وصف ملحقات غشاء الخلية ودراسة أدوارهم في ديناميات التصاق خلايا السرطان

Summary

وتوضح هذه الدراسة فائدة وسهولة قياس تمديد الكمية غشاء الخلية وارتباطها بقدرة التصاق الخلايا. وكمثال ممثل، نعرض هنا أن البروتين المتصلة ديككوبف 3 (DKK3) ويشجع تشكيل لوبوبوديا زيادة وخلية أدهيسيفينيس في سرطان البطاني الخلايا في المختبر.

Abstract

مرجع ملحق غشاء الخلية ينظم مختلف السلوكيات الخبيثة خلايا السرطان، بما في ذلك قدراتها لاصقة والمهاجرة. القدرة على دقة تصنيف وتحديد ملحقات الخلية وقياس الأثر على قدرة لاصقة في خلية أمر حاسم لتحديد كيف الخلية مما يشير إلى أحداث تأثير سرطان الخلية السلوك والعدوانية. وهنا يصف لنا في المختبر تصميم واستخدام الخلية الكمي أسلوب التوسيع بالاقتران مع مقايسة قدرة التصاق في نموذج المنشأة في المختبر لسرطان البطاني (لجنة التنسيق الإدارية). على وجه التحديد، نقوم باختبار آثار DKK3، القامع ورم المفترضة، وعامل المؤيدة تمايز، على النمط الظاهري تمديد غشاء خط الخلية لجنة التنسيق الإدارية، SW 13. أننا نقترح هذه الاختبارات تقديم بسيط نسبيا، ويمكن الاعتماد عليها، والمقاييس بسهولة التفسير لتدابير هذه الخصائص في ظروف تجريبية مختلفة.

Introduction

WNT Dysregulated مما يشير إلى دور حاسم في الأورام الخبيثة البطاني¹. الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة التحقيق ما إذا كان تكميم أفواه DKK3، منظم سلبية من إشارات WNT، يمثل حدثاً dedifferentiation في قشرة الغدة الكظرية ويعزز تشكيل الورم في السياق التغييرات مرجع الخلية-ملحق. DKK3 هو كاتشين 38 يفرز بروتين سكري مع ببتيد إشارة الطرفي ن وقد أظهرت الدراسات السابقة أن التعبير القسري أدت إلى توقيف دورة الخلية وتثبيط السلوك العدواني الخبيث وعكس الظهارية الوسيطة ²من المرحلة الانتقالية.

السلوك الخبيث لسرطان البطاني (لجنة التنسيق الإدارية)، وغيرها من أنواع السرطان، في جزء منه، وتتأثر قدرة الخلايا السرطانية على الواجهة مع الأسطح المحيطة بها، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية، الذي بدوره يسهل غزو الخلايا السرطانية و ³من الهجرة. يتم شرحها دور ملحقات غشاء الخلية المحددة في تطور السرطان يتزايد في سياقات مختلفة، في المقام الأول عن طريق تشكيل فيلوبوديا. على سبيل المثال، قد وجد overexpression قنوات الكالسيوم من نوع L للحث على تشكيل فيلوبوديا والنهوض بورم الخلايا غزو⁴. وبالمثل، فاسسين، أكتين ملزمة البروتين الحد الأدنى المعرب عنها في أنسجة طبيعية، أيضا overexpressed في الخلايا السرطانية بالاشتراك مع تشكيل فيلوبوديا⁵. تشكيل لوبوبوديا تمكن الليفية غير الخبيثة لترحيل نحو فعال من خلال مصفوفة خارج الخلوية، ومع ذلك، فقد ثبت أن الخلايا فيبروساركوما تعتمد على نشاط أية بدلاً من لوبوبوديا لتسهيل الهجرة الخلية و ⁶من الغزو. وقد أظهرنا ذلك الورم المكثفات، بما في ذلك رأس رابطة مجال الأسرة 1 إيسوفورم (RASSF1A) و DKK3، يمكن أن تعمل لتغيير عناصر سيتوسكيليتال وتشجيع تشكيل لاميليبوديا وحركت خصائص الغازية^7،8.

على هذا النحو، من المهم لتوصيف تأثيرات الجينات المشتركة في التسرطن وعلاقتها بغشاء الخلية ملحق التعديلات، على وجه التحديد تقييم تشكيل فيلوبوديا، ولوبوبوديا، ولاميليبوديا تحت ظروف الاختبار. دولة من بين أحدث التقنيات الحالية تشمل استخدام أساليب متطورة على نحو متزايد الفحص المجهري، ووسم الفلورسنت، و/أو خوارزميات الحاسوب المعقدة للحصول على البيانات وتفسيرها. بينما هذه الأساليب توفير أدوات تحليلية جديدة وقوية، تعقيدها يحد من استخدامها على نطاق واسع وقدرة على التكيف في تجارب البيولوجيا الخلية. وعلاوة على ذلك، القياس الكمي الدقيق ومراقبة التغيرات في الخلية ملحق مورفولوجيا لا يقاس عادة^9،10. وفي المقابل، نقدم تقنية هنا أن يوضحها بدقة الخلية ملحق التعديلات باستخدام التقنيات المجهرية القياسية وأساليب التكيف مع سهولة في المختبر . هذه الأساليب أيضا تحديد كمية كل نوع خلية التمديد في وقت واحد لكل خلية تحليل وتحديد التغييرات الشاملة في مرجع ملحق غشاء الخلية. ونحن أيضا إظهار كيف يمكن أن تتصل هذه التغييرات على خصائص التصاق الخلية.

على سبيل مثال تجريبية، سوف نستخدم خط خلية التي تم إنشاؤها مسبقاً من 13 SW، عينت SW-DDK3، الذي قد تم transfected ثابت مع بلازميد DKK3/pCMV6-دخول ناقلات ومؤثراً أوفيريكسبريسيس DKK3، عامل التفريق في الغدة الكظرية. SW 13 عدم transfected الخلايا والخلايا SW 13 ستابلي transfected مع متجه فارغة (pCMV6-الإدخال)، عينت SW-الأجسام القريبة من الأرض، كضوابط تجريبية.

Protocol

1-ملحق خصائص الخلية

1. الحفاظ على SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، والخلايا DKK3 سويسري في قياسية هوميديفيد حاضنة في 37.0 درجة مئوية و 5% CO₂ في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين و 10,000 يو/مليلتر البنسلين وستربتوميسين (سميت 'نمو متوسطة').
   1. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير، ولوحة خلايا 5,000 كل بئر SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وخطوط SW-DKK3 إلى لوحات 6-بئر منفصلة وتنمو بين عشية وضحاها في متوسط النمو في كوفيرسليبس الزجاج العقيمة.
2. بعد النمو بين عشية وضحاها، لكل بئر، نضح المتوسطة النمو، تغسل الخلايا مع 1 مل من المحلول الملحي الدافئ مخزنة الفوسفات (PBS)، ومن ثم إصلاحها الخلايا مع 1 مل فورمالدهايد 3.7% لمدة 10 دقائق.
3. صبغ الخلايا aspirate فورمالدهايد ووصمة عار في كل بئر مع 1 مل بنفسجي كريستال 0.05% للحد الأدنى 30 فائض المياه والصرف الصحي بعيداً باستخدام ثلاثة يغسل ماء منزوع 1 مل.
   ملاحظة: تبعاً لمستوى الإقبال على صبغ، يغسل إضافية عدة قد تحتاج لإزالة الخلفية تلطيخ لتعزيز التصور الخلية.
   1. استخدام الملقط مقلوب غرامة، استرداد كوفيرسليبس ووضعها الوجه لأسفل على شريحة زجاج مسمى مع قطره كاشف تصاعد واضح.
4. تحت مجهر خفيفة، اختيار عشوائي آراء 20 من الخلايا غير متداخلة من كل ساترة للمقايسة تمديد الخلية.
   1. أن photomicrographs على 400 x التكبير لكل حقل من عرض. مباشرة حساب عدد كل نوع من الإرشاد لكل من الخلايا الممثل 20.
      ملاحظة: على هذا النحو، 20 زنزانة معزولة يجب النظر لكل حالة اختبار ضمان الحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. وحددت فيلوبوديا من ملحقات الهاتف الخلوي مع قاعدة 5 ميكرون أو أقل، ولائحة واحدة. وحددت لوبوبوديا من ملحقات الهاتف الخلوي مع قاعدة من 5 إلى 20 ميكرون ملحقات التي تحتوي على طول مع أبيسيس متعددة. تم تعريف لاميليبوديا بملحقات الخلية التي تزيد عن 20 ميكرون في الطول ومع أو بدون أبيسيس. تبعاً لنوع الخلية اختبار، قد تختلف أحجام ملحقات الخلية وقد تتطلب الصقل لتحديد معلمات.
5. تحديد متوسط عدد كل ملحق خلية في كل نوع الخلية (أيSW 13، وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وسويسري-DDK) عبر الآبار 6 درس.
6. باستخدام اختبار تحليل تباين أحادي اتجاه (ANOVA) إحصائية، مقارنة الاختلافات في متوسط النسبة المئوية لملحقات غشاء الخلية من بين أنواع الخلية اختبار مختلفة.

2-الالتصاق بالانزيم

1. الحفاظ على SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، والخلايا DKK3 سويسري في حاضنة هوميديفيد قياسية في 37.0 درجة مئوية و 5% CO₂ في المتوسطة النمو.
   1. استخدام هيموسيتوميتير، عد ولوحة خلايا 100,000 SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وسويسري-DKK3 الواحدة وكذلك في لوحات 6-بئر منفصلة وتنمو بين عشية وضحاها في المتوسطة النمو.
   2. اختبار البذور جيدا 6 لوحات لكل نوع من الخلايا، باستخدام لوحة واحدة لكل نقطة من النقاط الزمنية المعينة 6 اختبار أدناه.
      ملاحظة: قد تختلف النقاط الزمنية لأنواع مختلفة من الخلايا.
2. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني دافئ مرة واحدة ثم إضافة 0.5 مل 1 × الخلية غير الانزيمية الانفصال الحل لكل بئر.
   1. دوامة لوحة لنشر الحل الانفصال من الخلية. نضح لوحة المعينة عند نقطة زمنية محددة (أي 1، 2، 3، 5، 10 و 15 دقيقة) ويغسل مع 1 مل الحل برنامج تلفزيوني دافئ ثلاث مرات.
   2. بين يغسل، اضغط برفق لوحات لفصل الخلايا المرفقة فضفاضة.
3. نضح أي برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا المتبقية تعلق على اللوحة مع 1 مل فورمالدهايد 3.7% لمدة 10 دقائق المتبقية.
4. وصمة عار الخلايا مع 1 مل بنفسجي كريستال 0.05% لمدة 30 دقيقة ثم تغسل الصبغة الزائدة بعيداً مع 1 مل مياه. تيتراتي المياه والصرف الصحي لتعزيز التصور الخلية.
   ملاحظة: تبعاً لمستوى الإقبال على صبغ، قد تكون مطلوبة يغسل إضافية عديدة لتعزيز التصور الخلية.
5. استخدام مجهر ضوء في 100 x التكبير، عد الخلايا المرفقة المتبقية في كل بئر لكل لوحة.
   ملاحظة: استخدام المساطر الشفافة أو وسم القلم خير دليل على الجانب السفلي من اللوحة سيساعد على تجنب تكرار العد من نفس الخلايا.
6. تحديد متوسط عدد الخلايا المرفقة كل بئر لكل لوحة.
7. مقارنة بمعدل مفرزة الخلية بين SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وخلايا SW-DDK3 على مدى فترة زمنية معينة باستخدام اختبار ANOVA إحصائية ذات اتجاهين.

النتائج

استخدام الاختبارات المذكورة أعلاه، تم اختبار آثار أوفيريكسبريسيون DKK3 على خلية ملحق مورفولوجيا وخصائص التصاق الخلية في خط الخلية لجنة التنسيق الإدارية المنشأة SW-13، في المختبر. الخلايا overexpressing DKK3 تم إنشاؤها بواسطة ستابلي ترانسفيكتينج الخلايا SW 13 مع حركة DDK المعلمة DK...

Discussion

هنا يصف لنا في المختبر كمي أسلوب لوصف ملحقات الخلية بسهولة، وشلالات حفرة قليلة، وإمكانية تكرار نتائج موثوقة يمكن تطبيقها لمختلف ظروف الاختبار. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء فحوصات الالتصاق و/أو حركية بسيطة وقابلة للقياس في نفس الوقت للربط بين الأهمية الوظيفية المحتملة للتغيرات الملاح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin
Deulbeco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	1X solution, used directly
3.7% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute stock solution
0.05% crystal violet	Harleco	192-12	Dilute stock solution
De-ionized water	NA	NA	NA
Microscope with 400X magnification	NA	NA	NA
6-well plates	Corning	353046	NA
Cell dissociation solution non-enzymatic 1X	Sigma-Aldrich	C5914	1X solution, used directly