ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

要約

リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。

要約

走化性は、特定の化学勾配¹に沿って移行です。ケモカインは、解剖学的および時間的特異性²細胞人身売買を促進する走化性サイトカインです。走化性リンパ球の重要な機能は、定量的にすることができます他の免疫細胞を体外評価。この原稿は、走化性の評価を可能にする方法をについて説明します体外と体内の細胞やネイティブ細胞など多様な細胞型の両方。体外、プレート ベースの形式が許可で同時にいくつかの条件の比較、リアルタイム 1-4 h.の in vitroアッセイとしてアゴニストおよびアンタゴニストを導入する条件を操作ことができます以内に完了することができますと同様ランダム運動である chemokinesis からの走化性を区別します。生体内で人身売買評価、免疫細胞を複数の蛍光色素を標識し、養子の転送に使用できます。同じ動物、差異が減少し、十分に動力を与えられた実験に必要な動物の数を減らすことに導入される混合セル人口の細胞の差動ラベリングが可能です。1 h ほどでリンパ組織への移行が発生し、複数の組織コンパートメントをサンプリングすることができます。フローサイトメトリー組織収穫できます複数の細胞のタイプの移住性パターンの迅速かつ定量的な分析。

概要

堅牢な免疫障害、感染症への対応し、自己寛容を生成するために細胞の種類の多数の複雑な時空調整が必要です。いくつかのダース ケモカイン受容体と対応する ligands が発見されているし、特定セルによって特徴づけられる提供する分子機構は特定の時間に特定の組織に向けることができます。したがって、走化性と移行を勉強して、免疫学の研究の不可欠なコンポーネントです。確かに、説明の in vitroアッセイは最近加速 C-C ケモカイン 19 と 21³に向かって T 細胞の走化性走化性因子を識別するためにスクリーニング用具として使用されました。ここで説明したメソッドの目的が免疫細胞走化性の in vitroとin vivoの定量的評価を許可します。

ボイテン (細胞の遊走と浸潤) 区域の試金はセル移行^4,5を評価するための安価な再現性のある、かつ迅速な方法です。標準の分析では、参院は細胞を播種し、セルが移行先下院から多孔質挿入で区切られています。希望の時間に挿入の下側に移行して細胞を固定し、光顕微鏡による定量を染色できます。しかし、そのような測定は動的なデータ コレクションを排除するシングル エンド ポイント データ収集を制限、分析のための最適な時点を決定する広範な最適化を必要とすることができます。ここでは、いくつかの適応、走化性の in vitroのリアルタイム、定量的および多重測定を許可するを説明します。

研究生体内機能の終了点を使用するすなわち与えられた組織コンパートメント内のセルの特定の蓄積。事前にラベル付けされたドナー細胞は、養子の転送を介して受信者の動物に導入されます。これらのドナー細胞は、フローサイトメトリーによる受信者組織収穫後その後識別できます。また提示は、単一の受信者動物内の別のセル型の人身売買の決定は、共同ラベリング戦略です。このメソッドは、細胞の注入、および生理学的な動物間の可変性をアカウントから動物間の変動を排除します。

プロトコル

すべてのプロシージャは、ロックフェラー大学によって承認された ' s 機関動物ケアおよび使用委員会。すべての動物は、特定の病原体フリーの条件の下で収容された.

