Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Resumo

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

Resumo

Multiplexado proteína análise mostrou sensibilidade diagnóstica superior e precisão em comparação com proteínas única. Os microarrays do anticorpo permitem milhares de micro escala imunoensaios executados simultaneamente em um único chip. Formato de ensaio sanduíche melhora a especificidade do ensaio, detectando cada alvo com dois anticorpos, mas sofre de reactividade cruzada entre reagentes, limitando assim a sua capacidade de multiplexação. Anticorpo colocalization microarray (ACM) foi desenvolvido para a deteção de proteínas multiplexado cross-reactivity-livre, mas requer um caro observador no local para a fabricação de microarray durante os ensaios. Neste trabalho, vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap que transfere o reagente de microarray-para-microarray por simplesmente tirando dois chips juntos, que assim, nenhum observador é necessária durante a incubação da amostra e posterior aplicação de anticorpos de deteção (dAbs) em cima armazenamento de slides pre-manchados, dissociando a preparação de slide da execução do ensaio. Ambos os métodos de transferência de simples e duplas são apresentados para atingir o alinhamento exato entre os dois microarrays e a fabricação de slide para ambos os métodos são descritos. Os resultados mostram que < 40 μm alinhamento foi conseguido com dupla transferência, atingindo uma densidade de matriz de 625 pontos/cm². Um imunoensaio 50-plexed já foram realizado para demonstrar a facilidade de utilização do chip snap na análise de proteína multiplexado. Limites de detecção de 35 proteínas estão no intervalo de pg/mL.

Introdução

Um painel de biomarcadores, compreendendo várias proteínas pode fornecer maior sensibilidade e especificidade do que um único biomarcador no diagnóstico de doenças complexas como câncer^1,2. O ensaio imunoenzimático (ELISA) tem sido a padrão-ouro tecnologia utilizada em laboratórios clínicos, alcançar um limite de detecção em baixa pg/mL no plasma, mas os limites para um destino por ensaio^3,4,5. Os microarrays do anticorpo foram desenvolvidos para acomodar milhares de ensaios miniaturizados conduzidas em paralelo em um microscópio único slide^6,7,8. No entanto, a capacidade de multiplexação desse método é limitada pela reactividade cruzada orientada no reagente, decorrentes da aplicação de uma mistura de dAbs, e torna-se mais problemático com um número crescente de destinos^{9,10 , 11}. Pla et al. afirmaram que a vulnerabilidade resultante de um ensaio de sanduíche multiplex dimensiona como 4N(N-1) onde N é o número dos alvos¹².

Para atenuar a reactividade cruzada em Microarrays do anticorpo, o anticorpo colocalization microarray (ACM) foi desenvolvido em nosso laboratório para ensaio de sanduíche multiplex¹². Anticorpos de captura (táxis) estão manchados em uma carcaça com um localizador de microarray. Após bloqueio amostras são aplicadas na superfície, e então pinceladas individuais são avistadas nos mesmos pontos com o complexo antígeno-táxi. Todos os cenários de reactividade cruzada entre antígenos e anticorpos podem ser atenuados com ACM, e limites de detecção em pg/mL foram alcançados. No entanto, o protocolo de ensaio requer preparação e manchando os dAbs durante os experimentos usando um localizador de microarray no local com alta precisão para efeito de alinhamento, que é caro e demorado, limitando a ampla aplicação desta tecnologia na outros laboratórios. Um ACM portátil, chamado snap chip foi desenvolvido para cross-reactivity-free e livre de observador multiplex sanduíche imunoensaios^13,14,15. Táxis e pinceladas são pre-manchadas em um slide de ensaio e um slide de transferência respectivamente em formato de microarray e armazenadas. Durante o ensaio, os slides são recuperados e um microarray de pinceladas são transferidos coletivamente para o slide de ensaio simplesmente estalar dois chips juntos. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagente. Slides de nitrocelulose revestido com uma capacidade de ligação do anticorpo relativamente grande têm sido usados como os slides de ensaio para absorver as gotas de líquido e, assim, facilitar a transferência de reagente, no entanto, os slides são mais caros que microarray e corrediças de vidro normal os scanners compatíveis com lâminas transparentes são necessários para a aquisição do sinal.

Neste trabalho, vamos demonstrar o protocolo da realização de um imunoensaio sanduíche multiplex com um chip de snap. Um aparelho de pressão romance foi desenvolvido para transferência de reagente mais conveniente e confiável de microarray-para-microarray. Importante, aqui nós temos estabelecido o método de transferência de reagente para lâminas de vidro normal com o chip de snap. 1024 pontos com êxito foram transferidos e alinhados numa lâmina de vidro, ampliando significativamente o uso desta tecnologia na maioria dos laboratórios.

Protocolo

1. fabricação e armazenamento de fichas de snap

1. método de transferência única ( Figura 1a)
   1. ponto táxi soluções contendo 400 µ g/mL anticorpos e glicerol 20% em tampão fosfato salino (PBS) para uma nitrocelulose (ou um vidro funcionalizado) slide de ensaio com um jato de tinta microarray spotter ¹³ em uma umidade relativa de 60% (1.2 nL para cada spot) com espaçamento de centro--800 µm. Certifique-se de que o slide é fixado sobre o convés do observador de acordo com um canto (aqui, foi usado o canto inferior esquerdo).
   2. Incubar o slide manchado ensaio à temperatura ambiente durante 1 h com uma humidade relativa de 60%.
   3. Pinça uma junta de módulo de slide com 16 compartimentos no slide do ensaio para dividi-lo em 16 poços. Enxágue o slide três vezes adicionando 80 µ l de PBS contendo 0,1% Tween-20 (PBST) em cada bem e tremendo a 450 rpm num agitador, 5 minutos de cada vez.
   4. Adicionar 80 µ l de bloqueio soluções para cada um bem e agitar durante 1 h a 450 rpm.
   5. Remover a junta e seque o slide de ensaio com um fluxo de nitrogênio.
   6. Consertar um slide de transferência do convés de observador e empurrar o canto inferior esquerdo do slide contra o canto inferior esquerdo do baralho observador. Jato de tinta manchar uma matriz de marcas de alinhamento (uma solução de microesferas de poliestireno) com o mesmo layout que para os táxis.
   7. Seque as marcas de alinhamento. O slide de transferência da aleta e colocá-lo de volta para o convés do observador, fixação contra o canto inferior esquerdo.
   8. Preparar o dAb manchando soluções contendo 20 µ g/mL anticorpos, 20% de glicerol e 1% de BSA.
   9. Usando o localizador ' s câmera, tire uma foto de uma marca de alinhamento. Implementar esta imagem no programa como um fiducial manchar e obter o sistema de reconhecimento de imagem dos auxiliares do inkjet para identificar a marca mais superior esquerda. Use seu coordenar como o primeiro ponto da matriz dAb. Ponto 8 nL por gota com um espaçamento de centro a centro de 800 µm.
2. Método de transferência dupla ( Figura 1b)
   1. colocar um slide de transferência 1 no convés de observador de jato de tinta contra o canto inferior esquerdo. Ponto de táxis soluções contendo 400 µ g/mL anticorpos, 20% de glicerol e 1% BSA em PBS a lâmina com um localizador de microarray de jato de tinta em uma umidade relativa de 60% (0.4 nL para cada local e ~ 200 µm de diâmetro). O espaçamento do centro-à-centro é 400 µm.
   2. Estalar o slide de ensaio de slide com uma nitrocelulose revestido (ou um vidro funcionalizado) transferência usando um aparelho de pressão ( Figura 2) para transferir as gotas de táxi para o slide de ensaio.
      1. Vez todos os seis botões no lado do aparelho de pressão em 90 graus para puxar e travar todos os êmbolos na posição aberta. Introduza o slide de transferência no suporte de slide em seu receptáculo com o canto cortado virado para o pino fixo pogo. Vire o primeiro conjunto de três botões para liberar os êmbolos com o pino de pogo ouro e certifique-se que os slides são empurrados contra os pinos de alinhamento.
      2. Inserir um slide de nitrocelulose revestido no snap aparelhos de ponta-cabeça sentado nos 4 pinos pogo. Virar o segundo conjunto de três botões para libertar êmbolos com o pino prateado e certifique-se que os slides são empurrados contra os pinos de alinhamento.
      3. Fechar o aparelho de pressão, colocando o revestimento superior no suporte do slide usando o alinhamento pilares e buracos para um posicionamento preciso.
      4. Inserir o aparelho de pressão fechado em sua gaiola e aperte a aba de fechamento completamente para trazer os microarrays face a face e aplicando a pressão adequada. Manter fechado por 1 min.
   3. Separar os slides. Incube o slide de ensaio à temperatura ambiente durante 1 h com uma humidade relativa de 60%. Lavar, bloquear e secar o slide de ensaio conforme descrito nas etapas 1.1.3 - 1.1.5.
   4. Coloque outro slide de transferência sobre o convés do observador de jato de tinta e empurre contra o canto inferior esquerdo. Soluções de ponto dAb contendo 50 ou 100 µ g/mL de anticorpos (ver tabela 1), 20% de glicerol e 1% de BSA em PBS. Certifique-se de que cada ponto é 0.8 nL e o centro--espaçamento entre pontos é de 400 µm.
   5. Armazenar o ensaio e o slide de transferência. Selo do ensaio e a transferência de slides em um saco hermético contendo dessecante e colocar no congelador-20 ° C.

2. Multiplexado imunoensaios com snap chips

1. recuperar o slide de ensaio do freezer. Deixar o saco selado por 30 min até que o slide vem à temperatura ambiente.
Série 7-ponto de
2. preparar diluído soluções de amostra por cravação proteínas em PBS contendo 0,05% Tween-20.
   Nota: Aqui, um factor de diluição de 5-fold é usado. As concentrações inicial para cada proteína estão listadas na tabela 1.
3. Preparar soluções de amostra conforme apropriado. Por exemplo, diluir o soro humano 4 vezes em tampão PBST.
4. Braçadeira uma junta 16-compartimento do slide ensaio.
5. Preencher uma coluna de 8 poços com as soluções de diluição de 7 proteína e uma solução-tampão PBST livre de proteína por pipetagem. Pipetar as soluções de amostra em outros 8 poços no mesmo slide.
   Nota: podem ser ajustar 80 soluções µ l em cada poço. Mais slides podem ser usados para medir amostras adicionais quando necessário.
6. Incubar as amostras num agitador a 450 rpm 1 h à temperatura ambiente ou para pernoite no 4 ° C. lavagem do slide 3 vezes com PBST no agitador a 450 rpm, 5 minutos de cada vez. Remova a gaxeta e seque o slide em um fluxo de gás nitrogênio.
7. Recuperar o slide de transferência com pinceladas do congelador. Manter o saco selado por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, incubar o slide em uma câmara fechada (por exemplo, caixa de dicas vazio) contendo grânulos de estabilização de umidade de 60% por 20 min para reidratação.
8. Estalar o slide de transferência com o slide de ensaio usando um aparelho de pressão ( Figura 2) para transferir as gotas de bagatela. Ver secção 1.2.2 para a operação do aparato snap.
9. Separar os slides. Incubar o slide de ensaio em uma câmara fechada contendo grânulos de estabilização de umidade de 60% para h. 1 braçadeira do slide de ensaio com uma junta de 16-compartimento e enxaguar o slide 4 vezes usando PBST num agitador a 450 rpm, 5 minutos de cada vez.
10. Pipeta 80 µ l de soluções contendo 2,5 µ g/mL streptavidin fluoróforo na PBS em cada poço. Incubar durante 20 min em uma coqueteleira a 450 rpm.
11. Enxaguar o slide 3 vezes com PBST e uma vez com água destilada no agitador a 450 rpm. Remova a gaxeta e seque o slide usando gás nitrogênio.

3. Deslize a verificação e análise de dados

1. digitalizar o slide de ensaio com um scanner de microarray de fluorescência usando o laser de 635 nm.
2. Extrair a intensidade líquida de cada ponto, usando uma análise de software (por exemplo, o analisador de matriz-pro) ¹⁶.
3. Calcular o limite de detecção (LOD) de cada proteína usando um software de estatísticas e determinar as concentrações de proteína em amostras de.
   Nota: O LOD é definida como a intercepção de Y da norma cuEva, incrementada por três vezes o desvio padrão de três ensaios independentes.

Resultados

O procedimento de ensaio para single e double métodos de transferência é mostrado na Figura 1. Na única transferência, os táxis são vistos diretamente no slide do ensaio e as pinceladas são transferidas para o slide de ensaio mediante a utilização de um padrão de espelho dos táxis (Figura 1a). Procedimento de transferência apenas uma é necessário, mas este método sofre de desalinhamento entre os dois microarrays, ...

Discussão

Neste trabalho, apresentamos uma tecnologia de chip de pressão que faz com que o livre de cross-reactivity multiplex imunoensaios amplamente disponíveis para os pesquisadores com configuração básica experimental. Diferente da existente Microarrays do anticorpo, nenhum observador microarray é necessária para os usuários finais. Tanto single e double métodos de transferência são demonstrados e transferência dupla oferece precisão de alinhamento superior para ~ 40 μm para manchas de 98%, com o maior desalinham...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline tablet	Fisher Scientific	5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5	Rockland	s000-06
Tween-20	Sigma-Aldrich	p1379
Bovine serum albumin	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	001-000-162
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer	SurModics, Inc	SG02
Nitrocellulose coated slides	Grace Bio-Laboratories, Inc	305116
Aminosilane coated slides	Schott North America	1064875
Snap Device	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
Inkjet microarray spotter	GeSiM	Nanoplotter 2.0
Slide module gasket	Grace Bio-Laboratories, Inc	204862
Humidity Stabilization Beads	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software	Media Cybernetics	Version 4.5
Fluorescence microarray scanner	Agilent	SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software	GraphPad Software	GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody	R&D Systems	MAB10972
Endoglin protein	R&D Systems	1097-EN
Endoglin detection antibody	R&D Systems	BAF1097
IL-6a (see Table 1)	R&D Systems
IL-6b (see Table 1)	Invitrogen