Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Zusammenfassung

Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.

Zusammenfassung

Chemotaxis ist die Migration auf eine spezifische chemische Gradienten¹. Chemokine sind chemotaktische Zytokine, die Förderung der zellulären Menschenhandel mit anatomischen und zeitlichen Spezifität². Chemotaxis ist eine kritische Funktion von Lymphozyten und anderen Immunzellen, die quantitativ bewertet in Vitro. Dieses Manuskript beschreibt Methoden, die die Beurteilung der Chemotaxis, erlauben sowohl in Vitro und in Vivo, für unterschiedliche Zelltypen, einschließlich Zell-Linien und native Zellen. Die in-vitro-, Platte-basiertes Format ermöglicht den Vergleich von mehreren Bedingungen gleichzeitig in Echtzeit und können innerhalb von 1-4 h. In Vitro Assay Bedingungen manipuliert werden, vorzustellen, Agonisten und Antagonisten, wie erfolgen sowie unterscheiden Sie Chemotaxis von Chemokinese, ist die zufällige Bewegung. Für in Vivo Menschenhandel Bewertungen können für Adoptiveltern übertragen Immunzellen mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert und verwendet werden. Die unterschiedliche Kennzeichnung von Zellen ermöglicht gemischte Zellpopulationen im selben Tier, dadurch abnehmende Varianz und Reduzierung der Anzahl der Tiere für ein angemessen angetriebene Experiment eingefügt werden soll. Migration in lymphatischen Gewebe tritt in weniger als 1 h, und mehrere Gewebe Fächer können Sie probieren. Durchflusszytometrie Gewebe Ernte folgt ermöglicht eine schnelle und quantitative Analyse der wandernden Muster aus mehreren Zelltypen.

Einleitung

Robuste Immunität erfordert die komplexe zeitliche und räumliche Koordination einer Vielzahl von Zelltypen, um entsprechend reagieren auf eine Verletzung, Infektion und Selbsttoleranz erzeugen. Mehrere Dutzend Chemokin-Rezeptoren und ihrer entsprechenden Liganden wurden entdeckt und charakterisierte die molekulare Mechanismen durch den spezifischen Zellen können zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem bestimmten Gewebe geleitet werden. Studium Chemotaxis und Migration ist somit ein unverzichtbarer Bestandteil der Immunologie Forschung. In der Tat wurde der beschriebenen in-vitro- Test vor kurzem als Screening-Instrument zur chemotaktische Cofaktor zu identifizieren, die Chemotaxis von T-Zellen in Richtung C-C Chemokine 19 und 21³beschleunigt. Der Zweck der hier beschriebenen Methoden sind quantitative Bewertungen der Immunzelle Chemotaxis in Vitro und in Vivozu ermöglichen.

Die Boyden (Zelle Migration und Invasion) Kammer-Assay ist eine kostengünstige, reproduzierbare und schnelle Methode für die Bewertung der Zelle Migration^4,5. In der standard-Assay die obere Kammer ist mit Zellen ausgesät, und ist durch eine poröse Einlage aus einem unteren Kammer, in die die Zellen Wandern getrennt. Zum gewünschten Zeitpunkt können Zellen, die an der Unterseite des Einsatzes migriert wurden behoben und gebeizt für Quantifizierung von Lichtmikroskopie. Jedoch solche Messungen Datenerhebung auf einer einzigen Endpunkt, der dynamische Datenerfassung schließt zu beschränken und können erfordern umfangreiche Optimierung den optimale Zeitpunkt für die Analyse zu bestimmen. Hier werden verschiedene Anpassungen beschrieben, die in Echtzeit, quantitative und Multiplex Messungen der Chemotaxis in Vitrozu ermöglichen.

Für in Vivo Studien ist ein funktionelle Endpunkt verwendet, nämlich die spezifischen Anhäufung von Zellen in einem bestimmten Gewebe-Fach. Bereits beschriftete Spenderzellen werden in Empfänger Tiere durch Adoptiveltern Transfer eingeführt. Diese Spenderzellen können anschließend durch Durchflusszytometrie nach Empfänger Gewebe Ernte identifiziert werden. Auch ist eine Co Kennzeichnung Strategie, die für die Bestimmung des Handels mit verschiedenen Zelltypen innerhalb einer einzigen Empfänger Tier erlaubt. Diese Methode beseitigt die Inter Tiere Variation aus Zelle Injektion und Konten für physiologische Variabilität zwischen Tier.

Protokoll

alle Verfahren wurden von der Rockefeller University angenommen ' s institutionelle Animal Care und Use Committee. Alle Tiere unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht waren.

