JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Özet

Çoğaltılmış protein analizi üstün tanılama hassasiyet ve doğruluk için tek proteinler karşılaştırıldığında göstermiştir. Antikor microarrays aynı anda tek bir yonga üzerinde gerçekleştirilen mikro ölçekli uzun binlerce sağlar. Sandviç tahlil biçimi her hedef iki antikorlar ile tespit ederek tahlil özgüllük artırır, ancak böylece çoğullama yeteneklerini sınırlayan reaktifler arasında olan muzdarip. Antikor colocalization Mikroarray (ACM) çoğaltılmış protein çapraz-reactivity ücretsiz algılama için geliştirilmiştir, ancak pahalı bir gözcü yerinde Mikroarray imalat deneyleri sırasında için gerektirir. Bu çalışmada, biz sadece dayama iki fiş birlikte, böylece hiçbir gözcü örnek kuluçka ve algılama antikor (dAbs) sonraki uygulama sırasında gerekli tarafından Mikroarray Mikroarray reaktif aktarır bir ek çip teknolojisi göstermek depolama öncesi benekli slayt, slayt hazırlama tahlil yürütme dissociating. Her iki tek ve Çift Kişilik transfer yöntemleri iki microarrays arasında doğru uyum elde etmek için sunulmaktadır ve slayt imalat yöntemleri açıklanmıştır. Sonuçları gösteriyor ki < 40 mikron hizalama 625 noktalar/cm2bir dizi yoğunluğu ulaşan Çift Kişilik transferi ile elde. 50-plexed immunoassay çoğaltılmış protein analizi ek yongasında kullanılabilirlik göstermek için yapılmıştır. Sınırlar 35 proteinlerin algılama aralığı pg/mL vardır.

Giriş

Birden fazla protein oluşan biyolojik bir panel daha yüksek duyarlılık ve özgüllük kanserleri1,2gibi karmaşık hastalıkların tanısında tek bir biyomarker daha sağlayabilir. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) klinik laboratuvarlar bir limit düşük pg/mL plazma, algılama, ama sınırları tahlil3,4,5başına bir hedefe ulaşmada kullanılan altın standart teknoloji olmuştur. Paralel bir tek mikroskop slayt6,7,8bin-in küçültülmüş deneyleri accomodating yürütülen için antikor microarrays geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemin çoğullama yeteneği parmak izleri, karışımı uygulamadan kaynaklanan reaktif tahrik olan ile sınırlıdır ve hedefleri9,10 giderek artan sayıda daha sorunlu hale gelir , 11. Pla ve ark. Sonuçta ortaya çıkan güvenlik açığı bir multiplex sandviç testin hedefleri12numarası N olan 4N(N-1) ölçekler belirttiler.

Antikor microarrays, antikor colocalization Mikroarray olan etkisini azaltmak için (ACM) bizim laboratuvar multiplex sandviç tahlil12için geliştirilmiştir. Yakalama antikorlar (taksi) bir substrat Mikroarray gözcü ile tespit. Sonra engelleme örnekleri yüzeye uygulanır ve sonunda bireysel dAbs taksi-antijen kompleksi aynı noktalar üzerinde gördü. Antikorlar antijenleri arasındaki tüm olan senaryoları ACM ile azaltılabilir ve algılama pg/mL, sınırlarını elde ettik. Ancak, tahlil Protokolü hazırlama ve bir yerinde Mikroarray gözcü yüksek hassasiyetle pahalı ve zaman alıcı hizalama amaç için kullanarak, bu teknoloji içinde geniş uygulama sınırlama deneyler sırasında parmak izleri tespit gerekir diğer laboratuvarlar. Ek çip adında bir el ACM için çapraz-reactivity ücretsiz geliştirilmiştir ve gözcü-Alerjik multiplex sandviç uzun13,14,15. Kabinler ve parmak izleri bir tahlil slayt ve sırasıyla Mikroarray biçiminde bir transfer slayt üzerine önceden tespit ve depolanır. Tahlil sırasında slaytlar alınır ve dAbs Mikroarray aktarılır topluca tahlil slayt sadece birlikte iki fiş şaklatarak. Bir ek aparatı güvenilir reaktif aktarımı için kullanılır. Nispeten büyük antikor Bağlama kapasitesi ile kaplı nitroselüloz slaytlar sıvı damlacıkları emmek için tahlil slaytlar olarak kullanılmış ve böylece reaktif transfer kolaylaştırıcı, ancak, slaytları normal cam slaytlar ve Mikroarray daha daha pahalıdır saydam olmayan slaytlar ile uyumlu tarayıcılar sinyal alımı için ihtiyaç vardır.

Bu çalışmada, multiplex sandviç immunoassay ek çip ile gerçekleştirme Protokolü göstermektedir. Bir roman ek aparatı Mikroarray Mikroarray daha rahat ve güvenilir reaktif transferi için geliştirilmiştir. Önemlisi, burada reaktif aktarma yöntemi ek çip ile normal cam slaytlar üzerine kurduk. 1024 noktalar başarıyla transfer ve bu teknolojinin en laboratuarlarında kullanımı önemli ölçüde genişleyen bir cam slayt üzerine hizalanmalıdır.

Protokol

1. imalat ve depolanmasını snap cips

  1. tek transfer yöntemi ( Şekil 1a)
    1. 400 µg/mL antikorlar içeren Spot taksi çözümleri ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi % 20 gliserol (PBS) bir nitroselüloz (ya da functionalized bir cam) üzerine tahlil slayt ile bağıl nem oranı % 60, bir mürekkep püskürtmeli Mikroarray gözcü 13 (1.2 nL her nokta için) 800 µm Merkezden merkeze boşluğu ile. Slaydı bir köşe göre gözcü güvertede sabit olduğundan emin olun (burada, sol alt köşedeki kullanılmıştır).
    2. %60 bağıl nem ile 1 h için oda sıcaklığında benekli tahlil slayt kuluçkaya.
    3. Bir slayt modülü conta 16 kuyu bölmek için tahlil slayt üzerinde 16 bölmeleri ile kelepçe. 80 µL % 0,1 içeren PBS ekleyerek üç kez sürgüyü durulama ara-20 (PBST) her iyi ve titreyen bir shaker, 5 min her zaman üzerinde 450 rpm'de.
    4. Her şey ve 450 rpm'de 1 h için sallamak için çözümler engelleme eklemek 80 µL.
    5. Conta kaldırmak ve tahlil slaydı bir akımı azot ile kuru.
    6. Bir transfer slayt gözcü güvertede düzeltmek ve slayt sol alt köşesinde gözcü güverte karşı sol alt köşesinde itin. Mürekkep püskürtmeli spot hizalama işaretlerini (polistiren mikro-boncuk bir çözüm) oluşan bir dizi ile bu aynı düzeninde kabinler için.
    7. Kuru hizalama işaretlerini izin. Transfer slayt flip ve belgili tanımlık dip sol köşe karşı sabitleme gözcü güverte üzerine oturtacak.
    8. 20 µg/mL antikorlar, % 20 gliserol ve % 1 BSA içeren çözümler lekelenme dAb hazırlayın.
    9. Gözcü kullanarak ' s kamera, resim hizalama işareti bir. Bu resmi bir indirgeme olarak edindiği programa uygulamak ve görüntü tanıma sisteminin en üst sol işareti tanımlamak için mürekkep püskürtmeli gözcü olsun. Onun koordinat dAb dizi ilk spot kullanın. Nokta 8 nL damlacık ile 800 µm Merkezden merkeze aralığını başına.
  2. Çift Kişilik aktarma yöntemi ( Şekil 1b)
    1. sol alt köşedeki karşı mürekkep püskürtmeli gözcü güvertede bir transfer Slayt 1 yerleştirin. Spot 400 µg/mL antikorlar, % 20 gliserol ve PBS % 1 BSA ile bir mürekkep püskürtmeli Mikroarray gözcü bağıl nem oranı % 60, slayda içeren kabinler Çözümleri (0,4 nL her nokta için ve ~ çapı 200 µm). Merkezden merkeze boşluk 400 µm olabilir.
    2. Taksi damlacıkları tahlil slayt üzerine aktarmak için bir ek aparatı ( Şekil 2) kullanarak transfer slayt ile kaplı bir nitroselüloz (ya da functionalized bir cam) tahlil slayt çekin.
      1. Dönüş tüm altı düğmeleri tarafında ek aparat çekin ve tüm itici açık konumda kilitlemek için 90 derece. Transfer Slayt Slayt tutucu, kabın içinde kırpılmış köşesi sabit pogo PIN bakacak ekleyin. Üç düğme itici altın pogo iğne ile serbest bırakmak ve slaytları hizalama pimleri karşı itti emin olmak için ilk kümesi açmak.
      2. Ek aparat ters 4 pogo çivi üzerine oturan nitroselüloz kaplı bir slayt ekleyin. İtici gümüş iğne ile serbest bırakmak ve slaytları hizalama pimleri karşı itti emin olmak için üç düğme ikinci kümesi açmak.
      3. Ek aparat hizalama sütunlar ve delik bir hassas konumlandırma için kullanarak slayt kutusunda üst kabuk koyarak kapatın.
      4. Kapalı ek aparat onun kafes yerleştirin ve kapatma sekmesinde tamamen microarrays uygun basınç uygularken yüz yüze getirmek için aşağı doğru itin. 1 dk. için kapalı tutmak
    3. Slaytları ayırın. Bağıl nem oranı % 60 ile 1 h için oda sıcaklığında tahlil slayt kuluçkaya. Yıkama, engellemek ve tahlil slayt adımlarda 1.1.3 - 1.1.5 açıklandığı gibi kuru.
    4. Başka bir transfer slayt mürekkep püskürtmeli gözcü güverte ve sol alt köşedeki karşı itme üzerine koyun. 50 ya da 100 µg/mL (bkz. Tablo 1) antikorları, % 20 gliserol ve PBS % 1 BSA içeren spot dAb çözümleri. Her spot 0,8 olduğundan emin nL ve noktalar arasındaki Merkezden merkeze boşluğu olduğunu 400 µm.
    5. Tahlil ve transfer slayt saklayın. Mühür nem içeren hava geçirmez bir torbada tahlil ve transfer slaytlar ve -20 ° C dondurucuya koydu.

2. Multiplexed ek fiş ile uzun

  1. Al dondurucu tahlil slayttan. Çantayı slayt oda sıcaklığına gelene için 30 dk kapalı bırakın.
  2. Hazırla 7 uçlu seri seyreltilmiş örnek çözümler proteinlerin % 0.05 içeren PBS spiking tarafından ara-20.
    Not: Burada, bir 5-fold seyreltme faktörü kullanılır. Başlangıç konsantrasyonları her protein için tablo 1'de listelenen.
  3. Uygun olarak Prepare örnek çözümler. Örneğin, 4 kez içinde PBST tampon insan serumu sulandırmak.
  4. 16-bölme conta tahlil slayt üzerinde kelepçe.
  5. Pipetting tarafından bir sütunun 8 wells 7 protein seyreltme çözümleri ve protein-Alerjik PBST arabellek çözüm ile doldurun. Aynı slaytta yer alan diğer 8 Wells örnek çözümler pipette.
    Not: 80 µL çözümler her birinde uygun olabilir iyi. Daha fazla slayt ek örnekler gerektiğinde ölçmek için kullanılabilir.
  6. Örnekleri bir shaker gecede üç kez ile shaker 450 rpm'de 5 dk her zaman üzerinde PBST 4 ° c yıkama slayt veya oda sıcaklığında 1 h için 450 devirde üzerinde kuluçkaya. Conta kaldırmak ve azot gazı akışı altında slayt kuru.
  7. Parmak izleri ile transfer slayt dondurucudan almak. Çantayı, oda sıcaklığında 30 dakika kapalı tutun. Ardından, % 60 nem sabitleme boncuk rehidrasyon için 20 dk için içeren slayt kapalı Odası (örneğin boş ipuçları kutu) içinde kuluçkaya.
  8. Transfer slayt dAb damlacıkları aktarmak için bir ek aparatı ( Şekil 2) kullanarak tahlil slayt ile snap. 1.2.2 ek aparat çalışması için bkz.
  9. Slaytları ayırın. Tahlil slayt % 60 nem sabitleme boncuk 1 h. kelepçe bir 16 yuvası conta ile tahlil slayt içeren bir kapalı odasında kuluçkaya ve 4 kez sürgüyü durulama PBST bir shaker 450 rpm'de 5 dk her zaman kullanma.
  10. Pipet 80 µL PBS içinde her kuyuya 2,5 µg/mL streptavidin fluorophore içeren çözümler. Bir shaker 450 devirde üzerinde 20 dk için kuluçkaya.
  11. 450 devirde shaker üzerinde slayt 3 kez ile PBST ve bir kez distile su ile durulayın. Conta kaldırmak ve azot gazı kullanarak slayt kuru.

3. Slayt tarama ve veri analizi

  1. 635 nm lazer kullanarak Floresans Mikroarray tarayıcıyla tahlil slayt tarama.
  2. Bir analiz yazılımı (örneğin dizi-pro Çözümleyicisi) 16 kullanarak her nokta net yoğunluğunu ayıklamak.
  3. Bir istatistik yazılım kullanarak her protein algılama (lod olarak) sınırını hesaplamak ve protein konsantrasyonları örneklerde belirlemek.
    Not: Y-kesişim noktası standart cu LOD tanımlanırüç kez standart sapmasını tarafından üç bağımsız deneyleri için artan lezzetli.

Sonuçlar

Hem tek hem de çift transfer yöntemleri için tahlil yordamı şekil 1' de gösterilen. Tek transfer, kabinler doğrudan tahlil slaytta lekeli ve dAbs kabinler (Şekil 1a) bir ayna model kullanımda üzerine tahlil slayda aktarılır. Tek bir aktarım yordam gereklidir, ancak esas olarak slaytla mürekkep püskürtmeli makas köprüsü (Şekil 2) arasındaki açısal kayma nedeniyle iki microarrays...

Tartışmalar

Bu çalışmada, araştırmacılar ile temel deneysel kurulum için çapraz-reactivity ücretsiz multiplex uzun yaygın olarak kullanılabilir duruma getirir bir ek çip teknolojisi sunulmuştur. Varolan antikor microarrays farklı, hiçbir Mikroarray gözcü son kullanıcılar için gereklidir. Hem tek hem de çift transfer yöntemleri gösterdi ve Çift Kişilik transfer affords üstün hizalama doğruluğu aşağı ~ % 98'i lekeli 63 µm14en büyük kayma için 40 mikron. Bir roman ek aparatı ...

Açıklamalar

McGill Üniversitesi bir patent başvurusu bu iş Huiyan Li ve David Juncker ile bazı yönleri üzerinde mucitler şikayetçi oldu.

Teşekkürler

Biz Dr Rob Sladek mürekkep püskürtmeli gözcü kullanım için teşekkür ederim. Sağlık Araştırma (CIHR), Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC), Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü ve Kanada Vakfı için son destek için yenilik (CFI) Kanadalı Enstitüleri üzerinden anıyoruz. DJ teşekkürler bir Kanada araştırma sandalyeden destekler.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline tabletFisher Scientific5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5Rocklands000-06
Tween-20Sigma-Aldrichp1379
Bovine serum albuminJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc001-000-162
GlycerolSigma-AldrichG5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray StabilizerSurModics, IncSG02
Nitrocellulose coated slidesGrace Bio-Laboratories, Inc305116
Aminosilane coated slidesSchott North America1064875
Snap DeviceParallex BioAssays Inc.PBA-SD01
Inkjet microarray spotterGeSiMNanoplotter 2.0
Slide module gasketGrace Bio-Laboratories, Inc204862
Humidity Stabilization BeadsParallex BioAssays Inc.PBA-HU60
Array-Pro Analyzer softwareMedia CyberneticsVersion 4.5
Fluorescence microarray scannerAgilentSureScan Microarray Scanner
Biostatistics softwareGraphPad SoftwareGraphPad Prism 6
Endoglin capture antibodyR&D SystemsMAB10972
Endoglin proteinR&D Systems1097-EN
Endoglin detection antibodyR&D SystemsBAF1097
IL-6a (see Table 1)R&D Systems
IL-6b (see Table 1)Invitrogen

Referanslar

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

MultiplexedBiyom hendisliksay 129sandvi uzunantikorapraz reactivity cretsizG zc cretsizsnap ip

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır