Caractérisation des Extensions de la Membrane cellulaire et d’étudier leur rôle dans le Cancer Cell Adhesion dynamique

Résumé

Cette étude démontre l’utilité et la facilité de la mesure d’extension quantitative de membrane cellulaire et sa corrélation avec la capacité adhésive des cellules. Comme un exemple représentatif, nous montrons ici que Dickkopf-protéine 3 (DKK3) favorise la formation de lobopodia accrue et l’adhérence cellulaire dans le corticosurrénalome cellules in vitro.

Résumé

Répertoire d’extension de la membrane de la cellule module divers comportements malignes des cellules cancéreuses, y compris leurs potentiels d’adhésif et migrateurs. La capacité avec précision, classer et quantifier des extensions de la cellule et mesurer l’effet sur la capacité adhésive de la cellule est jugés essentielle pour déterminer comment signalisation cellulaire événements incidence du cancer cell comportement et agressivité. Nous décrivons ici la in vitro la conception et l’utilisation d’une cellule extension quantification méthode conjointement avec un test de capacité d’adhérence un modèle établi in vitro de corticosurrénalome (ACC). Plus précisément, nous testons les effets de DKK3, un suppresseur de tumeur présumée et un facteur de différenciation favorable, sur le phénotype d’extension de membrane d’une lignée cellulaire ACC, SW-13. Nous proposons ces dosages à fournir relativement simple, fiable et facilement interprétable métriques à mesure ces caractéristiques dans des conditions expérimentales différentes.

Introduction

Dysregulated WNT signaling joue un rôle essentiel dans la corticosurrénale malignités¹. Les méthodes utilisées dans cette étude étudient si silencieux de DKK3, un régulateur négatif de signalisation WNT, représente un événement de dédifférenciation dans le cortex surrénal et favorise la formation de tumeurs dans le contexte des changements de répertoire de cellule-extension. DKK3 est un 38 kDa sécrétée glycoprotéine avec un peptide signal de N-terminal et études antérieures ont démontré que son expression forcée a abouti à l’arrêt du cycle cellulaire, inhibe le comportement agressif de malin et inversé épithéliale-mésenchymateuse transition².

Le comportement malin de corticosurrénalome (ACC) et d’autres cancers est, en partie influencé par la capacité des cellules tumorales pour s’interfacer avec les surfaces environnantes, y compris la matrice extracellulaire, ce qui facilite à son tour l’invasion des cellules tumorales et ³de migration. Le rôle de membrane de cellules spécifiques figurant dans la progression du cancer est plus en plus démontré dans des contextes variés, principalement par le biais de la formation des filopodes. Par exemple, la surexpression des canaux calciques de type L s’est avérée d’induire la formation de filopodes et promouvoir la tumeur cellulaire invasion⁴. De même, Fascin, une protéine de liaison au minimum l’actine exprimée dans les tissus normaux, est également surexprimée dans les cellules cancéreuses en liaison avec les filopodes formation⁵. Lobopodia formation permet des fibroblastes non malignes migrer efficacement par le biais de la matrice extracellulaire, cependant, il a été démontré que les cellules de Fibrosarcome s’appuient sur métalloprotéinase activité remplace lobopodia pour faciliter la migration cellulaire et invasion,⁶. Nous avons montré que la tumeur suppresseurs, y compris les Ras association domaine familial 1 isoforme un (RASSF1A) et DKK3, peut fonctionner pour modifier les éléments du cytosquelette et favorisent la formation de lamellipodia et bloquer des propriétés invasives^7,8.

Par conséquent, il est essentiel pour caractériser les effets des gènes impliqués dans la carcinogenèse et leur relation avec les altérations d’extension de membrane cellulaire, évaluant spécifiquement formation filopodes, lobopodia et lamellipodia dans des conditions de test. Les techniques actuelles de state-of-the art comprennent l’utilisation de méthodes de microscopie de plus en plus sophistiqués, le marquage fluorescent ou algorithmes informatiques complexes pour l’acquisition de données et l’interprétation. Bien que ces méthodes offrent de nouveaux et puissants outils d’analyse, leur complexité limite leur utilisation généralisée et l’adaptabilité dans des expériences de biologie cellulaire. En outre, la quantification précise et l’observation des changements dans la morphologie cellulaire extension n’est pas généralement mesurées^9,10. En revanche, nous présentons ici une technique qui quantifie précisément les altérations d’extension de cellules à l’aide de techniques microscopiques standard et méthodes facilement adaptable en vitro . Ces méthodes également quantifier chaque type d’extension cellule simultanément pour chaque cellule analysée et déterminent les changements globaux dans le répertoire d’extension de membrane cellulaire. Nous montrons aussi comment ces changements peuvent se rapporter à des propriétés d’adhérence cellulaire.

À titre d’exemple expérimental, nous utiliserons une lignée de cellules préalablement créé de SW-13, désigné SW-DDK3, qui a été solidement transfectées avec des vecteurs de plasmide pCMV6-entrée/DKK3 et constitutivement risque DKK3, un facteur de différenciation dans la glande surrénale. Les cellules non transfectées de SW-13 et SW-13 cellules stablement transfectées avec un vecteur vide (entrée pCMV6), désigné SW-Neo, servira de contrôles expérimentaux.

Protocole

1. caractéristiques de l’Extension des cellules

1. Maintenir SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 des cellules dans un incubateur humidifié standard à 37,0 ° C et 5 % de CO₂ dans un milieu d’Eagle modifié de Dulbecco additionné de sérum de veau fœtal 10 % et de 10 000 U/mL de pénicilline et de streptomycine (désignée comme « moyenne de croissance »).
   1. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaque 5 000 cellules / puits pour SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 lignes en plaques 6 puits distinctes et se développent pendant la nuit dans le milieu sur couvre-objet en verre stérile.
2. Après la croissance durant la nuit, pour chaque puits, aspirer le milieu de croissance, laver les cellules avec 1 mL de chaude solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et puis fixer les cellules avec 1 mL de 3,7 % de formaldéhyde pendant 10 min.
3. Aspirer les cellules formaldéhyde et tache dans chaque puits avec 1 mL de violet de gentiane 0.05 % pour 30 min. excès de lavage colorant loin à l’aide de trois lavages de 1 mL d’eau désionisée.
   Remarque : Selon le niveau d’absorption du colorant, plusieurs lavages supplémentaires peuvent être nécessaire pour enlever le fond de coloration pour promouvoir la visualisation de la cellule.
   1. À l’aide de pinces à pointe fine, récupérer des lamelles couvre-objet et placez-les face vers le bas sur une lame de verre étiquetées avec une goutte de réactif montage clair.
4. Sous un microscope optique, choisir au hasard 20 vues des cellules ne se chevauchent de chaque lamelle couvre-objet pour le dosage d’extension cellulaire.
   1. Prendre photomicrographies grossissement 400 x de chaque champ de vision. Directement de compter le nombre de chaque type d’extension pour chacune des 20 cellules représentatives.
      Remarque : à ce titre, 20 cellules isolées doivent être examinées pour chaque condition testée garantir des résultats fiables. Filopodes ont été définis par les extensions de cellulaires avec une base de 5 microns ou moins et d’un seul sommet. Lobopodia ont été définis par les extensions de cellulaires avec une base de 5 à 20 microns de longueur contenant des extensions avec apex multiples. Lamellipodia ont été définis par les extensions de cellule qui sont supérieures à 20 microns de longueur, avec ou sans apex. Selon le type de cellules testées, les tailles de prolongements cellulaires peuvent différer et nécessitent raffinement d’identifier les paramètres.
5. Déterminer le nombre moyen de chaque extension de cellules dans chaque type de cellule (c.-à-d., SW-13, Neo-SW, SW-DDK) à travers les 6 puits examinés.
6. À l’aide d’un test statistique de l’analyse de variance (ANOVA), comparer les différences dans le pourcentage moyen des extensions de la membrane cellulaire entre les types de cellules différents test.

2. adhésion Assay

1. Maintenir SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 des cellules dans un incubateur humidifié standard à 37,0 ° C et 5 % de CO₂ dans le milieu.
   1. Utilisant un hémocytomètre, compter et plaque 100 000 cellules de SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 / puits dans les plaques 6 puits distinctes et se développer pendant la nuit dans le milieu.
   2. Plaques 6 puits semences pour chaque type de cellule testé, à l’aide d’une plaque pour chacun des 6 points désignés de temps testés ci-dessous.
      Remarque : Les points dans le temps peuvent varier pour différents types de cellules.
2. Après une nuit d’incubation, laver les cellules avec du PBS chaud une fois puis ajouter 0,5 mL de solution de dissociation cellulaire non-enzymatique 1 x dans chaque puits.
   1. Agiter la plaque pour diffuser la solution de dissociation cellulaire. Aspirer la plaque désignée à des moments définis (c.-à-d., 1, 2, 3, 5, 10 et 15 min) et laver ensuite avec 1 mL de solution PBS chaud trois fois.
   2. Entre les lavages, secouer doucement les plaques pour détacher les cellules faiblement attachées.
3. Aspirer les éventuels PBS et fixer les cellules restant fixés à la plaque avec 1 mL de 3,7 % de formaldéhyde pendant 10 min.
4. Colorer les cellules avec 1 mL de violet de gentiane 0.05 % pendant 30 min puis lavez colorant excédentaire avec 1 mL d’eau désionisée. Titrer lavage pour promouvoir la visualisation de la cellule.
   Remarque : Selon le niveau d’absorption du colorant, plusieurs lavages supplémentaires peuvent être nécessaire pour promouvoir la visualisation de la cellule.
5. À l’aide d’un microscope optique avec grossissement de 100 x, compter les cellules jointes restantes dans chaque puits pour chaque plaque.
   Remarque : Utilisation de règles transparentes ou guides de plume fine sur le côté inférieur de la plaque de marquage permettra pour éviter les comptages répétés des cellules mêmes.
6. Déterminer le nombre moyen de cellules attachées par puits pour chaque plaque.
7. Comparer le taux de détachement cellulaire entre SW-13, SW-Neo et SW-DDK3 cellules au cours de la période définie à l’aide d’un test bilatéral de statistique ANOVA.

Résultats

En utilisant les tests ci-dessus, les effets de la surexpression de la DKK3 sur la morphologie cellulaire extension et propriétés d’adhérence cellulaire ont été testés dans la lignée du CAC établie SW-13, in vitro. Les cellules surexprimant DKK3 ont été générés par stablement transfectants SW-13 cellules avec Myc-DDK étiqueté pCMV6-entrée/DKK3 plasmide vecteur et désigné comme SW-DKK3. De même, cellules stablement transfectées avec le vecteur vide pCMV6-entr...

Discussion

Nous décrivons ici une méthode quantitative in vitro afin de caractériser les extensions de la cellule avec facilité, quelques pièges et reproductibilité fiable qui peut être appliquée pour différentes conditions de test. En outre, essais d’adhésion et/ou la motilité simples, quantifiables peuvent être effectuées simultanément pour mettre en corrélation pouvant avoir une importance fonctionnelle des altérations observées dans les extensions de la membrane cellulaire.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin
Deulbeco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	1X solution, used directly
3.7% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute stock solution
0.05% crystal violet	Harleco	192-12	Dilute stock solution
De-ionized water	NA	NA	NA
Microscope with 400X magnification	NA	NA	NA
6-well plates	Corning	353046	NA
Cell dissociation solution non-enzymatic 1X	Sigma-Aldrich	C5914	1X solution, used directly