Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Resumen

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Resumen

Análisis de la proteína multiplexada ha demostrado una sensibilidad diagnóstica superior y precisión frente a las proteínas solo. Microarrays de anticuerpos permiten miles de micro escala inmunoensayos realizados simultáneamente en un solo chip. Formato de ensayo sándwich mejora la especificidad del ensayo mediante la detección de cada destino con dos anticuerpos, pero sufre de reactividad cruzada entre reactivos lo que limita su capacidad de multiplexación. Microarray de colocalización de anticuerpo (ACM) ha sido desarrollado para la detección de proteína multiplexados Cruz-reactivity-free, pero requiere un costoso observador in situ para la fabricación de microarrays durante los ensayos. En este trabajo, demostramos una tecnología de chip de snap que transfiere reactivo de microarrays para microarrays por simplemente encaja a presión juntos, que así no observador es necesario durante la incubación de la muestra y posterior aplicación de anticuerpos de detección (dAbs) con dos fichas almacenamiento de portaobjetos previamente manchados, disociando la preparación de los portaobjetos de la ejecución del ensayo. Ambos métodos de transferencia individuales y dobles se presentan para lograr la alineación exacta entre los dos microarrays y la fabricación de la diapositiva para ambos métodos se describen. Resultados muestran que < 40 μm alineación se ha conseguido con la doble transferencia, alcanzando una densidad de matriz de 625 puntos/cm². Un inmunoanálisis de 50 plexed se ha realizado para demostrar la utilidad de la viruta del complemento en el análisis de la proteína multiplexados. Límites de detección de proteínas de 35 están en la gama de pg/mL.

Introducción

Puede proporcionar un panel de biomarcadores que comprende múltiples proteínas de más alta sensibilidad y especificidad que un único biomarcador en el diagnóstico de enfermedades complejas como cáncer^1,2. El análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) ha sido la tecnología estándar utilizada en laboratorios clínicos alcanzar un límite de detección bajo pg/ml en plasma, sino límites a un destino por ensayo^3,4,5. Microarrays de anticuerpos se han desarrollado para albergar miles de ensayos miniaturizados llevó a cabo en paralelo en un solo microscopio diapositiva^6,7,8. Sin embargo, la capacidad de multiplexación de este método es limitada por reactividad cruzada basada en el reactivo, que surjan de la aplicación de una mezcla de lenguados, y llega a ser más problemático con un número creciente de objetivos^{9,10 , 11}. Pla et al. han declarado que la vulnerabilidad resultante de un análisis multiplex emparedado escalas como 4N(N-1) donde N es el número de objetivos¹².

Para mitigar la reactividad cruzada en microarrays de anticuerpos, anticuerpos colocalization microarrays (ACM) se ha desarrollado en nuestro laboratorio de ensayo sándwich multiplex¹². Anticuerpos de captura (cAbs) son vistos en un substrato con un observador de microarrays. Después de bloqueo de las muestras se aplican en la superficie, y luego toques individuales son vistos en los mismos lugares con el complejo antígeno-cAb. Todos los escenarios de reactividad cruzada entre antígenos y anticuerpos pueden ser mitigados con ACM, y límites de detección en pg/mL se han logrado. Sin embargo, el protocolo de ensayo requiere preparación y manchado el dAbs durante los experimentos usando un spotter de microarray in situ con la alta precisión para propósito de la alineación, que es caro y consume tiempo, limitar la aplicación amplia de esta tecnología en otros laboratorios. Un mano ACM, llamado snap chip ha sido desarrollado para Cruz-reactivity-free y observador de tiro-libre multiplexar sandwich inmunoensayos^13,14,15. Taxis y lenguados son pre-vistos en una diapositiva de ensayo y un tobogán de transferencia respectivamente en formato de microarrays y almacenados. Durante el ensayo, se recuperan las diapositivas y un microarray de lenguados son transferidos colectivamente en la diapositiva de ensayo simplemente chasquear las dos fichas juntos. Un aparato de presión se utiliza para la transferencia confiable reactivo. Portaobjetos de nitrocelulosa recubierto con una capacidad de enlace de anticuerpos relativamente grandes se han utilizado como las diapositivas ensayo para absorber las gotitas de líquido y así facilitar la transferencia de reactivo, sin embargo, las diapositivas son más caras que microarray y laminas de vidrio regular escáneres compatibles con diapositivas no transparentes son necesarios para la adquisición de señales.

En este trabajo, demostramos el protocolo de llevar a cabo un immunoensayo del emparedado multiplex con un chip de snap. Un aparato novedoso complemento ha sido desarrollado para la transferencia de reactivo más conveniente y confiable de microarray de microarrays. Aquí lo importante, hemos establecido el método de transferencia de reactivo sobre portaobjetos de vidrio ordinario con la viruta del cierre. 1024 puntos se transfirieron con éxito y alineados sobre un portaobjetos de vidrio, ampliando significativamente el uso de esta tecnología en la mayoría de los laboratorios.

Protocolo

1. fabricación y almacenamiento de snap chips

1. método de transferencia simple ( Figura 1a)
   1. punto cAb soluciones que contengan 400 μg/mL anticuerpos y 20% de glicerol en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre una nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) diapositiva de ensayo con una de inyección de tinta microarray observador ¹³ en una humedad relativa de 60% (1.2 nL para cada punto) con espaciamiento de centro a centro de 800 μm. Asegúrese de que la diapositiva es fijada sobre la cubierta del observador según un ángulo (aquí, la esquina inferior izquierda fue utilizada).
   2. Incubar el portaobjetos manchada ensayo a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa de 60%.
   3. Abrazadera Junta módulo diapositivas con 16 compartimentos en la diapositiva de análisis para dividir en 16 pozos. Enjuagar el portaobjetos tres veces mediante la adición de 80 μl de PBS con un 0.1% Tween-20 (SAFT) en cada pozo y sacudiendo a 450 rpm en un agitador, 5 minutos cada vez.
   4. Añadir 80 μl de bloqueo para cada bien y agitar por 1 h a 450 rpm.
   5. Quite la Junta y secar el portaobjetos de ensayo con una corriente de nitrógeno.
   6. Fijar una diapositiva de transferencia en la cubierta del observador de tiro y empuje la parte inferior izquierda de la diapositiva contra la esquina inferior izquierda de la cubierta del observador. Tinta punto una amplia gama de marcas de alineación (una solución de micro-granos del poliestireno) con el mismo diseño que las cabinas de.
   7. Deje las marcas de alineación en seco. Tapa de la diapositiva de la transferencia y lo vuelva a colocar la cubierta de spotter, fijación contra la esquina inferior izquierda.
   8. Preparar el lenguado manchado las soluciones que contienen 20 μg/mL anticuerpos, glicerol al 20% y 1% de BSA.
   9. Usando el telescopio de ' s cámara, toma una foto de una marca de alineación. Implementar esta imagen en el programa de localización como una referencia y obtener el sistema de reconocimiento de imagen del telescopio de inyección de tinta para identificar la boya izquierda. Utilice sus coordenadas en el primer lugar de la matriz de dAb. Punto 8 nL por gota con un espaciamiento de centro a centro de 800 μm.
2. Método de doble transferencia ( Figura 1b)
   1. colocar una diapositiva de transferencia 1 en la cubierta de quitamanchas de tinta contra la esquina inferior izquierda. Punto taxis soluciones que contengan 400 μg/mL anticuerpos, glicerol al 20% y 1% de BSA en PBS sobre la diapositiva con un spotter de microarray de inyección de tinta en una humedad relativa de 60% (0.4 nL para cada punto y ~ 200 μm de diámetro). El espaciamiento de centro a centro es 400 μm.
   2. Ajustar la transferencia con un recubrimiento de nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) ensayo diapositiva usando un aparato de presión ( figura 2) para transferir las gotitas de la cabina en la diapositiva de ensayo.
      1. a su vez los seis botones laterales el aparato de presión por 90 grados y bloquear todos los elementos en la posición abierta. Insertar la diapositiva de transferencia en el soporte de diapositivas en su receptáculo con la esquina recortada hacia el perno del pogo fijo. La primera puesta de tres botones para liberar los émbolos con el perno del pogo oro y asegúrese de que las diapositivas son empujadas contra los pernos de alineación.
      2. Insertar un portaobjetos recubiertos con nitrocelulosa en el snap aparato boca abajo sentado en los 4 pines pogo. Gire el segundo conjunto de tres botones para liberar émbolos con el pin plata y asegúrese de que las diapositivas son empujadas contra los pernos de alineación.
      3. Cerrar el aparato de presión mediante la colocación de la carcasa superior del soporte de diapositivas utilizando la alineación pilares y huecos para un posicionamiento preciso.
      4. Inserte el aparato cerrado snap en su jaula y presione la pestaña de cierre completamente para los microarrays cara a cara mientras se aplica la presión adecuada. Mantener cerrada durante 1 minuto
   3. Separar las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa de 60%. Lavar, bloquear y secar el portaobjetos de ensayo como se describe en pasos 1.1.3 - 1.1.5.
   4. Ponga otra diapositiva de la transferencia en la cubierta de quitamanchas de tinta y empuje contra la esquina inferior izquierda. DAb punto soluciones que contienen 50 o 100 μg/mL de anticuerpos (ver tabla 1), glicerol al 20% y 1% de BSA en PBS. Asegurarse de que cada punto es 0.8 nL y el espaciamiento de centro a centro entre puntos es de 400 μm.
   5. Tienda el ensayo y la diapositiva de la transferencia. Análisis y transferencia de diapositivas en una bolsa hermética que contenga desecante del sello y puso en un congelador de-20 ° C.

2. Multiplexado de inmunoensayos con snap chips

1. recuperar la diapositiva de prueba del congelador. Deja la bolsa sellada durante 30 minutos hasta que el carro llega a temperatura ambiente.
2. Prepare 7 puntos serie diluida soluciones muestra por clavar las proteínas en PBS que contenga 0.05% Tween-20.
   Nota: Aquí, se utiliza un factor de 5-fold dilución. Las concentraciones de partida para cada proteína se enumeran en la tabla 1.
3. Preparar soluciones de muestra según el caso. Por ejemplo, diluir el suero humano 4 veces en buffer de SAFT.
4. Abrazadera de una Junta de compartimiento 16 en la diapositiva ensayo.
5. Llenar una columna de 8 pocillos con las soluciones de dilución de 7 proteína y una solución de tampón de SAFT proteínas mediante pipeteo. Pipetear las soluciones muestra en los otros pozos de 8 en la diapositiva misma.
   Nota: se pueden caber 80 soluciones μL en cada pozo. Más diapositivas pueden utilizarse para medir muestras adicionales cuando sea necesario.
6. Incubar las muestras en un agitador a 450 rpm por 1 h a temperatura ambiente o para pasar la noche a 4 ° C. lavado el carro tres veces con SAFT en el agitador a 450 rpm, 5 minutos cada vez. Retire la Junta y secar el portaobjetos bajo una corriente de gas nitrógeno.
7. Recuperar el carro de transferencia con toques del congelador. Mantener la bolsa sellada durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, incubar el portaobjetos en una cámara cerrada (por ejemplo caja de consejos vacíos) que contiene granos de estabilización de humedad de 60% por 20 min para la rehidratación.
8. Ajustar el carro de transferencia con la diapositiva de ensayo usando un aparato de presión ( figura 2) para transferir las gotitas de dAb. Ver sección 1.2.2 para el funcionamiento de los aparatos de presión.
9. Separar las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo en una cámara cerrada que contiene granos de estabilización de humedad de 60% para h. 1 abrazadera de la diapositiva de ensayo con un empaque de 16 compartimentos y enjuagar el portaobjetos 4 veces con SAFT en un agitador a 450 rpm, 5 minutos cada vez.
10. Pipeta 80 μl de las soluciones que contienen 2,5 fluoróforo estreptavidina μg/mL en PBS a cada pocillo. Incubar por 20 min en un agitador a 450 rpm.
11. Enjuague la diapositiva 3 veces con Saft y una vez con agua destilada en el agitador a 450 rpm. Retire la Junta y secar el portaobjetos usando nitrógeno gas.

3. Deslice la exploración y análisis de datos

1. analizar la diapositiva de prueba con un scanner de microarrays de fluorescencia usando el láser de 635 nm.
2. Extraer la intensidad neta de cada punto mediante un análisis software (e.g. matriz pro analyzer) ¹⁶.
3. Calcular el límite de detección (LOD) de cada proteína utilizando un software estadístico y determinar las concentraciones de proteína en las muestras de.
   Nota: El LOD se define como la intersección de la norma cuincrementado en tres veces la desviación estándar de tres ensayos independientes RVE.

Resultados

El procedimiento del ensayo de single y doble métodos de transferencia se muestra en la figura 1. En una transferencia, los taxis son vistos directamente en la diapositiva de ensayo y los lenguados se transfieren en la diapositiva de ensayo al uso en forma de espejo de los taxis (Figura 1a). Procedimiento de solo transferencia se requiere, pero este método sufre de desalineación entre los dos microarrays, causada principalment...

Discusión

En este trabajo, hemos presentado una tecnología de chip de complemento que hace las immunoassays multiplex Cruz-reactivity-free ampliamente disponible para los investigadores con configuración experimental básica. A diferencia de los microarrays de anticuerpos, ningún observador de microarrays es necesario para los usuarios finales. Se demuestran solo y métodos de transferencia de doble, y doble transferencia ofrece exactitud de la alineación superior a ~ 40 μm para los puntos del 98%, con el desalineamiento mayo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline tablet	Fisher Scientific	5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5	Rockland	s000-06
Tween-20	Sigma-Aldrich	p1379
Bovine serum albumin	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	001-000-162
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer	SurModics, Inc	SG02
Nitrocellulose coated slides	Grace Bio-Laboratories, Inc	305116
Aminosilane coated slides	Schott North America	1064875
Snap Device	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
Inkjet microarray spotter	GeSiM	Nanoplotter 2.0
Slide module gasket	Grace Bio-Laboratories, Inc	204862
Humidity Stabilization Beads	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software	Media Cybernetics	Version 4.5
Fluorescence microarray scanner	Agilent	SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software	GraphPad Software	GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody	R&D Systems	MAB10972
Endoglin protein	R&D Systems	1097-EN
Endoglin detection antibody	R&D Systems	BAF1097
IL-6a (see Table 1)	R&D Systems
IL-6b (see Table 1)	Invitrogen