1. Chemotaxis In vitro-

1. Kultur THP-1 Zellen ⁶ Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 4-(2-Hydroxyethyl)-1- Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES; 25 mM) (komplett Media), Aufrechterhaltung der Dichte zwischen 0,5-1,0 x 10 ⁶ Zellen/mL.
2. In ein 35-mm-Zellkultur dish, Label 3,5 x 10 ⁵ THP-1 Zellen pro Zustand mit Calcein Acetoxymethyl (Calcein-AM; 2,5 µM) oder anderen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff in komplette Medien bei 37 ° C für 30 min.
   Hinweis: Farbstoffe müssen Zellmembran durchlässig und mit live-Zelle Kennzeichnung kompatibel sein.
3. Pre-warme Platte Leser, 37 ° c
   Hinweis: Neben der Temperaturregelung ist unten-Lesung Funktionalität auch erforderlich. Siehe Schritt 1.10.2 nach einer Alternative zu einer Platte Leser für die Quantifizierung der Migration Zellen.
4. Während Zellen bezeichnen, Vorbereiten der Assay-Platte und Unterhaus.
   1. Verwendung einer 24-Well-Zellkultur-Platte, mit einer Bedingung pro Bohrloch. Führen Sie jede Bedingung in dreifacher Ausfertigung.
   2. Fügen Sie 750 µL Hank ' s Buffered Salzlösung (HBSS) gepuffert mit 25 mM HEPES und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), die 24-Well-Platte. Dies dient als der basalen Kontrollbedingung.
      1. Andere Brunnen für Komparator Bedingungen, immer die Aufrechterhaltung der Gesamtmenge in der unteren Kammer bei 750 µL.
         Hinweis: In diesem Beispiel dient menschliche Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) als Positivkontrolle für Chemotaxis- ⁷.
         1. Montieren die Reagenz Mischung kombiniert HBSS mit 25 mM HEPES, BSA (0,1 %) und MCP-1 (75 ng/mL). Verwenden Sie Erwachsene bovine Serum (2,7 % V / V) mit MCP-1 als eine zusätzliche Positivkontrolle.
            Hinweis: Chemokin und Chemokin-Konzentration hängt von der chemotaktische Achse unter Studie. Lyophilisierter MCP-1 ist in destilliertem Wasser mit BSA (0,1 %) zu einer Stammlösung mit einer Endkonzentration von 50 μg/mL Nukleinsäuretablette. Dies kann in Wasser, um eine funktionierende Lösung von 10 μg/mL verdünnt werden. Die untere Kammer 5,6 μL dieser Lösung hinzufügen.
   3. Nach der Besetzung der unteren Kammern abgeschlossen ist, legen Sie einen poröse Einsatz in jede Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Registerkarten des Einsatzes mit den Kerben der Platte ausrichten.
      Hinweis: Wählen Sie die geeignete Porengröße für die Einsätze. Für Monozyten und Lymphozyten schneidet gut ab eine Porengröße von 3 μm. Einige Zelltypen und/oder Chemokin-Systeme erfordern eine Matrix-beschichtete Oberfläche für optimale Migration. Zum Beispiel sind für die Messung von THP-1 Monocyte Chemotaxis in Richtung MCP-1, Fibronektin oder Kollagen beschichtet Einsätze empfohlen. Für Platte Leser für Quantifizierung, muss der Einsatz eine Licht-impermeant Beschichtung, wie Polyethylenterephthalat, zur Erkennung von nicht-Migration zu verhindern Zellen in der oberen Kammer ⁸.
5. Nach Inkubation für 30 min mit Calcein-AM Zellen, Zellsuspension auf eine 15mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge Zellen bei 1.000 x g für 2 min. Sichtprüfung Zellen zur Bestätigung der Aufnahme von Calcein-AM ( Abbildung 1).
6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Vakuum-Sauger. Waschen Sie die markierte Zellen in serumfreien RPMI 1640 mit HEPES 25 mM ergänzt. Zellen bei 1.000 x g für 2 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.
7. Aufschwemmen Zellen in serumfreien RPMI 1640 mit HEPES 25 mM ergänzt. Zählen von Zellen und stellen Sie die Lautstärke so, dass die Zellen eine Endkonzentration von 1,0-1,5 x 10 ⁶ Zellen/mL werden.
8. Verzichten 250 μl Zellsuspension in die Einlage (Oberhaus).
9. , Nachdem alle oberen Kammern gefüllt wurden, sanft heben Sie die Platte und inspizieren die Unterseite für das Vorhandensein von Luftblasen, die Migration und Erkennung stören können. Um eine Blase zu entfernen, versuchen Sie zunächst entfernen, dann Re-Positionierung des Einsatzes. Wenn erfolglos, verwenden Sie eine 27 G Nadel zu punktieren die Blase und dann den Einsatz neu zu positionieren.
10. Legen Sie die Platte in den vorgewärmten 37 ° C Platte Leser.
    1. Acquire Fluoreszenz Lesungen von unten in 1-3 min Abständen. Bei der Verwendung von Calcein-AM festgesetzt der Fluoreszenz Emission und Erregung Wellenlängen 485 nm und 520 nm, beziehungsweise. Je nach Zelle Art und Chemokin Chemotaxis tritt in der Regel über 1-4 h ( Abbildung 2A).
    2. Als Alternative zur kontinuierlichen Messungen mit einem Teller-Reader, Bild der Brunnen mit einem inversen fluoreszierende Mikroskop ( Abb. 2 b) in der Lage, der Erregung und Detektion von Licht bei 485 nm und 520 nm, beziehungsweise. Verwenden einer niedrigen Vergrößerung, um die Mehrheit an der Unterseite des Einsatzes zu erfassen. Quantifizieren der Zellen durch die Verarbeitung der Bilder mit ImageJ oder ähnliche Software ⁹.

2. Adoptiveltern übertragen der murinen Lymphozyten

1. Vorbereitung der Spenderzellen
   1. Anesthetize 8-12 Woche-alten C57BL/6J männliche Spender Mäuse mit Isofluran-Narkose (1-3 %) Verwendung eines Verdampfers. Angemessene Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen.
   2. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage. Machen Sie eine Mittellinie Inzision mit einem Skalpell und suchen Sie die Milz in der oberen linken peritonealen Raum. Verbrauchssteuern Sie die ganze Milz und in komplette Medien (RPMI ergänzt mit 10 % FBS und 25 mM HEPES; 1 mL/Milz) auf Eis. Narkotisierten Spendertiere durch Enthauptung einschläfern.
   3. Mahlen Milz Gewebe sanft durch 40 µm-Nylon-Netzgewebe in komplette Medien (1 mL /spleen) mit dem Ende des einen Spritzenkolben eine 15 mL konische Rohr eine einzellige Federung und Transfer vorzunehmen.
   4. Fügen Sie 4 Bände von Ammoniumchlorid Kalium (ACK) Lyse Puffern und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, Erythrozyten zu lysieren.
   5. Der Zellen bei 1.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur Zentrifugieren und überstand verwerfen. Wenn Erythrozyten im Pellet bleiben, Aufschwemmen im ACK Lyse Puffer, 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, Zentrifugieren Zellen bei 1.000 x g für 2 min und überstand verwerfen.
   6. Aufschwemmen der Zellen in komplette Medien in einer Konzentration von 2-5 x 10 ⁷ Zellen/mL, dann abgießen die Zellsuspension durch eine 40 µm-Nylon-Netzgewebe, Zelle Ablagerungen zu entfernen.
   7. Etikett 1 x 10 ⁷ Zellen/Empfänger Maus mit einem Fluoreszenzfarbstoff kompatibel mit Leben Zellen und bei der anschließenden Fixierung, wie z. B. 5-Chloromethylfluorescein Diacetat (Endkonzentration 2 μM) ¹⁰ einbehalten . Inkubation bei 37 ° C für 30 min.
      Hinweis: Um mehr als eine Zellenbevölkerung zu verfolgen, verwenden Sie andere Fluoreszenzfarbstoffe mit zusätzlichen Zellpopulationen. Zum Beispiel kann ein Teil der Spenderzellen mit 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) Benzoyl gelabelt) amino) Tetramethylrhodamine (Endkonzentration 2 μM) ¹¹.
   8. Fügen Sie 4 Bände mit HBSS ergänzt 25 mM HEPES, dann Zentrifuge bei 1.000 x g für 2 min und überstand verwerfen. Aufschwemmen Sie Pellet in HBSS ergänzt mit HEPES 25 mM, eine Endkonzentration von 1 x 10 ⁸ Zellen/mL.
      1. Wenn mehr als ein Fluoreszenzfarbstoff zu verwenden, halten Sie Zell-Populationen bis unmittelbar vor der Injektion getrennt.
      2. Eine kleine aliquoten (10 μl) der Zellen von jeder Farbe auf eine Fixativ Lösung (1 mL) für spätere Flow Cytometry Entschädigung übertragen.
2. Übertragung von Lymphozyten
   1. 8-12 Wochen zu betäuben-alte C57BL/6J männliche Empfänger Mäuse mit Isofluran (1-3 %) Verwendung eines Verdampfers; Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen. Tier Tierarzt Salbe zuweisen ' s Augen austrocknen zu verhindern.
   2. Kurz Wirbel Spenderzellen (1 s) und Transfer zum 1 mL Injektionsspritze mit 27 G, 0,5 in Nadel, differentiell beschrifteten Zellpopulationen zu kombinieren, wenn anwendbar.
      1. Eine kleine aliquoten (10 μl) gemischte Zellen auf einem Fixativ Lösung (1 mL) für spätere Flow Cytometry Analysen übertragen.
   3. Spendertiere in Bauchlage zu platzieren. Milde kaudalen Druck auf die Haut dorsalen für das Auge, verursacht den Augapfel leicht hervorstehen.
   4. Direkt die Nadel medial und 100 µL Zellsuspension Spender Retro-Orbital in jeder Empfänger Maus injizieren. Zellen können auch über die Rute Vene injiziert werden.
   5. Allmählich zurückziehen die Injektionsnadel und Maus allein in einem Recovery-Käfig. Tier zu überwachen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt hat; einmal vollständig wiederhergestellten Rückkehr des Tieres zu Sozialwohnungen.
3. Sammlung und Analyse
   1. nach 1 h, Empfänger Mäuse mit Isofluran-Narkose (1-3 %) mit einem Vaporizer zu betäuben, Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen. Die Milz (oder anderes Gewebe von Interesse) zu ernten (Schritt 2.1.2.) von jedem Empfänger Maus und Ort in die komplette Medien (1 mL/Empfänger). Narkotisierten Tieren durch Enthauptung einschläfern.
      Hinweis: Längere Intervalle vor der Ernte Gewebe erhöht Gewebe Akkumulation durch mindestens 24 Std.
   2. Mahlen Milz Gewebe sanft durch 40 µm-Nylon-Netzgewebe in komplette Medien mit dem Ende des einen Spritzenkolben 15 mL konische Rohr eine einzellige Federung und Transfer vorzunehmen.
   3. Fügen Sie 4 Bände der ACK Lyse Puffer und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren die Zellsuspension bei 1.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur und überstand verwerfen.
   4. Aufschwemmen Zellen in der Färbung Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ergänzt mit 1 % FBS). Zellen zu zählen und auf eine Endkonzentration von 3 x 10 ⁷ Zellen/mL einstellen. 100 µL Zellsuspension auf einer 96-Well Runde Bodenplatte übertragen.
   5. Fleck Zellen für gewünschte Markern (siehe Tabelle Material) für die Analyse von Durchflusszytometrie. Fluorophor-konjugierten Antikörpern (siehe die Tabelle Materialien) gegen die gewünschten Markierungen hinzufügen und bei 4 ° C für 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. Hinzufügen von 100 µL Puffer Färbung, Zellen bei 1.000 x g für 3 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.
   6. Aufschwemmen das Pellet in 200 µL Puffer Färbung, Zellen bei 1.000 x g für 3 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.
   7. Das Pellet in 125 µL Färbung Aufschwemmen Puffern und Proben mit einem Durchflusszytometer mit Standardverfahren zu erwerben.
      Hinweis: Der grüne Farbstoff ist begeistert von einem 488 nm Laser und die Emission mit 505 und 530/30 dichroitische Filter erkannt wird. Die orange Farbe ist begeistert durch eine 561 nm und die Emission von 582/15 dichroitische Filter erfasst wird.
      1. Verwendung gespeichert Zellen aus 2.1.8.2 Ausgleich für jede Fluoreszenzfarbstoff.
         Hinweis: Mit Wulst-Vergütung mit Fluorophore passend zur Erregung und Emissionsspektren der Kennzeichnung Farbstoffe in suboptimalen Entschädigung führen wird.
      2. Verwenden die gespeicherten Eingabezellen aus Schritt 2.2.2.1 genau zu bestimmen, das Verhältnis von differentiell Eingabezellen beschriftet, wenn mehr als eine beschriftete Bevölkerung ( Abbildung 3). Berechnen Gewebe spezifische Migration basierend auf dem Verhältnis von beschriftet, unbeschriftete Zellen ( Abbildung 4).

Ergebnisse

Bei der Verwendung von Calcein-AM Farbstoff bestätigen Sichtprüfung der Zellen Label Aufnahme (Abbildung 1). Automatisierte fluoreszierende Lesungen werden Migration als Zellen Transit auf der Unterseite des Einsatzes im Laufe der Zeit verfolgen. Diese Daten zeigen eindeutig eine Induktion der Zellwanderung in Richtung MCP-1 sowie eine Aufwertung dieser Reaktion durch Serum (Abbildung 2A). Je nach Stärke des wandernden Stimulu...

Diskussion

Quantifizierung der Immunzelle Migration kann erreicht werden, mit einfachen und schnellen Tests in Vitro und in Vivo. Wir zeigen die in Vitro Chemotaxis von menschlichen Monozyten als Reaktion auf eine MCP-1 Steigung und Vermehrung von Serum. In Vivo, Spender murinen Splenocyten waren differentiell beschriftet und anschließend Adoptiveltern waren Empfänger Tiere erholt.

Mit einem Teller-Reader hat den Vorteil, mehrere Zeit Probenahmestellen (so oft wie al...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer