JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

علينا أن نظهر تكنولوجيا رقاقة المفاجئة لأداء تحديدكم ساندويتش متعدد خالية إلى reactivity المشتركة ببساطة العض شريحتين. جهاز الأداة تستخدم لنقل المواد الكاشفة موثوق من ميكرواري إلى ميكرواري. يمكن استخدام شرائح إضافية لأي من التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تتطلب كولوكاليزيشن كواشف المختلفة دون التلوث عبر.

Abstract

وقد أظهرت تحليل البروتين متعدد متفوقة التشخيص حساسية ودقة مقارنة بالبروتينات وحيدة. جسم [ميكروارس] السماح للآلاف من الصغر تحديدكم تنفيذها في وقت واحد على شريحة واحدة. تنسيق المقايسة ساندويتش يحسن خصوصية الفحص عن طريق الكشف عن كل هدف مع اثنين من الأجسام المضادة، ولكن يعاني من ه بين الكواشف مما يحد من قدراتها المتنوعة. جسم كولوكاليزيشن ميكرواري (ACM) قد وضعت للكشف عن البروتين متعدد خالية إلى ريكتيفيتي المشتركة، ولكن يتطلب نصاب مكلفة في الموقع لتلفيق ميكرواري خلال فحوصات. في هذا العمل، ونظهر تكنولوجيا رقاقة المفاجئة التي تنقل الكاشف من ميكرواري إلى ميكرواري ببساطة أطباق رقائق اثنين معا، وبالتالي يلزم لا نصاب أثناء حضانة عينة والطلب اللاحق للكشف عن الأجسام المضادة (اللمسات) عند تخزين الشرائح السابقة رصدت، الناي بإعداد الشرائح من تنفيذ المقايسة. يتم عرض كلا أساليب نقل مفردة ومزدوجة تحقيق المواءمة الدقيقة بين [ميكروارس] اثنين وشرح لتصنيع الشرائح لكلا الأسلوبين. وتبين النتائج أن < قد تحقق 40 ميكرومتر المحاذاة مع نقل مزدوجة، والوصول بكثافة صفيف من 625 البقع/سم2. وأجريت المناعة 50-بليكسيد لإثبات إمكانية استخدام رقاقة المفاجئة في تحليل البروتين متعدد. حدود الكشف عن البروتينات 35 في نطاق بيكوغرام/مل.

Introduction

قد توفر فريق يتألف من البروتينات المتعددة المؤشرات الحيوية أعلى حساسية وخصوصية من العلامات البيولوجية واحدة في تشخيص الأمراض المعقدة مثل السرطان1،2. وقد مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) معيار الذهب التكنولوجيا المستخدمة في المختبرات السريرية تحقيق حد كشف في انخفاض بيكوغرام/مل في البلازما، ولكن حدود لهدف واحد كل مقايسة3،،من45. وقد وضعت جسم [ميكروارس] لاستيعاب الآلاف من المنمنمة فحوصات أجريت بالتوازي على مجهر واحد شريحة6،،من78. ومع ذلك، محدودة القدرة المتنوعة لهذا الأسلوب التي يحركها كاشف ه، الناشئة عن تطبيق مزيج اللمسات، ويصبح أكثر إشكالية مع عدد متزايد من أهداف9،10 , 11-جيش التحرير الشعبي الصيني وآخرون. وقد ذكر أن ضعف الناتج مقايسة ساندويتش متعدد المقاييس ك 4N(N-1) حيث N هو عدد الأهداف12.

للتخفيف من ه في جسم [ميكروارس], جسم كولوكاليزيشن ميكرواري وضعت (ACM) في المختبر ل المقايسة ساندويتش متعدد12. التقاط الأجسام المضادة (سيارات الأجرة) رصدت على الركازة مع نصاب ميكرواري. بعد تطبيق عينات حظر على السطح، وثم رصدت اللمسات الفردية على البقع نفسها مع المجمع مستضد cAb. يمكن تخفيف جميع السيناريوهات ه بين الأضداد والمستضدات مع ACM، وحدود الكشف في pg/mL قد تحققت. ومع ذلك، يتطلب البروتوكول المقايسة إعداد واكتشاف اللمسات أثناء تجارب باستخدام نصاب ميكرواري في الموقع بدقة عالية لغرض المحاذاة، ومكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتحد من التطبيق الواسع النطاق لهذه التكنولوجيا في مختبرات أخرى. ACM يده، يدعى رقاقة المفاجئة وضعت للمشتركة الحرة reactivity وخالية من نصاب متعدد ساندويتش تحديدكم13،،من1415. سيارات الأجرة واللمسات مسبقاً رصدت على شريحة مقايسة وشريحة نقل على التوالي في تنسيق ميكرواري وتخزينها. أثناء الفحص، يتم استرداد الشرائح ونقلت ميكرواري اللمسات جماعياً على شريحة المقايسة ببساطة العض رقائق اثنين معا. يستخدم جهاز المفاجئة لنقل كاشف موثوق بها. استخدمت الشرائح النيتروسليلوز المغلفة بقدرة ربط جسم كبيرة نسبيا كالشرائح المقايسة لامتصاص قطرات السائل ومما ييسر نقل الكاشف، بيد الشرائح أكثر تكلفة من الشرائح الزجاجية العادية وميكرواري الماسحات الضوئية المتوافقة مع الشرائح غير الشفافة ضرورية للحصول على إشارة.

في هذا العمل، ونظهر البروتوكول المنفذ المناعة ساندويتش متعدد مع شريحة إضافية. قد وضعت جهاز رواية مبكرة لنقل كاشف أكثر ملائمة وموثوق بها من ميكرواري إلى ميكرواري. الأهم من ذلك، أنشأنا هنا طريقة نقل الكاشف على الشرائح الزجاجية العادية مع رقاقة المفاجئة. البقع 1024 تم بنجاح نقل والانحياز إلى شريحة زجاج، إلى حد كبير توسيع نطاق استخدام هذه التكنولوجيا في معظم المختبرات.

Protocol

1. تصنيع وتخزين المفاجئة رقائق

  1. طريقة نقل واحد ( الشكل 1a)
    1. بقعة cAb الحلول التي تحتوي على 400 ميكروغرام/مل أجسام والجلسرين 20% في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) على من النيتروسليلوز (أو كوب فونكتيوناليزيد) الشريحة المقايسة مع نفث حبر ميكرواري نصاب 13 في رطوبة النسبية 60% (1.2 nL لكل بقعة) مع 800 ميكرون مركز إلى مركز المباعدة بين الولادات. تأكد من أن يتم إصلاح الشريحة على سطح السفينة نصاب وفقا لزاوية واحدة (هنا، استخدمت الزاوية اليسرى السفلية).
    2. احتضان الشريحة المقايسة رصدت في درجة حرارة الغرفة ح 1 مع رطوبة النسبية 60%-
    3. المشبك طوقا شريحة الوحدة نمطية مع مقصورات 16 على الشريحة المقايسة لتقسيمه إلى 16 بئرا. شطف الشريحة ثلاث مرات بإضافة 80 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% 20 توين (ببست) في كل منهما جيدا، وتهتز عند 450 دورة في الدقيقة في شاكر، 5 دقيقة في كل مرة.
    4. ميليلتر إضافة 80 من عرقلة الحلول كل خير ويهز ح 1 450 لفة في الدقيقة-
    5. إزالة طوقا والجاف للشريحة المقايسة مع تيار نيتروجين.
      6. إصلاح شريحة نقلها على سطح السفينة نصاب
    6. ودفع الركن الأيسر السفلي من الشريحة ضد الزاوية السفلية اليسرى من سطح السفينة نصاب. نفث الحبر بقعة صفيف من محاذاة علامات (حلاً خرز الصغير البوليستيرين) مع نفس تخطيط أن لسيارة أجرة.
      7. واسمحوا
    7. علامات محاذاة الجاف. الوجه نقل الشريحة ووضعها مرة أخرى على سطح السفينة نصاب، تحديد ضد الزاوية اليسرى السفلي-
    8. إعداد الدأب اكتشاف الحلول التي تحتوي على 20 ميكروغرام/مل الأجسام المضادة والجلسرين 20% 1% جيش صرب البوسنة-
    9. استخدام نصاب ' s الكاميرا، اتخاذ صورة لعلامة المحاذاة. تنفيذ هذه الصورة في برنامج اكتشاف كالاعتماد والحصول على نظام التعرف على الصورة نصاب النافثة للحبر لتحديد علامة الأيسر العلوي أكثر. استخدام تنسيق لها كالمكان الأول في الصفيف الدأب. NL بقعة 8 كل قطره مع مسافة 800 ميكرون مركز إلى مركز-
  2. طريقة نقل مزدوجة ( الشكل 1b)
    1. مكان نقل شريحة 1 على سطح السفينة نصاب inkjet على الركن الأيسر السفلي. بقعة حلول سيارات الأجرة التي تحتوي على 400 ميكروغرام/مل الأجسام المضادة والجلسرين 20% 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني على الشريحة مع نصاب ميكرواري النافثة لحبر في رطوبة النسبية 60% (0.4 nL لكل بقعة و ~ 200 ميكرومتر في القطر). مركز إلى مركز التباعد هو 400 ميكرون.
    2. المفاجئة نقل مع النيتروسليلوز المغلفة (أو كوب فونكتيوناليزيد) المقايسة شريحة باستخدام جهاز المفاجئة ( الشكل 2) لنقل قطرات مقصورة على شريحة المقايسة.
      1. بدوره كل ستة أزرار على جانب الجهاز أداة إضافية بمقدار 90 درجة لسحب وقفل جميع بلونجيرس في موقف فتح. إدراج الشريحة نقل حامل الشرائح في وعاء به مع الزاوية المقطوعة التي تواجه دبوس بوجو الثابتة. تشغيل أول مجموعة من الأزرار الثلاثة للإفراج عن بلونجيرس مع دبوس بوجو الذهبي وتأكد من أن الشرائح يتم الضغط ضد دبابيس المحاذاة.
      2. إدراج شريحة المغلفة النيتروسليلوز في الأداة جهاز رأسا يجلس على دبابيس بوجو 4. تشغيل المجموعة الثانية من ثلاثة أزرار للإفراج عن بلونجيرس مع دبوس فضة وتأكد من أن الشرائح يتم الضغط ضد دبابيس المحاذاة.
      3. إغلاق الجهاز الأداة عن طريق وضع شل الأعلى على حامل الشرائح باستخدام أعمدة المحاذاة وثقوب لتحديد المواقع بدقة.
      4. إدراج الجهاز الأداة مغلقة في قفصة ودفع علامة الإغلاق تماما أسفل جلب [ميكروارس] وجها لوجه مع ممارسة الضغوط المناسبة. تبقى مغلقة للحد الأدنى 1
    3. فصل الشرائح. احتضان الشريحة المقايسة في درجة حرارة الغرفة ح 1 مع رطوبة النسبية 60%. أغسل وكتلة جافة الشريحة المقايسة كما هو موضح في الخطوات 1-1-3-1-1-5-
    4. مكان آخر نقل الشريحة على سطح نصاب النافثة للحبر ودفع ضد الركن الأيسر السفلي. حلول الدأب الموضعية التي تحتوي على 50 أو 100 ميكروغرام/مل من الأجسام المضادة (انظر الجدول 1) والجلسرين 20% 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني. التأكد من أن كل بقعة 0.8 nL ومركز إلى مركز التباعد بين البقع هو 400 ميكرون.
      5. تخزين
    5. الفحص ونقل الشريحة. ختم المقايسة ونقل الشرائح في محكم حقيبة تحتوي على ديسيككانت، ووضع في ثلاجة-20 درجة مئوية-

2. متعدد تحديدكم مع رقائق الأداة

  1. استرجاع الشريحة المقايسة من الثلاجة. اترك حقيبة مختومة لمدة 30 دقيقة حتى يأتي الشريحة إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. المسلسل 7-نقطة
  2. تحضير تمييع عينة حلول النتوءات البروتينات في برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% توين-20-
    ملاحظة: هنا، 5 إضعاف إضعاف هو استخدام عامل. تركيزات الانطلاق لكل البروتين وترد في الجدول 1-
  3. تحضير العينة الحلول حسب الاقتضاء. على سبيل المثال، يؤدي إلى تمييع مصل الدم البشري 4 مرات في المخزن المؤقت ببست.
  4. المشبك طوقا 16-مقصورة على الشريحة المقايسة.
  5. تعبئة عمود واحد من 8 آبار مع البروتين 7 إضعاف الحلول وحل عازلة خالية من البروتين ببست بيبيتينج. "الماصة؛" الحلول عينة في 8 آبار أخرى على الشريحة نفسها-
    ملاحظة: يمكن أن يكون لائقاً 80 ميليلتر الحلول في كل بئر. يمكن استخدام الشرائح أكثر لقياس عينات إضافية عند الضرورة.
  6. احتضان العينات على شاكر 450 لفة في الدقيقة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 ° C. أغسل الشريحة ثلاث مرات مع ببست على شاكر 450 لفة في الدقيقة، 5 دقيقة في كل مرة. إزالة طوقا والجاف للشريحة تحت تيار غاز النيتروجين.
    7. استرداد
  7. نقل الشريحة مع اللمسات من الثلاجة. الاحتفاظ بحقيبة مختومة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان الشريحة في دائرة مغلقة (مثل مربع فارغ نصائح) التي تحتوي على 60% رطوبة حبات الاستقرار لمدة 20 دقيقة الإماهة.
  8. المفاجئة نقل الشريحة مع الشريحة الفحص باستخدام جهاز المفاجئة ( الشكل 2) لنقل قطرات الدأب. راجع المقطع 1.2.2 لتشغيل الأجهزة الإضافية-
  9. فصل الشرائح. احتضان الشريحة المقايسة في دائرة مغلقة التي تحتوي على 60% رطوبة الاستقرار الخرز حاء 1 المشبك الشريحة المقايسة مع طوقا 16-المقصورة وشطف الشريحة 4 مرات استخدام ببست في شاكر 450 لفة في الدقيقة، 5 دقيقة في كل مرة.
  10. ميليلتر ماصة 80 من الحلول التي تحتوي على 2.5 ميكروغرام/مل ستريبتافيدين فلوروفوري في برنامج تلفزيوني في كل بئر. احتضان لمدة 20 دقيقة على شاكر 450 لفة في الدقيقة-
  11. شطف الشريحة 3 مرات مع ببست ومرة بماء مقطر على شاكر 450 لفة في الدقيقة. إزالة طوقا والجاف شريحة باستخدام غاز النيتروجين.

3. شريحة بيانات المسح والتحليل

  1. تفحص الشريحة المقايسة مع الماسح ضوئي ميكرواري الأسفار باستخدام الليزر-635-شمال البحر الأبيض المتوسط-
  2. استخراج صافي كثافة كل نقطة باستخدام برامج (مثل محلل برو الصفيف) تحليل 16-
  3. حساب الحد الأقصى للكشف (اللد) من البروتين كل استخدام برمجيات الإحصائية وتحديد تركيزات البروتين في العينات-
    ملاحظة: اللد يعرف التقاطع Y لمعيار الاتحاد الجمركيrve بمقدار ثلاثة إضعاف الانحراف المعياري لثلاثة فحوصات مستقلة.

النتائج

ويرد في الشكل 1إجراء فحص واحد وضعف أساليب نقل. في نقل واحدة، رصدت سيارة أجرة مباشرة على الشريحة المقايسة وينقلون اللمسات على شريحة المقايسة عند استخدامها في نمط مرآة من سيارات الأجرة (الشكل 1a). مطلوب إجراء نقل واحد فقط، ولكن هذا الأسلوب يعا...

Discussion

في هذا العمل، وقد قدمنا عن تكنولوجيا رقاقة الأداة يجعل تحديدكم خالية إلى reactivity المشتركة المتعددة المتاحة على نطاق واسع للباحثين مع الإعداد التجريبية الأساسية. مختلفة من القائمة جسم [ميكروارس]، لا يوجد نصاب ميكرواري المسبق للمستخدمين النهائيين. أظهر كل واحد وضعف أساليب نقل، ونقل مزدوج يت?...

Disclosures

وقدمت جامعة ماكغيل طلب البراءة على بعض جوانب هذا العمل مع لي هاييان وديفيد جونكر المخترعين.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور روب سلاديك لاستخدام نصاب النافثة للحبر. ونعترف الدعم النهائي من "المعاهد الكندية" للبحوث الصحية (استوفوا)، والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة)، والمعهد الكندي للبحوث المجتمع السرطان ومؤسسة كندا للابتكار (CFI). دي جي بفضل دعم من "كرسي أبحاث كندا".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline tabletFisher Scientific5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5Rocklands000-06
Tween-20Sigma-Aldrichp1379
Bovine serum albuminJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc001-000-162
GlycerolSigma-AldrichG5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray StabilizerSurModics, IncSG02
Nitrocellulose coated slidesGrace Bio-Laboratories, Inc305116
Aminosilane coated slidesSchott North America1064875
Snap DeviceParallex BioAssays Inc.PBA-SD01
Inkjet microarray spotterGeSiMNanoplotter 2.0
Slide module gasketGrace Bio-Laboratories, Inc204862
Humidity Stabilization BeadsParallex BioAssays Inc.PBA-HU60
Array-Pro Analyzer softwareMedia CyberneticsVersion 4.5
Fluorescence microarray scannerAgilentSureScan Microarray Scanner
Biostatistics softwareGraphPad SoftwareGraphPad Prism 6
Endoglin capture antibodyR&D SystemsMAB10972
Endoglin proteinR&D Systems1097-EN
Endoglin detection antibodyR&D SystemsBAF1097
IL-6a (see Table 1)R&D Systems
IL-6b (see Table 1)Invitrogen

References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

129 reactivity

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved