundidade apropriada da anestesia pelo dedo do pé-pitada.
   2. Colocar o mouse na posição supina. Fazer uma incisão com um bisturi e localize o baço no espaço peritoneal superior esquerdo. Excisar o baço inteiro e colocar em mídia completa (RPMI suplementado com 10% FBS e 25mm HEPES; 1 mL/baço) no gelo. Eutanásia em animais anestesiados doador por decapitação.
   3. Moer tecido baço suavemente através de 40 µm de malha de nylon em mídia completa (1 mL /spleen) usando a extremidade de um êmbolo da seringa para fazer uma célula única suspensão e transfira para um tubo cônico de 15 mL.
   4. Adicionar 4 volumes de lise de potássio (ACK) cloreto de amônio buffer e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para lisar eritrócitos.
   5. As células a 1.000 x g por 2 min à temperatura de centrifugação e descartar o sobrenadante. Se hemácias permanecem em pelota, resuspenda em tampão de Lise ACK, incubar durante 5 min à temperatura ambiente, centrifugue células a 1.000 x g por 2 min e descartar o sobrenadante.
   6. Ressuspender as células em mídia completa em uma concentração de 2-5 x 10 ⁷ células/mL e, em seguida, estique a suspensão de células através de uma malha de nylon de 40 µm para remover os resíduos de células.
   7. Label 1 x 10 ⁷ rato de células/destinatário com uma tintura fluorescente compatível com células vivas e que será mantida mediante fixação subsequente, tais como 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentração final 2 μM) ¹⁰ . Incubar a 37 ° C por 30 min.
      Nota: Para controlar a população de mais de um celular, use outras tinturas fluorescentes com populações de células adicionais. Por exemplo, uma parte das células do doador pode ser rotulada com 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoíla) amino) diversos (concentração final 2 μM) ¹¹.
   8. Adicionar 4 volumes HBSS suplementado com 25mm HEPES, em seguida, centrifugar a 1.000 x g por 2 min e descarte sobrenadante. Resuspenda o pellet em HBSS suplementado com HEPES 25mm para uma concentração final de 1 x 10 ⁸ células/mL.
      1. Se usando mais de um corante fluorescente, manter as populações de células separadas até imediatamente antes da injeção.
      2. Transferir uma pequena alíquota (10 μL) de células de cada cor para uma solução fixador (1 mL) para compensação de citometria de fluxo subsequente.
2. Transferência de linfócitos
   1. anestesiamos a semana de 8-12-velhos camundongos C57BL/6J destinatários machos com isoflurano (1-3%) usando um vaporizador; confirmar a profundidade de anestesia pelo dedo do pé-pitada. Aplicar a pomada veterinária animal ' olhos de s para impedir a secagem.
   2. Brevemente as células do doador vórtice (1 s) e a transferência para a seringa de injeção de 1 mL com 27 G, 0,5 na agulha, combinando populações de células diferencialmente rotulado, se aplicável.
      1. Transferir uma pequena alíquota (10 μL) de células mistas para uma solução fixador (1 mL) para análises de citometria de fluxo subsequente.
   3. Colocar animais dadores de bruços. Aplique uma pressão suave caudal a pele dorsal para o olho, fazendo com que o globo ocular para se projetar ligeiramente.
   4. Direto da agulha medialmente e injetar 100 µ l de suspensão de células de doador retrô-orbitally para cada destinatário do mouse. As células também podem ser injetadas através da veia da cauda.
   5. , Gradualmente, retirar a agulha de injeção e posicione o mouse sozinho em uma gaiola de recuperação. Monitorar o animal até que ele recuperou a consciência; uma vez totalmente recuperado retorno do animal à habitação social.
3. Recolha e análise
   1. após 1 h, anestesiar o destinatários ratos com isoflurano anestesia (1-3%) usando um vaporizador; confirmar a profundidade de anestesia pelo dedo do pé-pitada. Colher o baço (ou outro tecido de interesse) (etapa 2.1.2.) de cada destinatário do mouse e coloque em mídia completa (1 mL/destinatário). Eutanásia em animais anestesiados por decapitação.
      Nota: Maiores intervalos antes da colheita de tecido irão aumentar a acumulação de tecido através de pelo menos 24 h.
   2. Moer tecido baço suavemente através de 40 µm de malha de nylon em mídia completa usando a extremidade de um êmbolo da seringa para fazer uma célula única suspensão e transferência para tubo cônico de 15 mL.
   3. Adicionar 4 volumes do lysis ACK buffer e incubam 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 1.000 x g por 2 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
   4. Os eritrócitos de coloração, o tampão (tampão fosfato salino suplementado com 1% FBS). Contar as células e ajustar para uma concentração final de 3 x 10 ⁷ células/mL. Transferir 100 µ l de suspensão de células para um 96-poço redondo placa inferior.
   5. Células mancha para marcadores desejadas (consulte a tabela de materiais) para análise por citometria de fluxo. Adicionar anticorpos conjugados fluoróforo (consulte a tabela de materiais) contra marcadores desejadas e incubar a 4 ° C por 20 min no escuro. Adicione 100 µ l tampão de coloração, centrifugue células a 1.000 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.
   6. Resuspenda o pellet em 200 µ l tampão de coloração, centrifugue células a 1.000 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.
   7. Ressuspender o sedimento na coloração de 125 µ l de buffer e adquirir amostras usando um citômetro de fluxo, usando os procedimentos padrão.
      Nota: A tinta verde é animada por um laser de 488 nm e a emissão é detectada com filtros dicroicos 505 e 530/30. O corante laranja é animado por um 561 nm e a emissão é detectado por um filtro dicroico 582/15.
      1. Uso salvou células de 2.1.8.2 para compensar cada tintura fluorescente.
         Nota: Usando a compensação baseada no grânulo com fluorophores correspondência a excitação e espectros de emissão das tinturas rotulagem resultará em compensação suboptimal.
      2. Usar as células de entrada salvas da etapa 2.2.2.1 para determinar com precisão a proporção de diferencialmente rotulado entradas células se usando mais do que uma população rotulada ( Figura 3). Calcular a migração específica de tecido com base na relação de rotulado de células sem rótulo ( Figura 4).

Resultados

Quando usar tintura de calceína-AM, inspeção visual das células confirmará a captação do rótulo (Figura 1). Leituras de fluorescentes automatizadas controlará a migração como trânsito de células na parte inferior da inserção ao longo do tempo. Estes dados mostram claramente uma indução de migração de células para o MCP-1, bem como um aumento da resposta pelo soro (Figura 2A). Dependendo da força do estímulo ...

Discussão

Quantificação da migração celular imune pode ser realizada usando simples e rápida os ensaios in vitro e em vivo. Demonstramos a em vitro quimiotaxia de monócitos humanos em resposta a um gradiente de MCP-1 e aumento pelo soro. In vivo, doador murino splenocytes diferencialmente foram rotulados e após transferência adotiva, foram recuperados do destinatários animais.

Usando um leitor de placa tem a vantagem de vários pontos de tempo de amostragem (...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer