הצמד הצ'יפ בשביל כריך מרובבת Cross-reactivity חופשי ונטול שהמשגיח Immunoassays

Summary

נדגים טכנולוגיה שבב snap לביצוע כריך מרובבת cross-reactivity ללא immunoassays על ידי הצמדת פשוט שתי שקופיות. מנגנון הצמדה משמש באופן אמין מבנק ריאגנטים microarray-כדי-microarray. השבב הצמד יכול לשמש עבור כל התגובות הביוכימי הדורש colocalization של ריאגנטים שונים ללא זיהום צולב.

Abstract

אנליזת חלבונים מרובבת הראו סופריור אבחון רגישות ודיוק לעומת חלבונים יחיד. מיקרו-מערכים נוגדן לאפשר לאלפי immunoassays מיקרו-סולם מבוצעים בו-זמנית על שבב יחיד. כריך assay תבנית משפר assay ירידה לפרטים על ידי גילוי לכל מטרה עם שני נוגדנים, אבל סובל אשיג בין ריאגנטים ובכך יגביל את יכולות multiplexing שלהם. נוגדן colocalization microarray (ACM) פותחה לגילוי חלבון מרובבת cross-reactivity חינם, אך דורש של צופה יקר באתר עבור ייצור microarray במהלך מבחני. בעבודה זאת, נדגים טכנולוגיה שבב snap מעבירה ריאגנט מ microarray-כדי-microarray מאת פשוט ההצמדה יחד, שולכן אין שהמשגיח יש צורך בתקופת הדגירה מדגם, יישום עוקבות של זיהוי נוגדנים (דבס) על שני צ'יפס אחסון של שקופיות קדם הבחינו, בריא הכנת שקופית מהוצאה להורג וזמינותו. שתי שיטות ההעברה ליחיד מוצגים כדי להשיג יישור מדויק בין מיקרו-מערכים שני ומתוארות הזיוף שקופיות עבור שתי שיטות. התוצאות מראות כי < 40 μm יישור הושגה עם העברה כפולה, להגיע עם צפיפות מערך של כתמים/cm 625². ראגנטים 50-plexed נערכה כדי להדגים את השימושיות של השבב snap בניתוח מרובבת חלבון. הגבולות של זיהוי של חלבונים 35 נמצאות בטווח של pg/mL.

Introduction

פאנל של סמנים ביולוגיים הכוללת חלבונים מרובים עשויים לספק רגישות וספציפיות גבוהה יותר מאשר סמן בודד באבחון של מחלות מורכבות כגון סרטן^1,2. וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) כבר הטכנולוגיה תקן זהב בשימוש במעבדות קליניות בהשגת גבול של זיהוי-pg/mL נמוכה בפלסמה, אבל לתחום יעד אחד לכל assay^3,4,5. מיקרו-מערכים נוגדן פותחו עבור אדיב אלפי מבחני ולמחקר שנערך במקביל^7,86,שקופיות מיקרוסקופ יחיד. עם זאת, היכולת multiplexing של שיטה זו הוא מוגבל על ידי מונחה ריאגנט אשיג, הנובע היישום של תערובת של דבס, הוא הופך להיות יותר בעייתי עם מספר גדל והולך של מטרות^{9,10 , 11}. פלה ואח. הצהירו כי פגיעות וכתוצאה מכך assay כריך מולטיפלקס מושפעת 4N(N-1) כאשר N הוא מספר מטרות¹².

כדי להמתיק אשיג ב נוגדן מיקרו-מערכים, נוגדן colocalization microarray (ACM) פותחה במעבדה שלנו כריך מולטיפלקס assay¹². לכידת נוגדנים (מוניות) הם הבחינו על מצע עם תצפיתן microarray. לאחר חסימת דגימות מוחלים על פני השטח, ואז ודבס בודדים הם הבחינו על המקומות זהה עם קומפלקס אנטיגן המונית. אפשרות לפתור כל התרחישים אשיג בין נוגדנים אנטיגנים עם ACM, מגבלות של זיהוי-pg/mL הושגו. עם זאת, פרוטוקול assay דורש הכנה של הבחינה של דבס במהלך הניסויים באמצעות שהמשגיח microarray באתר עם דיוק גבוהה לצורך היישור, וזה זמן רב ויקר, הגבלת יישום נרחב של טכנולוגיה זו ב- מעבדות אחרות. ACM כף-יד, בשם צ'יפ snap פותחה עבור cross-reactivity חינם, ללא שהמשגיח מגה-פלקס כריך immunoassays^13,14,15. מוניות, דבס נצפה מראש על גבי של assay ושקופית העברה בהתאמה בתבנית microarray, מאוחסנים. במהלך וזמינותו, השקופיות מאוחזרות, microarray של דבס מועברים באופן קולקטיבי על גבי השקופית assay מאת פשוט מצלם את האסימונים שני ביחד. מנגנון הצמדה משמש להעברת ריאגנט אמין. ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות עם קיבולת איגוד נוגדן גדולה יחסית שימשו כמו assay השקופיות כדי לספוג את טיפות נוזל, ובכך להקל על העברת ריאגנט, עם זאת, השקופיות יקרים יותר שקופיות זכוכית רגילה, microarray סורקים תואם עם מגלשות שאינם שקופים נדרשים עבור רכישת אות.

בעבודה זאת, נדגים את הפרוטוקול של ביצוע של ראגנטים מולטיפלקס כריך עם שבב snap. מנגנון הצמדה הרומן פותחה עבור העברת ריאגנט יותר נוח ואמין microarray-כדי-microarray. חשוב לציין, כאן הקמנו שיטת ההעברה מגיב על גבי זכוכית רגילה שקופיות עם השבב snap. 1024 כתמים בהצלחה להעביר, מיושרים על זכוכית, הרחבה משמעותית את השימוש בטכנולוגיה זו במעבדות רוב.

Protocol

1. ייצור ואחסון של הצמד שבבי

בשיטת העברה יחיד

1. ( איור 1 א')
   1. ספוט פתרונות cAb המכיל נוגדנים µg/mL 400 ו- 20% גליצרול בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על גבי ניטרוצלולוזה (או כוס functionalized) assay שקופית עם הזרקת דיו microarray שהמשגיח ¹³ ב לחות יחסית של 60% (1.2 nL בכל מקום) עם 800 ריווח מרכז למרכז מיקרומטר. ודא השקופית קבוע על סיפון צפייה על פי בפינה אחת (כאן, בפינה השמאלית התחתונה שימשה).
   2. דגירה השקופית assay הבחין בטמפרטורת החדר במשך 1 h עם לחות יחסית של 60%.
   3. תהדק את אטם מודול שקופיות עם 16 תאים בשקופית assay לחלק זה 16 בארות. לשטוף את השקופית שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 80 ל- PBS המכיל 0.1% Tween-20 (PBST) לתוך כל טוב, ומטלטל ב rpm 450 על מטרף, 5 דקות בכל פעם.
   4. 80 להוסיף µL של חסימת פתרונות אחד טוב וללחוץ על 1 h 450 סל ד.
   5. להסיר את האטם ויבשה השקופית assay עם זרם של חנקן.
   6. לתקן את שקופית העברה על סיפון שהמשגיח ודחף הפינה השמאלית התחתונה של השקופית נגד בפינה השמאלית התחתונה של סיפון צפייה. הזרקת דיו ספוט מערך של סימני יישור (פתרון של מיקרו-חרוזי פוליסטירן) באותה פריסה עד כדי כך על המוניות.
   7. לתת את סימני יישור יבש. הפוך את השקופית העברה ותחזיר אותו בחזרה לתוך הסיפון שהמשגיח, תיקון נגד בפינה השמאלית התחתונה.
   8. להכין את dAb איתור פתרונות המכיל נוגדנים µg/mL 20, 20% גליצרול ו 1% BSA.
   9. באמצעות את המאתר ' מצלמה s, תצלם תמונה סימן יישור. ליישם את התמונה לתוך התוכנית spotting כמו fiducial, את מערכת זיהוי תמונה של המאתר הזרקת דיו כדי לזהות את הסימן השמאלי העליון ביותר. להשתמש את הקואורדינטות הנקודה הראשונה של המערך dAb. מקום 8 nL לכל droplet עם מרווח מרכז למרכז של מיקרומטר 800-
2. בשיטת העברה כפול ( איור 1b)
   1. מקום העברה שקופית 1 על סיפון שהמשגיח הזרקת דיו נגד בפינה השמאלית התחתונה. לזהות פתרונות מוניות המכיל 400 נוגדנים µg/mL גליצרול 20%, 1% BSA ב- PBS אותן לשקופית עם וחברתה microarray הזרקת דיו הלחות היחסית של 60% (0.4 nL בכל מקום ו ~ 200 מיקרומטר בקוטר). המרווח מרכז למרכז הוא 400 מיקרומטר.
   2. הצמד העברת שקופיות ניטרוצלולוזה מצופה (או כוס functionalized) assay השקופית באמצעות מנגנון הצמדה ( איור 2) להעביר את טיפות המונית על גבי השקופית וזמינותו.
      1. להפוך כל שישה כפתורים בצד של מנגנון הצמדה ב- 90 מעלות כדי למשוך. ותנעלי את כל בוכנות במצב פתוח. הכנס את השקופית העברה מחזיק שקופיות בהקיבול עם הפינה החתוכים מול ה-pin פוגו קבוע. להפוך את הסט הראשון של שלושה לחצנים כדי לשחרר את בוכנות עם הפין פוגו הזהב ולוודא השקופיות יידחפו נגד הפינים יישור.
      2. להוסיף שקופית בציפוי ניטרוצלולוזה snap המנגנון יושבת הפוך על הפינים פוגו 4. להפוך את הסט השני של שלושה לחצנים לשחרר בוכנות עם הפין כסף. ולוודא השקופיות יידחפו נגד הפינים יישור.
      3. לסגור את המנגנון snap על-ידי הצבת את הקליפה העליונה את המחזיק שקופיות באמצעות יישור עמודי חורים לצורך מיקום מדויק.
      4. להכניס את המנגנון snap סגור בכלוב, לדחוף את הכרטיסיה הסגר לגמרי למטה להביא את פנים אל פנים תוך יישום הלחץ המתאים מיקרו-מערכים. לשמור סגור עבור מינימלית 1
   3. להפריד את השקופיות. דגירה השקופית assay בטמפרטורת החדר במשך 1 h עם לחות יחסית של 60%. רוחצים, לחסום, ומייבשים את השקופית assay כמתואר בצעדים 1.1.3 - 1.1.5.
   4. במקום אחר העברת שקופיות על הזרקת דיו שהמשגיח ותתרחק לדחוף בפינה השמאלית התחתונה. פתרונות dAb ספוט המכיל µg 50 או 100/mL של נוגדנים (ראה טבלה 1), 20% גליצרול BSA 1% ב- PBS. להבטיח כי כל נקודה היא 0.8 nL מרכז למרכז המרווח בין נקודות הוא 400 מיקרומטר.
   5. לאחסן וזמינותו של השקופית העברה. חותם השקופיות assay וגם העברת תיק אטום המכיל סופג לחות ושם במקפיא-20 ° C.

2. מרובב immunoassays עם צ'יפס הצמד

1. אחזר השקופית assay מהמקפיא. תשאיר את התיק סגור במשך 30 דקות עד השקופית מגיע לטמפרטורת החדר.
2. להכין 7 נקודות סדרתי מדולל פתרונות לדוגמה על ידי spiking חלבונים ב- PBS המכילה 0.05% Tween-20-
   הערה: כאן, גורם לדילול 5-fold משמש. הריכוזים ההתחלה עבור כל חלבון המפורטים בטבלה 1-
3. הכן פתרונות לדוגמה לפי הצורך. לדוגמה, לדלל בנסיוב אדם 4 פעמים במאגר PBST.
4. תהדק את אטם 16-תא בשקופית assay.
5. למלא טור אחד של בארות 8 עם הפתרונות דילול 7 חלבונים ופתרון ללא חלבון מאגר PBST על ידי pipetting. Pipette הפתרונות מדגם בבארות 8 אחרות בשקופית אותו.
   הערה: פתרונות µL 80 יכול להתאים בכל טוב. עוד שקופיות יכול לשמש כדי למדוד דוגמאות נוספות בעת הצורך.
6. דגירה בדגימות על מטרף-סל ד 450 לשעה בטמפרטורת החדר או נלון בשטיפת מעלות צלזיוס 4 השקופית שלוש פעמים עם PBST על ניעור ב 450 סל ד, 5 דקות בכל פעם. הסר את האטם ויבשה השקופית תחת זרם של גז חנקן.
7. לאחזר את השקופית העברה עם ודבס מהמקפיא. לשמור על התיק סגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגירה השקופית בתוך תא סגור (למשל תיבת טיפים ריק) המכיל 60% לחות מייצב חרוזים במשך 20 דקות על התייבשות.
8. להצמיד את השקופית ההעברה הכוללת השקופית assay באמצעות מנגנון הצמדה ( איור 2) להעביר את טיפות dAb. עיין בסעיף 1.2.2 עבור הפעולה של המנגנון snap-
9. נפרדים בשקופיות. דגירה השקופית assay בתוך תא סגור המכיל 60% לחות מייצב חרוזי ח' 1 קלאמפ השקופית assay עם אטם 16-תא ולשטוף את השקופית 4 פעמים באמצעות PBST על מטרף-450 סל ד, 5 דקות בכל פעם.
10. פיפטה 80 µL של פתרונות המכילה 2.5 µg/mL streptavidin fluorophore ב- PBS כל טוב. תקופת דגירה של 20 דקות על מטרף-450 סל ד.
11. יש לשטוף את השקופית 3 פעמים עם PBST ופעם אחת עם מים מזוקקים על ניעור ב 450 סל ד. הסר את האטם, לייבש את השקופית באמצעות גז חנקן.

3. שקופית סריקה וניתוח נתונים

1. סרוק השקופית assay עם סורק microarray פלורסצנטיות באמצעות הלייזר 635 nm.
2. לחלץ את עוצמת נטו בכל מקום באמצעות תוכנה (למשל מנתח מערך-pro) ניתוח ¹⁶.
3. לחשב את הגבול של זיהוי (לוד) של כל חלבון באמצעות תוכנת סטטיסטיקה ולקבוע את ריכוז חלבון הדגימות.
   הערה: לוד מוגדר החיתוך-Y של תקן cuשיחרר גז שמונה לפי שלוש פעמים סטיית תקן של שלושה מבחני עצמאי.

תוצאות

ההליך assay עבור יחיד והן בשיטות העברת כפול מוצג באיור1. העברה יחיד, המוניות הם הבחינו ישירות על השקופית assay, דבס מועברים על גבי השקופית assay על השימוש בתבנית מראה בנהגי המוניות (איור 1 א'). נדרש הליך העברה אחת בלבד, אך שיטה זו סובלת אי-התאמות בין ש...

Discussion

בעבודה זאת, הובאו טכנולוגיה שבב הצמד שעושה את immunoassays cross-reactivity ללא מולטיפלקס הנפוצה של החוקרים עם הגדרת הניסוי הבסיסי. שונה קיים נוגדן מיקרו-מערכים, שהמשגיח microarray אין צורך עבור משתמשי קצה. יחיד והן בשיטות העברת כפול מודגמות, ומאפשרת העברה כפולה דיוק מעולה יישור למטה כדי ~ μm 40 נקודות 98%, עם אי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline tablet	Fisher Scientific	5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5	Rockland	s000-06
Tween-20	Sigma-Aldrich	p1379
Bovine serum albumin	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	001-000-162
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer	SurModics, Inc	SG02
Nitrocellulose coated slides	Grace Bio-Laboratories, Inc	305116
Aminosilane coated slides	Schott North America	1064875
Snap Device	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
Inkjet microarray spotter	GeSiM	Nanoplotter 2.0
Slide module gasket	Grace Bio-Laboratories, Inc	204862
Humidity Stabilization Beads	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software	Media Cybernetics	Version 4.5
Fluorescence microarray scanner	Agilent	SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software	GraphPad Software	GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody	R&D Systems	MAB10972
Endoglin protein	R&D Systems	1097-EN
Endoglin detection antibody	R&D Systems	BAF1097
IL-6a (see Table 1)	R&D Systems
IL-6b (see Table 1)	Invitrogen