Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo

Résumé

Protocoles pour une évaluation quantitative de la chimiotaxie des lymphocytes et des migrations sont des outils importants pour la recherche de l’immunologie. Un protocole in vitro est décrit ici, que les permis en temps réel, multiplexés évaluation de la migration cellulaire, ainsi qu’un complémentaire en vivo technique propice suivi de cellules natives de rate.

Résumé

La chimiotaxie est migration le long du gradient chimique spécifique¹. Chimiokines sont chimiotactiques cytokines qui favorisent le trafic cellulaire avec spécificité anatomique et temporelle². La chimiotaxie est une fonction critique des lymphocytes et autres cellules immunitaires pouvant être quantitativement évalués in vitro. Ce manuscrit décrit des méthodes qui permettent l’évaluation de la chimiotaxie, in vitro et in vivo, pour les types de cellules différents y compris les lignées cellulaires et les cellules natives. L' in vitro, budgétisation axée sur les plaques permet la comparaison de plusieurs conditions simultanément en temps réel et peut être complétée en 1-4 h. essai In vitro avec des conditions peuvent être manipulées pour introduire des agonistes et des antagonistes, comme ainsi que différencier la chimiotaxie des chemokinesis, qui est le mouvement aléatoire. En vivo traite les évaluations, les cellules immunitaires peuvent être étiquetés avec les colorants fluorescents multiples et utilisés pour transfert adoptif. L’étiquetage différentielle des cellules permet aux populations de cellules mixtes destinés à être introduits dans le même animal, ce qui diminue l’écart et réduit le nombre d’animaux requis pour une expérience suffisamment alimentée. Migration dans le tissu lymphoïde se produit dedans aussi peu que 1 h, et plusieurs compartiments tissulaires peuvent être dégustés. Cytométrie en flux après la récolte du tissu permet une analyse rapide et quantitative des schémas migratoires de plusieurs types de cellules.

Introduction

Immunité solide nécessite la coordination temporelle et spatiale complexe d’une multitude de types de cellules afin de répondre de manière appropriée à l’injure, infection et générer autotolérance. Plusieurs dizaines récepteurs de chimiokines et de leurs ligands correspondantes ont été découverts et caractérisé des mécanismes moléculaires par lesquels les cellules spécifiques peuvent être arrangés en un tissu spécifique à un moment précis. Ainsi, étudier le chimiotactisme et la migration est un élément indispensable de la recherche de l’immunologie. En effet, le test décrit dans vitro a récemment été utilisé comme un outil de dépistage pour identifier un cofacteur chimiotactique qui accélère le chimiotactisme des cellules T vers le C-C chimiokines 19 et 21³. Le but des méthodes décrites ici sont de permettre une évaluation quantitative du chimiotactisme des cellules immunitaires in vitro et in vivo.

L’essai de chambre de Boyden (migration cellulaire et l’invasion) est une méthode rapide, reproductible et peu coûteuse pour évaluer la migration de cellules^4,5. Dans l’essai standard, la chambre supérieure est ensemencée avec des cellules et est séparée par un insert poreux d’une chambre basse, dans laquelle les cellules migrent. Au moment voulu, les cellules qui ont migré vers le dessous de l’insert peuvent être fixe et colorées pour le dosage au microscope photonique. Toutefois, ces mesures restreignent la collecte de données à un seul point de fin, qui s’oppose à une collecte de données dynamique et peuvent exiger optimisation approfondie pour déterminer le point de temps optimal pour l’analyse. Ici, plusieurs adaptations sont décrits qui permettent des mesures en temps réel, quantitatives et multiplexés de chimiotactisme in vitro.

Pour des études in vivo , un point de terminaison fonctionnel est utilisé, à savoir l’accumulation spécifique des cellules dans un compartiment de tissu donné. Cellules donneuses préalablement étiquetées sont introduits dans les animaux receveurs par transfert adoptif. Ces cellules du donneur soient reconnaissables par la suite par cytométrie en flux après la récolte de tissus destinataire. Également présenté est une stratégie co étiquetage qui permet la détermination de la traite des différents types de cellules au sein d’un seul animal receveur. Cette méthode élimine la variation inter animale de l’injection de cellules et représente la variabilité physiologique des animale.

Protocole

toutes les procédures ont été approuvées par la Rockefeller University ' s Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme. Tous les animaux étaient logés dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes.

1. In Vitro chimiotactisme

1. Culture THP-1 cellules ⁶ dans Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 4-(2-hydroxyéthyl) -1- acide piperazineethanesulfonic (HEPES ; 25 mM) (toutes les médias), maintenir la densité entre 0,5 à 1,0 x 10 ⁶ cellules/mL.
2. La culture de cellules dans un 35 mm plat, étiquette de 3.5 x 10 ⁵ THP-1 de cellules par État calcéine acétoxyméthyl (calcéine-AM ; 2,5 µM) ou autre colorant fluorescent dans des médias complets à 37 ° C pendant 30 min.
   Remarque : Les colorants doivent être perméable à la membrane cellulaire et compatible avec les cellules vivantes étiquetage.
3. Chaude avant un lecteur de plaque à 37 ° C.
   Remarque : En plus du contrôle de la température, la fonctionnalité de lecture de fond est également nécessaire. Voir l’étape 1.10.2 pour une alternative à l’aide d’un lecteur pour la quantification de la migration des cellules.
4. Tandis que les cellules sont étiquetage, préparer la plaque de test et de la chambre basse.
   1. Utiliser une culture de tissu de 24 puits plaque, avec une condition / puits. Effectuer chaque condition en trois exemplaires.
   2. Ajouter 750 µL de Hank ' s Solution saline tamponnée (HBSS) tamponnée avec 25 mM HEPES et 0,1 % sérum albumine bovine (BSA) à la plaque 24 puits. Cela sert comme la condition de contrôle basal.
      1. Utilisation autre puits pour des conditions de comparateur, gardant toujours le volume total dans la chambre inférieure à 750 µL.
         NOTE : Dans cet exemple, humaine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) sert de témoin positif pour la chimiotaxie ⁷.
         1. Assemble le mélange réactif en combinant HBSS avec 25 mM HEPES, BSA (0,1 %) et le MCP-1 (75 ng/mL). Utiliser du sérum bovin adult (2,7 % v / v) avec un contrôle positif supplémentaire MCP-1.
            NOTE : Concentration de chimiokines et chimiokines dépendra de l’axe chimiotactique sous étude. Lyophilisé MCP-1 est remis en suspension dans l’eau distillée avec BSA (0,1 %) pour faire une solution avec une concentration finale de 50 μg/mL. Cela peut être dilué dans l’eau pour une solution de travail de 10 μg/mL. Ajouter 5,6 μl de cette solution à la chambre basse.
   3. Après la composition des chambres bas est terminée, placer un insert poreux dans chaque puits, en veillant à ce que les onglets de l’insert s’alignent avec les encoches de la plaque.
      Remarque : Choisir la taille des pores approprié pour les inserts. Pour les monocytes et les lymphocytes, une taille de pore de 3 μm fonctionne bien. Certains types de cellules et de chemokine peuvent nécessiter une surface enduite matrice de migration optimale. Par exemple, pour la mesure de la chimiotaxie monocyte THP-1 vers MCP-1, la fibronectine ou insertions enduit de collagène sont recommandées. Pour lecteur de plaque pour le dosage, l’insert doit avoir un revêtement lumineux-imperméants, comme le polyéthylène téréphtalate, afin d’éviter la détection de non migratrice cellules dans la haute chambre ⁸.
5. Après incubation des cellules pendant 30 min avec calcéine-AM, transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15mL. Cellules de centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min. inspectent visuellement les cellules afin de confirmer l’absorption de calcéine-AM ( Figure 1).
6. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’un aspirateur sous vide. Laver les cellules marquées en milieu sans sérum RPMI 1640 additionné de HEPES 25 mM. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 2 min et éliminer le surnageant.
7. Remettre les cellules en milieu sans sérum RPMI 1640 additionné de HEPES 25 mM. Compter les cellules et ajuster le volume pour que les cellules soient à une concentration finale de 1,0 à 1,5 x 10 ⁶ cellules/mL.
8. Distribuer 250 μL de la suspension cellulaire dans l’insert (chambre haute).
9. Après que toutes les cavités supérieures ont été pourvues, soulever délicatement la plaque et inspectent le dessous de la présence de bulles d’air qui peuvent interférer avec la migration et la détection. Pour supprimer une bulle, tout d’abord essayez de supprimer puis repositionner l’insert. En cas d’échec, utiliser une aiguille de 27 G pour percer la bulle et puis re-positionner l’insert.
10. Placer la plaque dans le lecteur de plaque préchauffée 37 ° C.
    1. Acquire lectures de fluorescence du fond à intervalles de 1-3 min. Lorsque vous utilisez calcéine-AM, fixé la fluorescence des longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 485 nm et 520 nm, respectivement. Selon le système cellulaire de type et des chimiokines, chimiotactisme produit généralement sur une période de 1 à 4 h ( Figure 2 a).
    2. Comme une alternative aux mesures en continu à l’aide d’un lecteur de plaque, image des puits à l’aide d’un microscope fluorescent inversé ( Figure 2 b), capable d’excitation et de détection de la lumière à 485 nm et 520 nm, respectivement. Utiliser un grossissement faible pour capturer la majorité du dessous de l’insert. Quantifier les cellules en traitant les images avec ImageJ ou similaire du logiciel ⁹.

2. Transfert adoptif de Lymphocytes murins

1. préparation de cellules du donneur
   1. anesthésier 8-12 semaines-vieux souris mâles donneurs de C57BL/6J avec anesthésie isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur. Confirmer la profondeur appropriée de l’anesthésie par orteil-pinch.
   2. Placer la souris dans la position en décubitus dorsal. Faire une incision médiane avec un scalpel et localisez la rate dans l’espace péritonéal gauche supérieur. Excise la rate toute et placez dans médias complet (RPMI additionné de 10 % FBS et 25 mM HEPES ; 1 mL/rate) sur la glace. Euthanasier les animaux donneurs anesthésiés par décapitation.
   3. Moudre tissu rate doucement à travers la maille en nylon de 40 µm dans les médias complets (1 mL /spleen) à l’aide de l’extrémité d’un piston de la seringue pour faire une suspension monocellulaire et le transfert d’un tube conique de 15 mL.
   4. Ajouter 4 volumes de la lyse de potassium (ACK) de chlorure d’ammonium de la mémoire tampon et incuber pendant 5 min à température ambiante pour la lyse des érythrocytes.
   5. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant. Si les érythrocytes restent dans le culot, remettre en suspension dans le tampon de lyse ACK, incuber pendant 5 min à température ambiante, centrifuger des cellules à 1 000 x g pendant 2 min et jeter le surnageant.
   6. Remettre en suspension les cellules dans les médias à une concentration de 2-5 x 10 ⁷ cellules/mL, puis la suspension de cellules de la souche à travers une maille en nylon de 40 µm pour éliminer les débris cellulaires.
   7. Label 1 x 10 ⁷ souris de cellules/destinataire avec un colorant fluorescent compatible avec vivre les cellules et qui sera retenu lors de la fixation ultérieure, par exemple 5-chloromethylfluorescein diacétate (concentration finale 2 μM) ¹⁰ . Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
      Remarque : Pour suivre plus d’une population de cellules, utilisez autres colorants fluorescents avec des populations de cellules supplémentaires. Par exemple, une partie des cellules du donneur peut être marquée avec benzoyle 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) amino) tétraméthylrhodamine (concentration finale 2 μM) ¹¹.
   8. Ajouter 4 volumes HBSS additionné 25 mM HEPES, puis centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min, puis jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans HBSS additionné de HEPES 25 mM à une concentration finale de 1 x 10 ⁸ cellules/mL.
      1. Si vous utilisez plus d’un colorant fluorescent, maintenir les populations de cellules séparées jusqu'à ce qu’immédiatement avant l’injection.
      2. Transférer une petite portion (10 μL) de cellules de chaque couleur à une solution de fixation (1 mL) d’indemnisation de cytométrie en flux ultérieurs.
2. Transfert des lymphocytes
   1. anesthésier les 8-12 semaines-vieilles souris bénéficiaires mâles C57BL/6J à l’isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur ; confirmer la profondeur de l’anesthésie par orteil-pinch. Pommade vétérinaire à l’animal ' s yeux pour éviter le dessèchement.
   2. Brièvement les cellules de donneur vortex (1 s) et le transfert à la seringue d’injection de 1 mL avec 27 G, 0,5 à aiguille, combinant des populations de cellules marquées différemment, le cas échéant.
      1. Une petite portion (10 μL) de transfert de cellules mixtes pour une solution de fixation (1 mL) pour les analyses de cytométrie en flux ultérieurs.
   3. Placer les animaux donneurs en position couchée. Appliquez une pression caudale douce sur la peau dorsale à le œil, causant le globe oculaire pour dépassent légèrement.
   4. Directe de l’aiguille médialement et injecter 100 µL de la suspension de cellules de donneur rétro-orbitalement dans chaque souris destinataire. Les cellules peuvent également être injectés via la veine caudale.
   5. Progressivement retirer l’aiguille d’injection et placez la souris seule dans une cage de récupération. Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il a repris connaissance ; retour une fois pleinement récupéré l’animal à un logement social.
3. Collecte et l’analyse
   1. après 1 h, anesthésier destinataires souris avec anesthésie isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur, confirmer la profondeur de l’anesthésie par orteil-pinch. Récolter de la rate (ou autres tissus d’intérêt) (étape 2.1.2.) de chaque destinataire souris et le déposer dans les médias complets (1 mL/destinataire). Euthanasier les animaux anesthésiés par décapitation.
      Remarque : Des intervalles plus longs avant la récolte de tissus vont augmenter l’accumulation dans les tissus grâce au moins 24 h.
   2. Moudre tissu rate doucement à travers la maille en nylon de 40 µm dans les médias complètes à l’aide de l’extrémité d’un piston de la seringue pour faire une suspension monocellulaire et transfert à tube conique de 15 mL.
   3. Ajouter 4 volumes de lyse ACK tampon et incuber 5 min à température ambiante. Centrifuger la suspension de cellules à 1 000 x g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant.
   4. Remettre les cellules en coloration buffer (tampon phosphate salin additionné de 1 % FBS). Compter les cellules et s’adapter à une concentration finale de 3 x 10 ⁷ cellules/mL. Transférer 100 µL de suspension cellulaire dans un 96 puits autour de la plaque inférieure.
   5. Cellules de tache pour marqueurs souhaités (voir la Table des matières) pour l’analyse par cytométrie en flux. Ajouter les anticorps conjugués fluorophore (voir la Table des matières) contre marqueurs souhaités et incuber à 4 ° C pendant 20 min dans le noir. Ajouter 100 µL tampon de coloration, centrifuger des cellules à 1 000 x g pendant 3 min et éliminer le surnageant.
   6. Resuspendre le culot dans 200 µL tampon de coloration, centrifuger des cellules à 1 000 x g pendant 3 min et éliminer le surnageant.
   7. Remettre le culot en coloration de 125 µL tampon et acquérir des échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux à l’aide de procédures standards.
      Remarque : Le colorant vert est excité par un laser à 488 nm et l’émission est détectée avec 505 et 530/30 filtres dichroïques. Le colorant orange est excité par un 561 nm et l’émission est détectée par un filtre dichroïque 582/15.
      1. Utilisation sauvé cellules 2.1.8.2 pour compenser chaque colorant fluorescent.
         Remarque : À l’aide de rémunération à base de perle avec des fluorophores correspondant à l’excitation et les spectres d’émission des colorants étiquetage se traduira par compensation sous-optimaux.
      2. Utiliser les cellules d’entrée enregistrées depuis l’étape 2.2.2.1 pour déterminer avec précision le rapport entre marqués différemment des cellules d’entrée si vous utilisez plus d’une population marquée ( Figure 3). Calculer la migration spécifique de tissu selon le ratio d’étiquetés aux cellules sans étiquette ( Figure 4).

Résultats

Lors de l’utilisation de colorant de calcéine-AM, une inspection visuelle des cellules confirmera l’absorption étiquette (Figure 1). Lecture fluorescent automatique suivra migration comme transport de cellules sur le dessous de l’insert au fil du temps. Ces données montrent clairement une induction de la migration cellulaire vers MCP-1, ainsi qu’une augmentation de cette réponse par le sérum (Figure 2 a). Selon le st...

Discussion

Quantification de la migration des cellules immunitaires peut être accomplie à l’aide de simple et rapide des analyses in vitro et in vivo. Nous démontrons le chimiotactisme in vitro des monocytes humains en réponse à un gradient de MCP-1 et l’augmentation mammaire par le sérum. In vivo, donneur splenocytes murins ont été étiquetés de façon différente et après transfert adoptif, parasitent les animaux receveurs.

En utilisant un lecteur de pl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer