Характеристика расширений клеточной мембраны и изучения их роли в динамике адгезии клеток рака

Резюме

Это исследование свидетельствует о полезности и простота расширения измерение количественных клеточной мембраны и его корреляция клей способности клеток. Как пример мы показываем здесь что связанных с Dickkopf белком 3 (DKK3) способствует формированию более lobopodia и адгезии клеток в Адренокортикальной рак клеток в пробирке.

Аннотация

Расширение репертуара клеточной мембраны модулирует различных злокачественных поведение раковых клеток, включая их клей и мигрирующих потенциалов. Способность точно классифицировать и подсчитать ячейки расширений и измерить эффект на клетки клей потенциала имеет решающее значение для определения как клетки сигнализации поведение клеток рака влияние события и агрессивность. Здесь мы описываем в vitro разработки и использования клеток количественного определения метода расширения в сочетании с assay способности адгезии в установленных в vitro модели для адренокортикальной карциномы (АКК). В частности мы тестируем воздействия DKK3, подавитель предполагаемого опухоли и про дифференциация фактором, на фенотип расширение мембраны клеточной линии АКК, SW-13. Мы предлагаем эти анализы предоставлять относительно простые, надежные и легко интерпретировать данные метрик для мер эти характеристики в различных экспериментальных условиях.

Введение

Dysregulated WNT сигнализации играет важную роль в адренокортикальной злокачественных¹. Методы, используемые в данном исследовании расследовать ли глушителей из DKK3, негативный регулятор WNT сигнализации, представляет собой событие дифференцировке в коры надпочечников и способствует формированию опухоли в контексте изменения клеток расширение репертуара. DKK3 — 38 кДа выделяется гликопротеин с пептидной сигнал N-стержня и предыдущие исследования показали его насильственного выражение привели к аресту клеточного цикла, тормозится агрессивное поведение злокачественных и вспять эпителия мезенхимальных ²переход.

Злокачественные поведение адренокортикальной карциномы (АКК) и другие виды рака, в части, под влиянием опухолевых клеток способность взаимодействовать с окружающих поверхностей, включая внеклеточного матрикса, который в свою очередь облегчает вторжение клеток опухоли и миграции³. Время роль конкретных клеточной мембраны расширений в прогрессии рака чаще проявляется в различных контекстах, главным образом через формирование filopodia. Например чтобы побудить filopodia формирования и поощрения опухолевых клеток вторжения⁴было установлено гиперэкспрессия L-типа кальциевых каналов. Аналогично Башчаршия, актина, связывая протеин минимально выраженные в нормальной ткани, также гиперэкспрессия в раковых клетках в ассоциации с filopodia формирования⁵. Lobopodia формирования позволяет незлокачественных фибробластов эффективно перенести через внеклеточных матрицы, однако, было показано, что клетки фибросаркома полагаются на металлопротеиназы деятельности вместо lobopodia для облегчения миграции клеток и вторжения⁶. Мы показали, что опухолевые супрессоры, включая рас Ассоциация домена семьи 1 изоформы (RASSF1A) и DKK3, может работать для изменения цитоскелета элементов и поощрения формирования lamellipodia и загнать в угол инвазивные свойства^7,8.

Таким образом важно, чтобы характеризовать эффекты генов, участвующих в канцерогенеза и их отношения к клеточной мембраны расширение изменения, в частности оценки формирования filopodia, lobopodia и lamellipodia в условиях испытания. Текущее состояние оф-арт методы включают в себя использование микроскопии все более изощренные методы, люминесцентные маркировки и/или сложных компьютерных алгоритмов для сбора данных и интерпретации. Хотя эти методы предоставляют новые и мощные аналитические инструменты, их сложность ограничивает их широкого использования и адаптации в биологии клеток экспериментов. Кроме того точную количественную оценку и наблюдение изменений в морфологии клеток расширение не является обычно измеренных^9,10. Напротив мы представляем технику, которая точно количественно изменения расширения клеток с помощью стандартных микроскопические и легко могут быть приспособлены в vitro методов. Эти методы также количественную оценку каждой ячейки тип расширения одновременно для каждой ячейки проанализированы и определить общие изменения в репертуаре расширение клеточной мембраны. Мы также показать, как эти изменения могут относиться к адгезионные свойства ячейки.

В качестве примера экспериментальный мы будем использовать ранее созданные ячейки линия SW-13 места для SW-DDK3, которая была стабильно transfected с pCMV6-вход/DKK3 плазмиды векторов и конститутивно overexpresses DKK3, дифференцирующим фактором в надпочечников. Non-transfected SW-13 клетки и клетки SW-13, стабильно transfected с пустой вектор (pCMV6-вход), Места для SW-нео, будет служить экспериментальных элементов управления.

протокол

1. клетки расширение характеристики

1. Поддерживать SW-13, SW-нео и SW-DKK3 клетки в стандартной увлажненные инкубатор 37.0 ° c и 5% CO₂ в среде орла изменения Дульбекко дополненные плода бычьим сывороточным 10% и 10 000 ед/мл пенициллина и стрептомицина (обозначенного как «средство роста»).
   1. Подсчитать ячейки с помощью Горяева и пластина 5 000 ячеек на хорошо для SW-13, SW-нео и SW-DKK3 линий в отдельные пластины 6-Ну и растут на ночь в средство роста на стерильных стеклянных coverslips.
2. После ночи роста, для каждой скважины, аспирационная среднего роста, вымыть клетки с 1 мл теплой фосфат амортизированное saline (PBS), а затем исправить клетки с 1 мл раствора формальдегида 3,7% за 10 мин.
3. Аспирата формальдегида и пятно клеток в каждой скважине с 1 мл 0,05% фиолетовый кристалл для 30 min. мыть избыток краски, с помощью трех моет 1 мл деионизированной воды.
   Примечание: В зависимости от уровня поглощения краски, несколько дополнительных моет может быть необходимо удалить фон, окрашивание содействовать визуализации ячейки.
   1. С помощью тонкой наконечником щипцы, получить coverslips и поместите их лицевой стороной вниз на слайде помечены стекла с капли реагента четкие установки.
4. Под микроскопом света случайным образом выбираете 20 просмотров non перекроя клеток от каждого coverslip для расширения assay клетки.
   1. Возьмите микрофотографиями при 400-кратном каждого поля зрения. Прямо подсчитать количество каждого типа расширения для каждого представителя 20 клеток.
      Примечание: таким образом, 20 изолированных клеток должны рассматриваться для каждого проверяемое условие для обеспечения надежных результатов. Filopodia были определены сотовой расширений с базой 5 микрон или меньше и одной вершиной. Lobopodia были определены сотовой расширений с базой 5 до 20 микрон длиной содержащие расширений с несколькими Апицес. Lamellipodia были определены путем расширения клеток, которые больше чем 20 мкм в длину и с или без Апицес. В зависимости от типа испытания клеток размеры ячейки расширений могут различаться и может потребоваться уточнение определения параметров.
5. Определите среднее количество расширения каждой ячейки в каждой ячейке тип (т.е., SW-13, SW-нео, SW-DDK) через 6 скважин изучены.
6. С помощью односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) статистический тест, сравните различия в средний процент клеточной мембраны расширений среди различных тестовых типов клеток.

2. приклеивание Assay

1. Поддерживать SW-13, SW-нео и SW-DKK3 клетки в стандартной увлажненные инкубатора в 37.0 ° C и 5% CO₂ в среднего роста.
   1. С помощью Горяева, рассчитывать и пластины 100000 клеток SW-13, SW-нео и SW-DKK3 за хорошо в отдельные пластины 6-Ну и расти на ночь в среднего роста.
   2. Протестированы семян 6-ну пластины для каждого типа клеток, используя одну плиту для каждой из 6 точек назначенное время испытания ниже.
      Примечание: Время может различаться для различных типов клеток.
2. После ночи инкубации вымыть клетки с теплой PBS один раз, а затем добавить 0,5 мл 1 x неферментативного клеток диссоциации решение каждой скважины.
   1. Вихрем пластину распространить решение диссоциации клеток. Аспирационная пластину назначенный в определенное время точках (т.е., 1, 2, 3, 5, 10 и 15 мин) и затем смывают теплым раствором PBS 1 мл три раза.
   2. Между моет аккуратно коснитесь пластины для отсоединения слабо прилагаемый клетки.
3. Аспирационная оставшиеся PBS и исправить остальные клетки прилагается к пластине с 1 мл раствора формальдегида 3,7% за 10 мин.
4. Запятнать клетки с 1 мл 0,05% фиолетовый кристалл для 30 минут, затем промыть избыточного красителя с 1 мл деионизованной воды. Титруйте мыть содействовать визуализации ячейки.
   Примечание: В зависимости от уровня поглощения краски, несколько дополнительных мойки могут быть необходимы для содействия визуализации ячейки.
5. С помощью световой микроскоп на 100 крат, количество оставшихся придает ячейки в каждой скважине для каждой пластины.
   Примечание: Использование транспарентных правителей или маркировки тонкой ручкой направляющих на нижней стороне пластины поможет избежать повторного подсчета же клеток.
6. Определите среднее количество вложенных ячеек на хорошо для каждой пластины.
7. Сравните скорость отряда ячейки между SW-13, SW-нео и SW-DDK3 клетки за определенный период времени с помощью двухсторонней статистического теста ANOVA.

Результаты

Используя выше анализов, эффекты Сверхэкспрессия DKK3 на расширение морфологии клеток и клеток адгезионные свойства были протестированы в установленных АКК клеточная линия SW-13, в пробирке. Клеток, экспрессирующих DKK3 вызвал стабильно transfecting SW-13 клетки с Myc-DDK тегами ...

Обсуждение

Здесь мы описываем в vitro количественный метод для характеристики клеток расширения с легкостью, несколько Пит Фолс и надежный воспроизводимости результатов, которые могут применяться для различных условий теста. Кроме того простой, количественно адгезии и/или подвижности анализ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin
Deulbeco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	1X solution, used directly
3.7% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute stock solution
0.05% crystal violet	Harleco	192-12	Dilute stock solution
De-ionized water	NA	NA	NA
Microscope with 400X magnification	NA	NA	NA
6-well plates	Corning	353046	NA
Cell dissociation solution non-enzymatic 1X	Sigma-Aldrich	C5914	1X solution, used directly