1 体外 走

1. 文化 THP 1 細胞 10% 牛胎児血清 (FBS) 及び 4-(2-ヒドロキシエチル)-1 を添加したロズウェル パーク記念研究所 1640 年 (RPMI 1640) ⁶-。piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES; 25 mM) (完全なメディア)、0.5 〜 1.0 x 10 ⁶ セル/mL の密度を維持します
。
2. では 35 mm 細胞培養皿、30 分のカルセイン アセトキシメチルセファロスポリン (カルセイン AM; 2.5 μ M) または 37 ° C で完全な媒体の他の適切な蛍光染料を状態ごとにラベル 3.5 × 10 ⁵ THP 1 セル
   注: 色素は細胞膜透過性と生細胞ラベリングとの互換性である必要があります
。
3. 前ウォーム プレート リーダー、37 ° C
   注: 温度制御に加え下部の読み取り機能も必要です。移行の定量化のためのプレート リーダーに代わる 1.10.2 手順参照してくださいセル
。
4. 細胞ラベリング、アッセイ プレートと下部室を準備します。
   1. 使用 24 ウェル培養プレートは、ウェルあたり 1 つの条件。3 通の各条件を実行します
   。
   2. ハンクの追加 750 μ L ' s バッファー塩緩衝液 (HBSS) 25 mM HEPES と 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) で 24 ウェル プレートに。これは、基底のコントロールの条件として提供しています。 750 μ L で下部室の容量を常に維持するコンパレータ条件
      1. その他使用井戸.
         注: この例では、ヒトの単球走化性因子蛋白質 1 (MCP 1) で走 ⁷ のポジティブ コントロールとして機能します。
         1. 25 mm HEPES HBSS、BSA (0.1%)、MCP 1 を組み合わせることによりアセンブル試薬の混合物 (75 ng/mL)。大人のウシ血清を使用 (2.7 %v/v) 付加的な肯定的な制御として MCP 1
            。 注: ケモカインとケモカイン濃度調査の下で走化性の軸に依存します。凍結乾燥 MCP 1 は最終濃度 50 μ g/mL の原液を作る BSA (0.1%) の蒸留水で再停止されます。これは作業溶液 10 μ g/mL に水で希釈することができます。下側の部屋にこのソリューションの 5.6 μ L を追加します
         。
   3. 下部チャンバーの構成が完了したら後は、挿入のタブがプレートの切り込みが合っていることを確認、各ウェルに多孔質の挿入を配置します
      。 注: 挿入の適切な気孔のサイズを選択します。単球とリンパ球は、3 μ m の孔径をよく実行します。いくつかの細胞のタイプおよび/またはケモカイン システムは、最適な移行のマトリックス コーティング表面を必要があります。たとえば、MCP 1 に向かって THP 1 単球走化性の測定、フィブロネクチン、コラーゲン コーティング チップをお勧めします。定量用のプレート リーダー、挿入でポリエチレンテレフタ レートなどの光非透過性のコーティングを持っている非移行の検出を防ぐためにする必要があります上のセル室 ⁸.
5. カルセイン AM と 30 分のための細胞を培養後細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します。1,000 x g で 2 分間遠心分離細胞カルセイン AM ( 図 1) の摂取量を確認するためのセルを調べます
。
6. は、真空吸引装置を使用して上清を慎重に取り外します。HEPES 25 mM を添加した無血清 RPMI 1640 年に標識細胞を洗浄します。2 分間 1,000 x g で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します
。
7. HEPES 25 mM を添加した無血清 RPMI 1640 年に細胞を再懸濁します。セルをカウントし、セルが 1.0 〜 1.5 x 10 ⁶ セル/mL の最終濃度になるように音量を調整します
。
8. 挿入 (上院) に細胞懸濁液の分注 250 μ L.
すべての上部の小室が満たされた、優しく、プレートを持ち上げ、および移行と検出を妨げる空気泡の存在下の検査後は
9. 。バブルを削除するには、最初に挿入を再配置を削除してください。失敗した場合は、バブルを穿刺し、再挿入を配置する 27 G 針を使用します
。
10. 37 ° C に予め温めておいたプレート リーダーにプレートを置きます。
    1. 1-3 分間隔で下から蛍光測定値を取得します。カルセイン AM を使用する場合設定、蛍光励起と放射波長 485 nm、520 nm、それぞれ。セル型およびケモカイン システムによって走化性は、通常 1-4 h 以上 ( 図 2 a) を発生します
    。
    2. 連続測定する別の方法として、485 で倒立蛍光顕微鏡 ( 図 2 b) 励起と光の検出の能力を使用して井戸をイメージ プレート リーダーを使用して nm と 520 nm、それぞれ。低倍率を使用して、挿入の下側の大半を取り込みます。ImageJ または同様のソフトウェア ⁹ で画像を処理することによって細胞を定量化します
    。

2。マウスのリンパ転送養子

1. 1. 麻酔 8-12 週の ドナー細胞の準備-気化器を用いたイソフルラン麻酔 (1-3%) と古い c57bl/6 j 男性ドナー マウス。つま先ピンチで適切な麻酔深度を確認します
   。
   2. は、仰臥位にマウスを配置します。メスで正中線切開、上左腹膜腔に脾臓を探します。全体の脾臓を切除し、氷の上完全なメディア (10 %fbs と 25 mM HEPES 添加 RPMI; 1 mL/脾臓) に配置します。斬首で麻酔をかけられたドナー動物の安楽死します
   。
   3. 15 mL の円錐管に単一細胞懸濁液および伝達するシリンジのプランジャーの終わりを使用して完全なメディア (1 mL/spleen) に 40 μ m ナイロン メッシュを通して優しく脾臓組織を挽く
   。
   4. アンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散の追加 4 ボリュームのバッファーし、赤血球を溶解するために室温で 5 分間インキュベートします
   。
   5. は常温で 2 分間 1,000 x g で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します。赤血球は、ペレットに残る場合 ACK 換散バッファーで再懸濁します、室温で 5 分間インキュベート、2 分間 1,000 x g で細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄します
   。
   6. 2 - 5 10 ⁷ セル/mL、倍濃度の完全なメディアの細胞を再懸濁します、細胞の残骸を削除する 40 μ m ナイロン メッシュを介して細胞懸濁液を株します
   。 蛍光染料との互換性を持つ 10 の ⁷ セル/受信者マウス x
   7. ラベル 1 セルと 5 chloromethylfluorescein ジアセテート (最終濃度 2 μ M) ¹⁰ など、その後の固定に、保持されます。.37 ° C で 30 分間インキュベート
      注: 2 つ以上の細胞集団を追跡するには、追加のセル人口をもつ他の蛍光染料を使用します。たとえば、ドナー細胞の一部が 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) ベンゾイルでラベル付けできますが) アミノ) tetramethylrhodamine (最終濃度 2 μ M) ¹¹.
   8. 追加 4 ボリューム HBSS 補足25 mM HEPES、し、1,000 x g で 2 分及び破棄上澄み間遠心します。1 x 10 の ⁸ セル/mL の最終的な集中に HEPES 25 mM を添加した HBSS でペレットを再懸濁します。
      1. 1 つ以上の蛍光染料を使用している場合を維持注入直前まで区切られた細胞集団
      。
      2. 以降の流れ cytometry 補償のための固定液 (1 mL) に各色の細胞の小さい因数 (10 μ L) を転送します
      。
2. リンパ球の転送
   1. 8-12 週の麻酔-古い c57bl/6 j 男性受信者マウスとイソフルレン (1-3%); 気化器を使用してつま先ピンチによって麻酔の深さを確認します。動物に獣医軟膏を適用 ' 乾燥を防ぐ s 目
   。
   2. 簡単に渦ドナー細胞 (1 s) と該当する特異的標識細胞集団を組み合わせた 27 G、針で 0.5 と 1 mL 注射器に転送します。
      1. 以降の流れフローサイトメトリー解析のための固定液 (1 mL) を混合セルの小さい因数 (10 μ L) を転送します
      。
   3. 腹臥位でドナー動物を配置。わずかに突出した眼球を引き起こす目の背側の皮膚に軽度の尾圧力を適用します
   。
   4. は、内側に針を直接、各受信者のマウスにレトロな軌道のドナー細胞懸濁液 100 μ L を注入します。細胞を尾静脈から注射もできます
   。
   5. は徐々 に注射針を撤回し、回復ケージの中だけでマウスを置きます。それは意識を取り戻したまで動物を監視します。社会的なハウジングに一度完全に回復した戻る動物
   。
3. の収集と分析
   1. 1 時間後麻酔気化器を用いたイソフルラン麻酔 (1-3%) と受信者マウス; つま先ピンチによって麻酔の深さを確認します。脾臓 (または興味の他の組織) の収穫 (ステップ 2.1.2。) から完全なメディア (1 mL/受信者) に各受信者のマウス。斬首で麻酔下の動物の安楽死します
      。 注: 組織収穫前に長い間隔は少なくとも 24 時間を通じて組織蓄積を増加が
   2. 15 mL の円錐管に単一細胞懸濁液および伝達するシリンジのプランジャーのエンドを使用して完全なメディアに 40 μ m ナイロン メッシュを通して優しく脾臓組織を挽く
   。 ACK 換散の
   3. 追加 4 ボリュームは、バッファーに格納し、室温で 5 分間加温します。常温で 2 分間 1,000 x g で細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します
   。
   4. 染色の細胞を再懸濁しますバッファー (1% を添加したリン酸緩衝生理食塩水 FBS)。セルをカウントし、3 x 10 ⁷ セル/mL の最終濃度に調整します。96 ウェル底板ラウンドに細胞懸濁液を 100 μ l 添加を転送します
   。
   5. 染色細胞のフローサイトメトリーによる解析のための目的のマーカー (材料の表を参照してください)。目的のマーカーに対して蛍光標識抗体 (材料の表を参照) を追加し、, 暗闇の中 20 分のための 4 ° C で。100 μ L を追加バッファーを染色、3 分間 1,000 x g で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します
   。
   6. 200 μ L でペレットを再懸濁しますバッファーを染色、3 分間 1,000 x g で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します
   。
   7. 125 μ L 染色でペレットを再懸濁しますバッファーし、流れの cytometer 標準手順を使用を使用してサンプルを取得します
      。 注: 緑色の染料は 488 nm レーザーによって励起し、505 と 530/30 ダイクロイック フィルターで放出が検出されました。オレンジ色の染料は、561 によって興奮している nm と放出が 582/15 ダイクロイック フィルターによって検出されます。
      1. を使用して各蛍光色素を補うために 2.1.8.2 から細胞を保存します
         。 注: 励起および標識色素の発光スペクトルと一致する fluorophores が付いているビードに基づく補償を用いた準最適補償になります
      。
      2. の比を正確に判断するのに場合は 1 つ以上のラベル付き人口 ( 図 3) を使用して差動入力セルというラベルの付いたステップ 2.2.2.1 から保存した入力セルを使用します。計算の比率に基づく組織特定移行細胞 ( 図 4) ラベルが付けられます
      。

結果

カルセイン AM 染料を使用している場合、セルの外観検査はラベル取り込み (図 1) を確認します。自動蛍光測定値は時間をかけて挿入の下側のセル転送中の移行を追跡します。これらのデータでは、血清 (図 2 a) によって、MCP 1 に向かって細胞遊走の誘導だけでなく、この応答の増強を明確に示します。渡り鳥の刺激の強さ?...

ディスカッション

単純なを使用して免疫細胞の移動の定量化を行うことが、急速なin vitroとin vivoの両方を試金します。血清により MCP 1 グラデーションや増大に応えてひと単球の走化性を示す.生体内でドナー脾細胞特異的ラベル付けされたし、次の養子転送受信者動物から回収されました。

プレート リーダーを使用していくつかの時間のポイントをサンプリン?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer