Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Riepilogo

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

Abstract

La chemiotassi è migrazione lungo un gradiente chimico specifico¹. Le chemochine sono citochine chemiotattiche che promuovono il traffico cellulare con specificità anatomiche e temporale². La chemiotassi è una funzione critica dei linfociti e altre cellule immuni che possono essere quantitativamente valutata in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi che consentono la valutazione della chemiotassi, sia in vitro che in vivo, per tipi cellulari diversi tra cui linee cellulari e cellule native. Lo in vitro, formato basato su piastra permette il confronto delle diverse condizioni contemporaneamente in tempo reale e può essere completato entro 1-4 h. In vitro analisi condizioni possono essere manipolate per introdurre gli agonisti e antagonisti, come bene come differenziare la chemiotassi da chemokinesis, che è il movimento casuale. Per le valutazioni traffico in vivo , le cellule immuni possono essere contrassegnate con le tinture fluorescenti più e utilizzate per trasferimento adottivo. L'etichettatura differenziale delle cellule consente di popolazioni di cellule miste ad essere introdotti nello stesso animale, quindi diminuendo la varianza e riducendo il numero di animali necessari per un esperimento adeguatamente alimentato. Migrazione nel tessuto linfoide si verifica in meno di 1 h e compartimenti multipli possono essere campionati. Citometria a flusso successivo vendemmia del tessuto permette un'analisi rapida e quantitativa dei flussi migratori di più tipi di cellule.

Introduzione

Robusta immunità richiede il complesso coordinamento temporale e spaziale di una miriade di tipi di cellule al fine di rispondere in modo appropriato alla lesione, infezione e generare auto-tolleranza. Parecchi dozzina recettori per le chemochine e loro corrispondenti ligandi sono stati scoperti e caratterizzati fornendo meccanismi molecolari da cui le cellule specifiche possono essere diretto in un tessuto specifico in un momento specifico. Pertanto, studiare chemiotassi e migrazione è una componente indispensabile di ricerca in immunologia. Infatti, l'analisi descritta in vitro è stata recentemente usata come uno strumento di screening per identificare un cofattore chemiotattico che accelera la chemiotassi delle cellule T verso C-C chemochine 19 e 21³. Lo scopo dei metodi descritti qui sono per consentire valutazioni quantitative della chemiotassi delle cellule immuni in vitro e in vivo.

L'analisi della camera di Boyden (migrazione cellulare e invasione) è un metodo poco costoso, riproducibile e rapido per valutare la migrazione cellulare^4,5. In analisi standard, camera superiore è seminata con le cellule ed è separata da un inserto poroso da un alloggiamento più basso, in cui le cellule migrano. Al momento desiderato, le cellule che hanno migrato alla parte inferiore dell'inserto possono essere fissa e macchiate per quantificazione di microscopia chiara. Tuttavia, tali misure vincolano la raccolta di dati di un singolo punto di fine, che preclude la raccolta di dati dinamica e possono richiedere la vasta ottimizzazione per determinare il punto di tempo ottimale per l'analisi. Qui, diversi adattamenti sono descritti che consentono misurazioni in tempo reale, quantitative e multiplex di chemiotassi in vitro.

Per in vivo gli studi, viene utilizzato un punto di fine funzionale, vale a dire l'accumulo specifico delle cellule in un vano dato tessuto. Le cellule erogarici pre-etichettata vengono introdotti in animali destinatari attraverso trasferimento adottivo. Queste cellule del donatore possono essere identificate successivamente tramite flusso cytometry dopo il raccolto di destinatario del tessuto. È anche presentata una strategia co-etichettatura che consente per la determinazione del traffico di tipi differenti delle cellule all'interno di un singolo animale destinatario. Questo metodo elimina la variazione inter-animale da iniezione di cellule e conti per fisiologica variabilità.

Protocollo

tutte le procedure sono state approvate dal Rockefeller University ' s istituzionale Animal Care e Comitato di uso. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche.

1. chemiotassi In Vitro

1. cultura THP-1 cellule ⁶ nel 1640 di Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 4-(2-idrossietil) -1- acido piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 mM) (completo di media), mantenendo la densità tra 0,5-1,0 x 10 ⁶ cellule/mL.
2. Coltura di cellule in un 35 mm piatto, etichetta 3,5 x 10 ⁵ THP-1 cellule per condizione con calceina acetossimetil (calceina-AM; 2,5 µM) o altre adatta tintura fluorescente nei media completi a 37 ° C per 30 min.
   Nota: Coloranti devono essere permeabile della membrana cellulare e compatibile con cellule vive etichettatura.
3. Pre-caldo un lettore di piastra a 37 ° C.
   Nota: Oltre a controllo di temperatura, funzione inferiore-lettura è anche richiesto. Vedere il punto 1.10.2 per un'alternativa a un lettore di piastra per la quantificazione della migrazione cellule.
4. Mentre le cellule sono etichettatura, preparare la piastra di dosaggio e la camera bassa. Piastra
   1. uso una cultura di tessuto 24 pozzetti, con una condizione per pozzetto. Eseguire ogni condizione in triplice copia.
   2. Aggiungere 750 µ l di Hank ' s soluzione salina tamponata (HBSS) tamponata con 25mm HEPES e 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA) per la piastra a 24 pozzetti. Questo serve come la condizione basale di controllo.
      1. Uso altri pozzi per le condizioni di comparatore, mantenendo sempre il volume totale nel vano inferiore a 750 µ l.
         Nota: In questo esempio, umano monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) serve come controllo positivo per chemiotassi ⁷.
         1. Assemblare la miscela reagente combinando HBSS con 25mm HEPES, BSA (0,1%) e MCP-1 (75 ng/mL). Utilizzare siero bovino adulto (2,7% v / v) con MCP-1 come un controllo positivo aggiuntivo.
            Nota: Concentrazione delle chemochine e chemochine dipenderà l'asse chemiotattica sotto studio. Liofilizzato di MCP-1 è risospeso in acqua distillata con BSA (0,1%) per fare una soluzione di riserva con una concentrazione finale di 50 μg/mL. Questo può essere diluito in acqua per una soluzione di lavoro di 10 μg/mL. Aggiungere 5,6 μL della soluzione per la camera inferiore.
   3. Dopo aver completata la composizione delle sezioni inferiore, collocare un inserto poroso in ciascun pozzetto, assicurando che le schede dell'inserto allineano con le tacche della piastra.
      Nota: Scegliere il formato del poro appropriato per gli inserti. Per i monociti e linfociti, un diametro dei pori di 3 μm si comporta bene. Alcuni tipi di cellule e/o sistemi di chemokine possono richiedere una superficie verniciata a matrice per migrazione ottimale. Ad esempio, per misurare la chemiotassi di monociti THP-1 verso MCP-1, fibronectina o rivestite con collagene inserti sono raccomandati. Per il lettore per la quantificazione, l'inserto deve avere un rivestimento luce-impermeant, come polietilene tereftalato, per impedire il rilevamento di migrazione non celle nella parte superiore dell'alloggiamento ⁸.
5. Dopo incubazione le cellule per 30 min con calceina-AM, trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15mL. Cellule di centrifugare a 1.000 x g per 2 min. Ispezionare visivamente le cellule per confermare l'assorbimento di calceina-AM ( Figura 1).
6. Rimuovere con cautela il supernatante utilizzando un aspiratore. Lavare le cellule con etichettate in privo di siero RPMI 1640 completati con 25mm HEPES. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 minuti e scartare il surnatante.
7. Risospendere le cellule in privo di siero RPMI 1640 completati con 25mm HEPES. Contare le celle e regolare il volume in modo che le cellule sono ad una concentrazione finale di 1.0-1.5 x 10 ⁶ cellule/mL.
8. Dispensare 250 μL della sospensione delle cellule nell'inserto (camera superiore).
9. Dopo che tutte le camere superiori sono state riempite, delicatamente sollevare la piastra e ispezionare la parte inferiore per la presenza di bolle d'aria che potrebbero interferire con la migrazione e la rilevazione. Per rimuovere una bolla, prima di provare a rimuovere poi ri-posizionamento dell'inserto. In caso contrario, utilizzare un ago 27G per bucare la bolla e quindi riposizionare l'inserto.
10. Collocare la piastra nel lettore di piastra preriscaldata 37 ° C.
    1. Letture di fluorescenza di acquisire dal fondo ad intervalli di 1-3 min. Quando si utilizza calceina-AM, impostare la fluorescenza lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione a 485 nm e 520 nm, rispettivamente. A seconda del sistema di tipo e chemochine cella, chemiotassi si verifica in genere oltre 1-4 h ( Figura 2A).
    2. Come alternativa alle misurazioni continue di immagine utilizzando un lettore di piastra, pozzi usando un microscopio fluorescente invertito ( Figura 2B), in grado di eccitazione e di rilevamento della luce a 485 nm e 520 nm, rispettivamente. Utilizzare un basso ingrandimento per acquisire la maggior parte della parte inferiore dell'inserto. Quantificare le cellule di elaborazione delle immagini con ImageJ o simili software ⁹.

2. Trasferimento adottivo di linfociti murini

1. preparazione delle cellule erogarici
   1. Anesthetize 8-12 settimana-vecchi topi di donatore maschio C57BL/6J con isoflurano anestesia (1-3%) utilizzando un vaporizzatore. Confermare appropriata profondità dell'anestesia di punta-pizzico.
   2. Posizionare il mouse nella posizione supina. Fare un'incisione del midline con un bisturi e individuare la milza nello spazio peritoneale superiore di sinistra. Asportare la milza intera e metterli in media completi (RPMI completato con 10% FBS e 25mm HEPES; 1 mL/milza) su ghiaccio. Eutanasia di animali anestetizzati donatori per decapitazione.
   3. Macinare tessuto della milza delicatamente attraverso 40 µm in nylon mesh in completa per i media (1ml /spleen) usando l'estremità di un stantuffo della siringa per fare una cella singola sospensione e trasferimento di una provetta conica da 15 mL.
   4. Aggiungere 4 volumi di lisi di ammonio cloruro potassio (ACK) buffer e incubare per 5 min a temperatura ambiente per lisare gli eritrociti.
   5. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 min a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Se gli eritrociti rimangono nel pellet, risospendere in buffer di lisi ACK, incubare per 5 min a temperatura ambiente, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 min e gettare il surnatante.
   6. Risospendere le cellule in completa per i media ad una concentrazione di 2-5 x 10 ⁷ cellule/mL, quindi colare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon di 40 µm per rimuovere i detriti cellulari.
   7. Etichetta 1 x 10 ⁷ mouse di cellule/destinatario con un colorante fluorescente compatibile con cellule vive e che sarà mantenuto anche dopo la fissazione successiva, ad esempio 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentrazione finale 2 μM) ¹⁰ . Incubare a 37 ° C per 30 min.
      Nota: Per tenere traccia di più di una popolazione di cellule, utilizzare altri coloranti fluorescenti con popolazioni di altre cellule. Se, ad esempio, una porzione delle cellule erogarici possa essere etichettata con 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoile) ammino) tetrametilrodamina (concentrazione finale 2 μM) ¹¹.
   8. Aggiungere 4 volumi HBSS completati con 25mm HEPES, poi Centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti e scartare surnatante. Risospendere il pellet in HBSS completati con 25mm HEPES ad una concentrazione finale di 1 x 10 ⁸ cellule/mL.
      1. Se si utilizza più di un colorante fluorescente, mantenere popolazioni cellulari separate fino al momento immediatamente precedente iniezione.
      2. Trasferire una piccola aliquota (10 μL) delle cellule di ogni colore a una soluzione fissante (1 mL) per compensazione di cytometry di flusso successivo.
2. Trasferimento dei linfociti
   1. anestetizzare 8-12 settimana-vecchio C57BL/6J topi maschi destinatari con isoflurano (1-3%) utilizzando un vaporizzatore; confermare la profondità dell'anestesia di punta-pizzico. Applicare unguento veterinario animale ' gli occhi per evitare l'essiccazione.
   2. Brevemente le cellule erogarici vortice (1 s) e trasferimento a siringa di iniezione da 1 mL con 27 G, 0,5 in ago, combinando le popolazioni delle cellule differenzialmente etichettati, se applicabile.
      1. Una piccola aliquota (10 μL): trasferimento di cellule miste a una soluzione fissante (1 mL) per le analisi di citometria a flusso successivo.
   3. Posto animali donatori in posizione prona. Applicare pressione caudale lieve sulla pelle dorsale per l'occhio, causando il bulbo oculare a sporgere leggermente.
   4. Dirigere l'ago medialmente e iniettare 100 µ l di sospensione cellulare donatore retrò-orbitally in ogni destinatario mouse. Cellule possono anche essere iniettate tramite vena caudale.
   5. , Gradualmente, ritirare l'ago per iniezione e posizionare il mouse da solo in una gabbia di recupero. Animale di monitor fino a quando ha riacquistato coscienza; una volta completamente recuperato ritorno l'animale all'housing sociale.
3. Raccolta e l'analisi
   1. dopo 1 h, anestetizzare destinatari topi con isoflurano anestesia (1-3%) utilizzando un vaporizzatore; confermare la profondità dell'anestesia di punta-pizzico. Raccogliere la milza (o altri tessuti di interesse) (punto 2.1.2.) da ogni destinatario mouse e posto in un supporto completo (1 mL/destinatario). Eutanasia di animali anestetizzati per decapitazione.
      Nota: Gli intervalli più lunghi prima del raccolto del tessuto aumenterà accumulo di tessuto attraverso almeno 24 h.
   2. Macinare tessuto della milza delicatamente attraverso 40 µm in nylon mesh in completa per i media usando la parte di un stantuffo della siringa per fare una cella singola sospensione e trasferimento per provetta conica da 15 mL.
   3. Aggiungere 4 volumi di lisi ACK buffer e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.000 x g per 2 min a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
   4. Risospendere le cellule in colorazione buffer (tampone fosfato salino completato con 1% FBS). Contare le celle e regolare a una concentrazione finale di 3 x 10 ⁷ cellule/mL. Trasferire 100 µ l di sospensione cellulare a un 96 pozzetti fondo piatto rotondo.
   5. Cellule di macchia per marcatori desiderati (vedere la tabella materiali) per l'analisi di citometria a flusso. Aggiungere anticorpi coniugati fluoroforo (Vedi la tabella materiali) contro marcatori desiderati e incubare a 4 ° C per 20 min al buio. Aggiungere 100 µ l tampone di colorazione, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e scartare il surnatante.
   6. Risospendere il pellet in 200 µ l tampone di colorazione, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e scartare il surnatante.
   7. Risospendere il pellet in macchiatura di 125 µ l tampone e acquisire campioni usando un cytometer di flusso utilizzando le procedure standard.
      Nota: Il colorante verde viene eccitato da un laser a 488 nm e l'emissione viene rilevata con filtri dicroici 505 e 530/30. Il colorante arancio viene eccitato da un 561 nm e l'emissione viene rilevata da un filtro dicroico 582/15.
      1. Uso salvato le cellule dalla 2.1.8.2 per compensare ogni tintura fluorescente.
         Nota: Utilizzando la compensazione basata sul tallone con fluorofori l'eccitazione e spettri di emissione delle tinture d'etichettatura corrispondenti si tradurrà in compensazione suboptimali.
      2. Utilizzare le celle di input salvate dal punto 2.2.2.1 per determinare con precisione il rapporto tra differenzialmente etichettato celle di input se si utilizza più di una popolazione con etichetta ( Figura 3). Calcolare la migrazione specifica del tessuto sulla base del rapporto di etichettati alle cellule senza etichetta ( Figura 4).

Risultati

Quando si utilizza il colorante calceina-AM, ispezione visiva delle cellule confermerà l'assorbimento etichetta (Figura 1). Letture di fluorescente automatizzate terrà traccia migrazione come transito di cellule sulla parte inferiore dell'inserto nel corso del tempo. Questi dati mostrano chiaramente un'induzione della migrazione cellulare verso MCP-1, così come un aumento di questa risposta dal siero (Figura 2A). A seconda del...

Discussione

Quantificazione della migrazione delle cellule immuni può essere compiuta usando semplice e veloce saggi sia in vitro che in vivo. Dimostriamo la chemiotassi in vitro di monociti umani in risposta un gradiente di MCP-1 e l'aumento di siero. In vivo, gli splenocytes murini donatore differenzialmente sono stati etichettati e a seguito di trasferimento adottivo, sono stati recuperati dal destinatari animali.

Utilizzando un lettore di piastra ha il vantaggio di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer