Количественная оценка человека Моноцит хемотаксис в пробирке и мышиных лимфоцитов, торговля в естественных условиях

Резюме

Протоколы для количественной оценки лимфоцитов хемотаксис и миграции являются важными инструментами для исследования иммунологии. Здесь в пробирке Протокол описан, позволяет в реальном времени, мультиплексируются оценки миграции клеток, а также дополнительных в vivo техника благоприятных отслеживания собственных клеток селезенки.

Аннотация

Хемотаксис — миграции вдоль определенных химических градиента¹. Chemokines — эозинофилов цитокины, которые способствуют сотовой оборота с анатомическими и временных специфика². Хемотаксис является критической функции лимфоцитов и другие иммунные клетки, которые могут быть количественно оценены в пробирке. Эта рукопись описывает методы, которые позволяют оценки хемотаксис, как in vitro , так и в естественных условиях, для типов различных клеток, включая клеточные линии и родной клетки. В пробирке, плита-формат допускает сравнение нескольких условий одновременно в режиме реального времени и может быть завершена в течение 1-4 ч. В vitro пробирного условий можно манипулировать, чтобы ввести агонистов и антагонистов, как хорошо, как дифференцировать хемотаксис от chemokinesis, который является случайное движение. В естественных условиях торговли людьми оценок иммунные клетки может помечены с несколькими флуоресцентными красителями и используется для передачи в приемную. Дифференциальный маркировки клеток позволяет смешанных клеточных популяций в то же самое животное, тем самым снижения дисперсии и сократить количество животных, необходимых для эксперимента надлежащим питанием. Миграция в лимфоидной ткани происходит всего за 1 h, и можно отведать несколько отсеков ткани. Проточной цитометрии после урожая тканей позволяет для быстрого и количественный анализ миграционных моделей из нескольких типов клеток.

Введение

Надежный иммунитет требует сложных временных и пространственных координации множества типов клеток для того чтобы надлежащим образом реагировать на травмы, инфекции и генерировать self-tolerance. Было обнаружено несколько десятков хемокиновых рецепторов и их соответствующие лигандов и характеризуется предоставление молекулярных механизмов, какие конкретные ячейки могут быть направлены в конкретной ткани в определенное время. Таким образом изучая хемотаксис и миграции является неотъемлемым компонентом исследования иммунологии. Действительно описанных в vitro assay недавно использовался как инструмент скрининга для выявления эозинофилов кофакторы, что ускоряет хемотаксис Т-клеток к chemokines 19 и 21 C-C³. Методы, описанные здесь, разрешить количественные оценки иммунных клеток хемотаксис в пробирке и в естественных условиях.

Пробирная палата Бойден (миграции клеток и вторжения) это недорогой, воспроизводимые и быстрый метод для оценки миграции клеток^4,5. В стандартной assay верхняя палата заполняется с клетками и отделяется пористые вставки из нижней палаты, в которой клетки мигрируют. В нужное время клетки, которые мигрировали на нижней пластины можно фиксированной и запятнана световой микроскопии для quantitation. Однако такие измерения ограничить сбор данных для одной конечной точки, которая исключает возможность сбора динамических данных и может требовать обширные оптимизации для определения оптимального времени точки для анализа. Здесь описаны несколько приспособлений, которые позволяют в реальном времени, количественные и мультиплексных измерения хемотаксис в пробирке.

В vivo исследований, используется функциональный конечной точки, а именно конкретные накопления клеток в отсеке данной ткани. Предварительно обозначенных донором клетки вводятся в получателей животных через приемные передачи. Впоследствии эти клетки донора может быть идентифицирован проточной цитометрии, после сбора урожая получателей ткани. Также представлен совместной маркировки стратегия, которая позволяет для определения торговли людьми из различных типов клеток в пределах одного получателя животных. Этот метод устраняет между животных отклонения от инъекции клеток и приходится физиологического между животных изменчивости.

протокол

все процедуры были одобрены Рокфеллеровского университета ' s, институциональный уход животных и использования Комитетом. Все животные были размещены при определенных условиях свободной от возбудителя.

1. хемотаксис In Vitro

1. культуры THP-1 клетки ⁶ в Розуэлле парк Мемориальный институт 1640 (RPMI 1640) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 4-(2-гидроксиэтилкрахмала) -1- piperazineethanesulfonic кислота (HEPES, 25 мм) (полное СМИ), поддержание плотности между 0,5-1,0 x 10 ⁶ клеток/мл.
2. В 35 мм клеточной культуры блюдо, лейбл 3.5 x 10 ⁵ THP-1 клеток на состояние с Флуорексон acetoxymethyl (Флуорексон ам; 2,5 мкм) или другие подходящие Люминесцентную краску в полной СМИ при 37 ° C на 30 мин
   Примечание: Красители должны быть проницаемой мембраны клетки и совместимы с живой клетки маркировки.
3. Предварительно теплой пластины читателя до 37 ° C.
   Примечание: в дополнение к контроля температуры, снизу чтение функциональность требуется также. Шаг 1.10.2 альтернативу читатель пластины для количественной оценки миграции клеток.
4. В то время как клетки маркировки, подготовить пробирного пластины и нижняя палата.
   1. Использование культуры ткани 24-ну пластины, с одним условием в колодец. Выполните каждое условие в трех экземплярах.
   2. Добавить 750 мкл Хэнк ' s Buffered солевой раствор (HBSS) буфер с 25 мм HEPES и 0,1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) к пластине 24-хорошо. Это служит базальной управления состоянием.
      1. Использование других скважин для компаратора условий, всегда поддерживать общий объем в нижней камере на 750 мкл.
         Примечание: В этом примере человека Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) служит в качестве позитивного управления для хемотаксис ⁷.
         1. Собрать смеси реагентов, объединив HBSS с 25-мм HEPES, BSA (0,1%) и МКП-1 (75 нг/мл). Используйте взрослых бычьим сывороточным (2.7% v / v) с МКП-1 как дополнительный положительный элемент управления.
            Примечание: Концентрация хемокиновых и хемокиновых будет зависеть от оси эозинофилов изучается. Лиофилизированные MCP-1 высокомобильна в дистиллированной воде с BSA (0,1%), чтобы сделать Стоковый раствор с конечной концентрации 50 мкг/мл. Это могут быть ослаблены в воде для рабочего раствора 10 мкг/мл. Добавить 5.6 мкл этого решения в нижнюю палату.
   3. После завершения состав камер снизу уложите каждой скважины, обеспечивая, что вкладки Вставка выровнять с насечками пластины пористые вставки.
      Примечание: Выберите соответствующие поры для вставки. Для моноцитов и лимфоцитов размер пор 3 мкм выполняет хорошо. Некоторые типы клеток и/или хемокиновых систем может потребовать матрицы покрытием поверхности для оптимального миграции. Например для измерения хемотаксис Моноцит THP-1 к MCP-1, фибронектин или коллагена покрытием вставки рекомендуется. Для читателя пластины для количественный, вставки должны иметь свет impermeant покрытие, например, полиэтилентерефталат, для предотвращения обнаружения миграции клеток в верхней камеры ⁸.
5. После инкубации клеток для 30 минут с Флуорексон ам, суспензию клеток передавать 15 мл Конические трубки. Центрифуга клетки на 1000 x g на 2 мин осмотрите клетки для подтверждения поглощение Флуорексон-ам ( рис. 1).
6. Тщательно удалить супернатант с помощью вакуум отсос. Вымойте помечены клеток в сыворотке крови бесплатно RPMI 1640 дополнена HEPES 25 мм. Центрифуга клетки на 1000 x g на 2 мин и удалить супернатант.
7. Ресуспензируйте клеток в сыворотке крови бесплатно RPMI 1640 дополнена HEPES 25 мм. Подсчитать ячейки и регулировки громкости, так что клетки находятся в конечной концентрации 1,0-1,5 х 10 ⁶ клеток/мл.
8. Отказаться от 250 мкл суспензии клеток в Вставка (верхняя палата).
9. После того, как все верхние палаты были заполнены, осторожно поднимите пластину и проверить нижней на наличие пузырьков воздуха, которые могут препятствовать миграции и обнаружения. Чтобы удалить пузырь, сначала удалите повторного позиционирования вставки. Если сбойных, используйте 27 G иглой проколоть пузырь и затем пересмотреть позицию вставки.
10. Место пластину в считывающее устройство плита подогретым 37 ° C.
    1. Приобретать флуоресценции чтений от дна интервалом 1-3 мин. При использовании Флуорексон ам, установите флюоресценция волны возбуждения и выбросов на 485 Нм и 520 Нм, соответственно. В зависимости от типа и хемокиновых системы клетки, хемотаксис обычно происходит более чем 1-4 ч ( рис. 2A).
    2. В качестве альтернативы для непрерывных измерений с помощью пластины читатель, изображение скважин с помощью Перевернутый флуоресцентный микроскоп ( рис. 2B) способны возбуждения и обнаружения света в 485 Нм и 520 Нм, соответственно. Используйте малое увеличение захватить часть нижней пластины. Подсчитать ячейки путем обработки изображения с ImageJ или аналогичного программного обеспечения ⁹.

2. Приемных передачи мышиных лимфоцитов

1. Подготовка донорских клеток
   1. Anesthetize 8-12 неделя-старых мышей C57BL/6J мужской доноров с изофлюрановая анестезии (1-3%) с помощью испарителем. Подтвердить соответствующие глубины анестезии, мыс пинча.
   2. Поместите курсор мыши в лежачем положении. Сделать срединной линии разреза с помощью скальпеля и найдите селезенки в верхнем левом перитонеального пространства. Акцизный весь селезенки и поместите в полной СМИ (RPMI, дополненная 10% FBS и 25 мм HEPES; 1 мл/селезенки) на льду. Усыпить животных наркотизированных доноров путем обезглавливания.
   3. Молоть ткань селезенки мягко через 40 мкм нейлоновая сетка в полной СМИ (1 мл /spleen) используя конце поршень шприца, чтобы подвеска одноклеточных и передачи 15 мл Конические трубки.
   4. Добавить 4 тома аммония хлорид калия (ACK) лизис буфер и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре, чтобы лизировать эритроцитов.
   5. Центрифуга клетки на 1000 x g на 2 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Если эритроцитов остаются в гранулах, ресуспензируйте ACK литического буфера, инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, центрифуга клетки на 1000 x g на 2 мин и удалить супернатант.
   6. Ресуспензируйте клетки в полной СМИ в концентрации 2-5 x 10-⁷ кл/мл, а затем деформации суспензию клеток через 40 мкм нейлоновая сетка для удаления мусора ячейки.
   7. Этикетки 1 x 10 ⁷ клеток/получатель мышь с Люминесцентную краску, совместимый с живой клетки и что будут сохранены при последующих фиксация, например 5-chloromethylfluorescein диацетата (конечная концентрация 2 мкм) ¹⁰ . Инкубировать при 37 ° C на 30 мин
      Примечание: Чтобы отслеживать более чем одной популяции клеток, используйте другие флуоресцентных красителей с дополнительных клеточных популяций. Например, часть донорских клеток могут быть помечены 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) бензоил) аминокислот) тетраметилродамина (конечная концентрация 2 мкм) ¹¹.
   8. Добавить 4 тома HBSS дополнена 25 мм HEPES, а затем центрифуги на 1000 x g 2 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле в HBSS дополнена HEPES 25 мм до конечной концентрации 1 x 10 ⁸ кл/мл.
      1. При использовании более чем одного Люминесцентную краску, держать популяции клеток, разделенных непосредственно до инъекции.
      2. Передачи небольшой Алиготе (10 мкл) клеток каждого цвета фиксирующие решение (1 мл) для последующего потока цитометрии компенсации.
2. Передачи лимфоцитов
   1. анестезировать 8-12 неделя-старый мужской получателей мышей C57BL/6J с изофлюрановая (1-3%), используя испаритель; подтвердить глубины анестезии, мыс пинча. Применять мазь ветеринарный животных ' глаза для предотвращения высыхания.
   2. Кратко клеток донора вихря (1 s) и передача инъекции 1 мл шприц с 27 G, 0,5 в иглу, сочетая дифференциально помечены клеточных популяций, если применимо.
      1. Передачи небольшой Алиготе (10 мкл) смешанных клеток фиксирующие решение (1 мл) для анализа последующих потоков цитометрии.
   3. Место доноров животных в лежачем положении. Мягкий хвостового давление на кожу спины в глаза, вызывая глазного яблока, слегка выступать.
   4. Прямые иглы медиально и вставляют 100 мкл суспензии клеток доноров ретро орбитально каждого получателя мыши. Клетки могут также вводиться через Вену хвост.
   5. Постепенно снять иглу и место мыши только в клетке восстановления. Мониторинг животных до тех пор, пока он сознание; один раз полностью восстановленные возвращение животного к социальному жилью.
3. Сбора и анализа
   1. после 1 h, анестезировать получателей мышей с изофлюрановая анестезии (1-3%), используя испаритель; подтвердить глубины анестезии, мыс пинча. Урожай селезенки (или другие ткани интерес) (шаг 2.1.2.) от каждого получателя мыши и место в полной СМИ (1 мл/получателя). Усыпить наркотизированных животных путем обезглавливания.
      Примечание: Более длительные интервалы до ткань урожай увеличит накопления ткани через по крайней мере 24 h.
   2. Молоть ткань селезенки мягко через 40 мкм нейлоновая сетка в полной СМИ, используя конце поршень шприца, чтобы подвеска одноклеточных и передачи 15 мл Конические трубки.
   3. Добавить 4 тома ACK лизис буфер и инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Центрифуга суспензию клеток на 1000 x g на 2 мин при комнатной температуре и удалить супернатант.
   4. Ресуспензируйте клетки в пятнать буфера (фосфат амортизированное saline дополнен с 1% FBS). Подсчитать ячейки и приспособиться к конечной концентрации 3 x 10 ⁷ кл/мл. Передачи 100 мкл суспензии клеток к 96-луночных раунд днище.
   5. Пятно клетки для желаемого маркеров (см. таблицу материалы) для анализа проточной цитометрии. Добавить Флюорофор конъюгированных антител (см. таблицу материалы) против желаемого маркеры и Инкубируйте на 4 ° C на 20 мин в темноте. 100 мкл окрашивание буфера, центрифуга клетки на 1000 g x 3 мин и удалить супернатант.
   6. Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл окрашивание буфера, центрифуга клетки на 1000 g x 3 мин и удалить супернатант.
   7. Ресуспензируйте Пелле в 125 пятнать мкл буфера и приобрести образцы с использованием проточный цитометр, с использованием стандартных процедур.
      Примечание: Зеленый краситель возбужденные 488 нм лазер и обнаружения выбросов с 505 и 530/30 дихроичные фильтры. Оранжевый краситель спешит 561 Нм и выбросов определяется 582/15 Дихроичный фильтр.
      1. Использовать сохраненные клетки от 2.1.8.2 для компенсации каждой флуоресцентных красителей.
         Примечание: Использование компенсации на основе шарик с флуорофоров, возбуждения и выбросов спектры маркировки красителей приведет к неоптимальной компенсации.
      2. Использовать сохраненные ячеек ввода от шага 2.2.2.1 точно определить соотношение дифференциально меткой ячейки ввода при использовании более чем одного помечены населения ( рис. 3). Рассчитать ткани конкретной миграции, основанный на соотношении помечены для неподписанных клеток ( рис. 4).

Результаты

При использовании красителя Флуорексон ам, визуальный осмотр клеток подтвердит лейбл поглощения (рис. 1). Автоматизированный флуоресцентные чтений будет отслеживать миграции как клетки транзита на нижнюю пластины с течением времени. Эти данные ясно п?...

Обсуждение

Количественная оценка миграции иммунных клеток может быть достигнуто с помощью простой и быстрый assays в пробирке и в естественных условиях. Мы демонстрируем хемотаксис в vitro человека моноцитов в ответ на МКП-1 градиента и увеличение в сыворотке крови. В естественных усл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer