Enclenchez la puce pour les immunoessais de Cross-reactivity-libre et exempt de Spotter multiplexée "sandwich"

Résumé

Nous démontrons une technologie de puce snap pour effectuer des tests immunologiques reactivity-free multiplexée "sandwich" le simplement claquer deux diapositives. Un appareil à pression est utilisé pour le transfert fiable des réactifs de microarray-aux-puces. La puce du composant logiciel enfichable peut être utilisée pour des réactions biochimiques nécessitant une colocalisation des différents réactifs sans contamination croisée.

Résumé

Analyse des protéines multiplexé a montré la sensibilité diagnostique supérieure et la précision par rapport aux protéines simples. Microarrays d’anticorps permettent depuis des milliers d’immunoessais micro-échelle réalisées simultanément sur une seule puce. Format de dosage "sandwich" améliore la spécificité de dosage en détectant chaque cible avec deux anticorps, mais souffre d’une réactivité croisée entre les réactifs limitant ainsi leurs capacités de multiplexage. Anticorps colocalisation microarray (ACM) a été développé pour la détection de protéines multiplexé cross-reactivity-libre, mais requiert un pareur cher sur place pour la fabrication de puces lors des essais. Dans ce travail, nous démontrons une technologie de puce de composant logiciel enfichable qui transfère le réactif de microarray-aux-puces de simplement claquer deux puces ensemble, que donc aucun pareur n’est nécessaire au cours de l’incubation de l’échantillon et la demande ultérieure d’anticorps de détection (dAbs) sur stockage de diapositives pré tachetés, se dissociant de la préparation de l’exécution de test. Les deux méthodes de transfert de simples et doubles sont présentés pour parvenir à un alignement précis entre les deux puces à ADN et la fabrication de diapositives pour les deux méthodes sont décrites. Les résultats montrent que < 40 μm alignement a été réalisé avec le double transfert, pour atteindre une densité de tableau de 625 points/cm². Un test immunologique 50-plexed a été mené pour démontrer la facilité d’utilisation de la puce de composant logiciel enfichable dans l’analyse des protéines multiplexé. Limites de détection des 35 protéines sont dans la gamme de pg/mL.

Introduction

Un panel de biomarqueurs comprenant plusieurs protéines peut fournir plus de sensibilité et de spécificité qu’un biomarqueur unique pour le diagnostic de maladies complexes telles que les cancers^1,2. Le dosage immuno-enzymatique (ELISA) a été l’étalon-or technologie utilisée dans les laboratoires cliniques, atteindre une limite de détection à faible pg/mL dans le plasma, mais les limites à une cible par dosage^3,4,5. Microarrays d’anticorps ont été conçus pour accueillir des milliers de tests miniaturisés effectuées en parallèle sur un microscope unique diapositive^6,7,8. Toutefois, la capacité de multiplexage de cette méthode est limitée par la réactivité croisée pilotée par le réactif, résultant de l’application d’un mélange de limandes, et elle devient plus problématique avec un nombre croissant de cibles^{9,10 , 11}. Pla et al. ont déclaré que la vulnérabilité résultante d’un essai de multiplex "sandwich" échelles comme 4N(N-1), où N est le nombre des cibles¹².

Pour atténuer les réactions croisées en anticorps microarrays, anticorps colocalisation microarray (ACM) a été développé dans notre laboratoire pour multiplex "sandwich" test¹². Anticorps de capture (cabines) sont repérés sur un substrat avec un guetteur de microarray. Après blocage échantillons sont appliqués sur la surface, et puis par les touches individuelles sont repérés sur les mêmes endroits avec le complexe antigène-cAb. Tous les scénarios de réactivité croisée entre les anticorps et les antigènes peuvent être atténués avec ACM, et limites de détection à pg/mL ont été atteints. Toutefois, le protocole d’essai nécessite préparation et repérer les touches au cours des expériences à l’aide d’un pareur de microarray sur place avec une grande précision pour fins d’alignement, qui est coûteux et prend du temps, de limiter l’application large de cette technologie dans autres laboratoires. Un ordinateur de poche ACM, nommé puce clin d’oeil a été développé pour cross-reactivity-libre et exempt de spotter multiplex "sandwich" immunoessais^13,14,15. toutes les cabines et plots sont préalablement repérées sur une diapositive de dosage et un toboggan de transfert respectivement au format de microarray et stockés. Pendant le test, les diapositives sont récupérées et un microarray des plots sont transférés collectivement sur le toboggan de dosage à simplement faire claquer les deux puces ensemble. Un appareil à pression est utilisé pour transfert fiable de réactif. Diapositives de nitrocellulose enduit avec une capacité de liaison anticorps relativement importantes ont été utilisés comme les diapositives de dosage pour absorber les gouttes de liquides et ainsi faciliter le transfert de réactif, cependant, les diapositives sont plus chers que microarray et lames de verre ordinaire scanners compatibles avec lames opaques sont nécessaires pour l’acquisition de signaux.

Dans ce travail, nous démontrons le protocole d’exécution d’un test immunologique du multiplex "sandwich" avec un clin d’oeil à puce. Un appareil nouveau clin d’oeil a été développé pour le transfert de réactif plus pratique et fiable de microarray-aux-puces. Ce qui est important, ici, nous avons établi la méthode de transfert de réactif sur lames de verre ordinaire avec la puce de composant logiciel enfichable. 1024 points ont été correctement transférés et alignés sur une lame de verre, élargissant considérablement l’utilisation de cette technologie dans la plupart des laboratoires.

Protocole

1. fabrication et le stockage de snap copeaux

1. méthode de transfert unique ( Figure 1 a)
   1. Spot cAb solutions contenant des 400 anticorps µg/mL et 20 % de glycérol dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur une nitrocellulose (ou un verre fonctionnalisé) lame de test avec un jet d’encre/spotter microarray ¹³ à une humidité relative de 60 % (1,2 nL pour chaque tache) avec 800 µm--entraxe. Assurez-vous que la lame est fixée sur le pont de spotter selon un angle (ici, le coin inférieur gauche a été utilisé).
   2. Incuber la lame de test tacheté à température ambiante pendant 1 h avec une humidité relative de 60 %.
   3. Pince un joint module de glissement avec 16 compartiments sur la diapositive de dosage de le diviser en 16 puits. Rincer la lame trois fois en ajoutant 80 µL de PBS contenant 0,1 % Tween-20 (PBST) dans chaque puits et secouant à 450 tr/min sur un agitateur, 5 min chaque fois.
   4. Ajouter 80 µL de blocage des solutions pour chaque bien et agiter pendant 1 h à 450 tr/min.
   5. Enlever le joint et sécher la lame de test avec un courant d’azote.
   6. Fixer une diapositive de transfert sur le pont de spotter et pousser le coin inférieur gauche de la lame contre le coin inférieur gauche de la platine spotter. Jet d’encre apercevoir un tableau de repères (solution de micro-billes de polystyrène) avec la même disposition que celle pour les cabines à.
   7. Sécher les repères. Flip la diapositive transfert et remettre en place sur le pont de spotter, fixation contre le coin inférieur gauche.
   8. Préparer le dAb spotting solutions contenant 20 µg/mL anticorps, 20 % de glycérol et 1 % de BSA.
   9. à l’aide de l’observateur ' s appareil photo, prendre une image de marque d’alignement. Mettre en œuvre cette photo dans le programme de lunettes comme un alignement et obtenir le système de reconnaissance d’image de la longue-vue de jet d’encre pour identifier la marque plus haut de la page de gauche. Utiliser ses coordonnées comme la première place du tableau dAb. Place 8 nL par goutte avec un espacement de centre à centre de 800 µm.
2. Méthode de transfert double ( Figure 1 b)
   1. Placez un chariot de transfert 1 sur le pont de spotter jet d’encre contre le coin inférieur gauche. Repérer les cabines des solutions contenant 400 µg/mL anticorps, 20 % de glycérol et 1 % de BSA dans du PBS sur la lame avec un pareur de microarray de jet d’encre à une humidité relative de 60 % (0,4 nL pour chaque tache et ~ 200 µm de diamètre). L’espacement de centre à centre est 400 µm.
   2. Casser la lame de test transfert diapositive avec une nitrocellulose enduit (ou un verre fonctionnalisé) utilisant un appareil de clin d’oeil ( Figure 2) pour transférer les gouttelettes de cabine sur le toboggan de dosage.
      1. Tour six boutons sur le côté de l’appareil de composant logiciel enfichable de 90 degrés pour tirer et verrouiller tous les plongeurs en position ouverte. Insérer la diapositive de transfert dans le support de diapositive dans son récipient avec le coin coupé face à la broche fixe pogo. Tournez à la première série de trois boutons pour libérer les pistons avec la broche dorée pogo et assurez-vous que les lames sont poussés contre les tiges d’alignement.
      2. Insérer une diapositive de nitrocellulose-enduit dans le composant logiciel enfichable appareil envers assis sur les 4 broches pogo. Tourner à la deuxième série de trois boutons pour libérer les pistons avec la broche d’argent et s’assurer que les diapositives sont poussés contre les tiges d’alignement.
      3. Fermer l’appareil de snap en plaçant la coquille supérieure sur le support de diapositive en utilisant les trous et les piliers de l’alignement pour un positionnement précis.
      4. Insérer l’appareil fermé clin d’oeil dans sa cage et poussez la languette de fermeture complètement vers le bas pour mettre les puces en face à face tout en appliquant la pression appropriée. Garder fermé pendant 1 min.
   3. Séparer les diapositives. Incuber la lame de test à température ambiante pendant 1 h avec une humidité relative de 60 %. Laver et sécher la lame de test comme décrit aux points 1.1.3 - 1.1.5 bloquer.
   4. Placer une autre diapositive de transfert sur le pont de spotter jet d’encre et de la pousser contre le coin inférieur gauche. Solutions de dAb spot contenant 50 ou 100 µg/mL d’anticorps (voir tableau 1), 20 % de glycérol et 1 % de BSA dans du PBS. S’assurer que chaque spot est 0,8 nL et l’espacement de centre à centre entre taches est 400 µm.
   5. Store le dosage et la diapositive de transfert. Sceller le dosage et le transfert de diapositives dans un sac hermétique contenant un sachet déshydratant et mettre dans un congélateur à-20 ° C.

2. Multiplexés immunodosages avec snap jetons

1. récupérer la diapositive de dosage du congélateur. Laissez le sac scellé pendant 30 min jusqu'à ce que la diapositive soit à température ambiante.
Série de 7 points
2. Prepare dilué solutions échantillons de protéines dans du PBS contenant 0,05 % de fortification Tween-20.
   NOTE : Ici, un facteur de dilution 5 fois est utilisé. Les concentrations de départ pour chaque protéine sont énumérées au tableau 1.
3. Solutions échantillons Prepare selon le cas. Par exemple, diluer sérum humain 4 fois dans un tampon PBST.
4. Serrer un joint 16 compartiments sur la diapositive de dosage.
5. Remplir une seule colonne de 8 puits avec les solutions de dilution 7 protéines et une solution de tampon PBST exempt de protéines de pipetage. Pipetter les exemples de solutions dans les 8 autres puits sur la même lame.
   Remarque : des 80 solutions µL peuvent être adaptées dans chaque puits. Diapositives plus peuvent être utilisés pour mesurer les échantillons supplémentaires lorsque cela est nécessaire.
6. Incuber les échantillons sur un agitateur à 450 tr/min pendant 1 h à température ambiante ou pour la nuit à 4 ° C. Lavez la diapositive trois fois avec PBST sur l’agitateur à 450 tr/min, 5 min chaque fois. Enlever le joint et sécher la lame sous un courant d’azote gazeux.
7. Récupérer la diapositive transfert avec quelques touches du congélateur. Gardez les sacs scellés pendant 30 min à température ambiante. Puis, incuber la lame dans une chambre fermée (par exemple une zone vide conseils) contenant 60 % humidité billes de stabilisation pendant 20 min pour la réhydratation.
8. Casser la diapositive transfert avec la lame de test utilisant un appareil de clin d’oeil ( Figure 2) pour transférer les gouttelettes de dAb. Voir la section 1.2.2 pour le fonctionnement de l’appareil de snap.
9. Séparer les diapositives. Incuber la lame de test dans une enceinte fermée contenant 60 % humidité billes de stabilisation pendant 1 h. pince la lame de test avec un joint de 16 compartiments et rincer la lame 4 fois sur un agitateur à 450 tr/min, 5 min chaque fois à l’aide de PBST.
10. Pipette 80 µL des solutions contenant 2,5 fluorophore de streptavidine µg/mL dans du PBS dans chaque puits. Incuber pendant 20 min sur un agitateur à 450 tr/min.
11. Rincer la diapositive 3 fois avec PBST et une fois avec de l’eau distillée sur l’agitateur à 450 tr/min. Enlever le joint et sécher la lame à l’aide de gaz azote.

3. Analyse de données et de numérisation de diapositive

1. scanne la diapositive de dosage avec un scanner de microarray de fluorescence en utilisant le laser de 635 nm.
2. Extraire l’intensité nette de chaque tache à l’aide d’une analyse logiciels (p. ex. l’analyseur tableau-pro) ¹⁶.
3. Calcul de la limite de détection (LD) de chaque protéine à l’aide d’un logiciel de statistiques et de déterminer les concentrations de protéine dans les échantillons de.
   Remarque : La limite de détection est défini comme l’ordonnée à l’origine de la norme cuRVE incrémenté par trois fois l’écart-type des trois tests indépendants.

Résultats

Le mode OPERATOIRE pour les single et double les méthodes de transfert est illustré à la Figure 1. Dans le simple transfert, les cabines sont repérés directement sur la diapositive de dosage et les touches sont transférés sur le toboggan de dosage à utiliser dans un modèle de miroir de la cabine (Figure 1 a). Procédure de transfert qu’un seul est nécessaire, mais cette méthode souffre de défauts d’alignement entr...

Discussion

Dans ce travail, nous avons présenté une technologie de puce de clin d’oeil qui rend les immunoessais cross-reactivity-libre multiplexes largement disponibles pour les chercheurs avec base montage expérimental. Différent des puces à anticorps existant, aucun observateur « microarray » n’est nécessaire pour les utilisateurs finaux. Les single et double les méthodes de transfert sont démontrés, et double transfert offre précision d’alignement supérieur vers le bas pour ~ 40 μm pour les taches de 98 %,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline tablet	Fisher Scientific	5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5	Rockland	s000-06
Tween-20	Sigma-Aldrich	p1379
Bovine serum albumin	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	001-000-162
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer	SurModics, Inc	SG02
Nitrocellulose coated slides	Grace Bio-Laboratories, Inc	305116
Aminosilane coated slides	Schott North America	1064875
Snap Device	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
Inkjet microarray spotter	GeSiM	Nanoplotter 2.0
Slide module gasket	Grace Bio-Laboratories, Inc	204862
Humidity Stabilization Beads	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software	Media Cybernetics	Version 4.5
Fluorescence microarray scanner	Agilent	SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software	GraphPad Software	GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody	R&D Systems	MAB10972
Endoglin protein	R&D Systems	1097-EN
Endoglin detection antibody	R&D Systems	BAF1097
IL-6a (see Table 1)	R&D Systems
IL-6b (see Table 1)	Invitrogen