Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

Özet

Bu çalışmada yardımcı programı ve kolaylığı nicel hücre zarı uzantısı ölçüm ve hücre yapışkanlı kapasite için onun korelasyon gösterir. Temsil edici bir örnek olarak, biz burada Dickkopf ilgili biraz protein 3 (DKK3) artan lobopodia oluşumu teşvik ve vitroAdrenokortikal Karsinom hücre adhesiveness hücreleri göstermek.

Özet

Hücre zarı'nın uzantısı repertuar onların ya da göçmen potansiyelleri de dahil olmak üzere kanser hücrelerinin çeşitli kötü huylu davranışlar modüle. Nasıl hücre sinyallemesi olayların etkisi kanser hücre davranış ve saldırganlık belirlemek için kritik doğru şekilde sınıflandırmak ve hücre uzantıları ölçmek ve bir hücrenin yapışkanlı kapasitesi üzerindeki etkisini ölçmek için yeteneğidir. Burada, vitro tasarım ve bir hücre uzantısı quantification yöntemiyle birlikte kurulan vitro modelinde bir yapışma kapasite tahlil Adrenokortikal Karsinom (ACC) için kullanımını açıklar. Özellikle, DKK3, sözde Tümör baskılayıcı ve bir yanlısı farklılaşma faktörü üzerine etkileri membran uzantısı fenotip ACC hücre satırının SW-13 test ediyoruz. Biz nispeten basit, güvenilir sağlamak için bu deneyleri teklif ve kolay yorumlanabilir ölçümleri bu özellikleri çeşitli deneysel koşullarda ölçer.

Giriş

Dysregulated WNT sinyal Adrenokortikal maligniteler¹' de kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışmada kullanılan yöntemleri DKK3 susturmak, WNT sinyal, negatif bir regülatör adrenal korteks dedifferentiation olayını temsil eder ve bağlamında tümör oluşumu hücre-uzantı repertuar değişir teşvik olup olmadığını araştırmak. DKK3 38 kDa ile bir N-terminal sinyal peptid glikoprotein salgılanan ve önceki çalışmalar zorunlu ifadesini hücre döngüsü tutuklama sonuçlandı, saldırgan kötü huylu davranış inhibe ve Mezenkimal epitel ters göstermiştir olduğunu geçiş².

Adrenokortikal Karsinom (ACC) ve diğer kanser Malign davranışını tümör hücreleri çevreleyen yüzeyler ile arayüz yeteneği etkisinde bölümünde sırayla tümör hücre işgali kolaylaştırır hücre dışı matriks dahil olmak üzere ve geçiş³. Öncelikle filopodia oluşumu ile çeşitli bağlamlarda belirli hücre zarı kanseri ilerleme uzantılarında rolünün giderek gösterilen. Örneğin, overexpression L tipi kalsiyum kanal filopodia oluşumu teşvik ve tümör hücre işgali⁴teşvik bulundu. Benzer şekilde, Fascin, en az bağlayıcı protein bağlıdır bir aktin dokusu normal ifade de kanser hücrelerinin filopodia oluşumu⁵ile birlikte overexpressed mevcuttur. Lobopodia oluşumu sağlar etkili ekstra hücresel matris ile geçirmek non-Malign fibroblastlar, Fibrosarkom hücreleri metalloproteinaz etkinliği hücre geçişi kolaylaştırmak için lobopodia yerine itimat gösterilmiştir ancak, ve istila⁶. Biz o tümörü göstermiştir bastırıcılarının Ras Derneği etki alanı aile 1 izoformu (RASSF1A) de dahil olmak üzere ve DKK3, hücre iskeleti öğeleri değiştirebilir ve lamellipodia oluşumu teşvik ve invaziv özellikleri^7,8taş koymak için işlev görebilir.

Bu nedenle, bu genlerin karsinojenezis ve hücre zarının uzantısı değişiklikler, özellikle filopodia, lobopodia ve lamellipodia oluşumu test koşullarında değerlendirilmesi ile ilişkilerini katılan etkileri karakterize etmek için önemlidir. Geçerli state-of-art teknikleri veri toplama ve yorumu giderek karmaşık mikroskobu yöntemleri, floresan etiketleme ve/veya karmaşık bilgisayar algoritmaları kullanımını içerir. Bu yöntemler yeni ve güçlü analitik araçlar sağlarken, kendi karmaşıklığı onların yaygın kullanımı ve adaptasyon hücre biyolojisi deneylerde sınırlar. Ayrıca, kesin miktar ve hücre uzantısı Morfoloji değişimler gözlenmesi değil genellikle ölçülen^9,10. Buna ek olarak, biz doğru bir şekilde standart mikroskobik teknikler ve kolayca adapte vitro yöntemleri kullanarak hücre uzantısı değişiklikler quantifies bir teknik tanıtmak. Bu yöntemler aynı zamanda her hücre uzantı türü aynı anda her hücre analiz için sayısal ve hücre zarının uzantısı repertuar genel değişiklikleri belirlemek. Biz de nasıl bu değişiklikler hücre adezyon özellikleri için ilgili olabilir gösterir.

Deneysel örnek olarak, önceden oluşturulmuş hücre kültürünü SW-13, SW-DDK3, stabil pCMV6-giriş/DKK3 plazmid vektörleri ile transfected ve yapısal DKK3, böbrek üstü bezi bir farklılaştırıcı faktör overexpresses belirlenmiş kullanacağız. Sigara transfected SW-13 hücreleri ve stabil SW-Neo, belirlenmiş boş ile vektör (pCMV6-giriş), transfected SW-13 hücreleri deneysel denetimler olarak görev yapacak.

Protokol

1. hücre uzantısı özellikleri

1. SW-13, SW-Neo ve CO₂ ' Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 fetal sığır serum ve 10.000 U/mL penisilin ve streptomisin ('büyüme aracı olarak' belirlenmiş) ile desteklenmiş bir standart oksijen kuluçka 37,0 ° C'de ve %5 SW-DKK3 hücreleri korumak.
   1. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve iyi SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 hat başına 5000 hücre ayrı 6-şey kalıplara plaka ve gecede büyüme aracı olarak steril cam coverslips üzerinde büyür.
2. Her şey için gecede büyüme Aspire edin sonra büyüme orta, hücreleri 1 mL sıcak fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın ve hücreleri % 3.7 formaldehit 10 dk 1 mL ile düzeltin.
3. Her şey ile 1 mL % 0.05 kristal Menekşe 30 dk. yıkama aşırı aspiratı formaldehit ve leke hücrelerinde uzak üç yıkama 1 mL deiyonize su kullanarak boya.
   Not: boya alımı düzeyine bağlı olarak, birkaç ek yıkar hücre görselleştirme tanıtmak için boyama arka plan çıkarmak için gerekli olabilir.
   1. İnce uçlu forseps kullanarak, coverslips almak ve yüzü aşağı bir damla temiz montaj reaktif etiketli cam Slayttaki yer onları.
4. Işık mikroskobunda rastgele her coverslip hücre uzantısı tahlil için hücrelerin üst üste 20 sayısı seçin.
   1. Photomicrographs her görüş alanı 400 x büyütme oranında al. Doğrudan uzantısı türlerinin her biri 20 temsilcisi hücreleri için saymak.
      Not: Bu nedenle, güvenilir sonuçlar alabilmek sınanan her koşul için 20 izole hücreler incelenmesi gerekir. Filopodia 5 mikron veya daha az bir üs ve tek bir tepe ile hücresel uzantıları tarafından tanımlanan. Lobopodia bir üs 5 ila 20 mikron, birden çok apices uzunluğu içeren uzantıları ile hücresel uzantıları tarafından tanımlanan. Lamellipodia 20 mikron uzunluğunda olan veya olmayan apices daha büyük hücre uzantıları tarafından tanımlanan. Test edilmiş hücre türüne bağlı olarak hücre uzantıları boyutları farklı olabilir ve parametreleri tanımlama arıtma gerektirebilir.
5. Her hücre türü (Yani, SW-13, SW-Neo, SW-DDK) her hücre uzantısında muayene 6 kuyular arasında belirlemek.
6. Bir tek yönlü Varyans analizi (ANOVA) istatistiksel test kullanarak, hücre zarının uzantıları farklı test hücre tipleri arasında ortalama yüzdesini farklılıkları karşılaştırın.

2. yapışma tahlil

1. SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 hücreleri 37,0 ° C ve % 5 CO₂ büyüme orta'de standart bir oksijen kuluçka korumak.
   1. Bir hemasitometre kullanarak, say ve iyi başına 100.000 hücre SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 ayrı 6-şey kalıplara plaka ve gecede büyüme ortamında büyümek.
   2. Her biri aşağıda test 6 belirlenen zaman puan için bir tabak kullanarak tohum 6-şey plakaları her hücre türü için test.
      Not: Zaman Puan farklı hücre tipleri için farklı olabilir.
2. Gecede kuluçka sonra sıcak PBS bir kez yıkama hücrelerle sonra her şey için 0.5 mL 1 x enzimatik olmayan hücre ayrılma çözümü ekleyin.
   1. Hücre ayrılma çözümü yaymak için plaka girdap. Tanımlanan zaman noktaları (Yani, 1, 2, 3, 5, 10 ve 15 dk) belirlenen plaka Aspire edin ve sonra üç kez 1 mL sıcak PBS solüsyon ile yıkayın.
   2. Yıkama arasında hafifçe gevşek bağlı hücreler ayırmak plakalara dokunun.
3. Kalan PBS ve kalan hücreleri ile 1 mL % 3.7 formaldehit 10 min için plaka bağlı düzeltme Aspire edin.
4. 1 mL % 0.05 kristal Menekşe 30 dk için hücrelerle leke sonra aşırı boya uzak 1 mL deiyonize su ile yıkayın. Hücre görselleştirme tanıtmak için yıkama titre.
   Not: boya alımı düzeyine bağlı olarak, birkaç ek yıkar hücre görselleştirme tanıtmak için gerekli olabilir.
5. 100 x büyütme hafif bir mikroskop kullanarak, her şey her tabak içinde kalan ekli hücreleri saymak.
   Not: Saydam cetvelleri veya ince kalem kılavuzları plaka alt tarafında işaretleme kullanımı tekrarlanan aynı hücreleri sayma önlemek için yardımcı olacaktır.
6. Her plaka için iyi başına bağlı hücre ortalama sayısını belirleyin.
7. SW-13, SW-Neo ve SW-DDK3 hücreleri arasında hücre dekolmanı kullanarak iki yönlü ANOVA istatistiksel test belirli bir dönem içinde oranı karşılaştırın.

Sonuçlar

Yukarıdaki deneyleri kullanarak, hücre uzantısı morfoloji ve hücre adezyon özellikleri DKK3 overexpression etkileri kurulan ACC hücre hattında SW-13, vitrotest edildi. DKK3 overexpressing hücreleri stabil Myc-DDK etiketli pCMV6-giriş/DKK3 plazmid Vektörler ve SW-DKK3 belirlenmiş hücrelerle SW-13 transfecting tarafından üretildi. Benzer şekilde, stabil boş vektör pCMV6-giriş ile transfected hücreleri transfection ve passaging denetimi olarak oluşturulan ve SW-...

Tartışmalar

Burada hücre uzantıları kolaylığı, birkaç çukur-falls ve çeşitli test koşulları uygulanabilir güvenilir tekrarlanabilirlik ile karakterize bir vitro nicel yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, basit, ölçülebilir yapışma ve/veya hareketliliği deneyleri fonksiyonel önemini potansiyel: hücre zarı uzantılarında gözlenen değişiklikler ilişkilendirmek için aynı anda gerçekleştirilebilir.

Ancak, bu yöntemlerin olası bazı sınırlamalar takdim edebilir miyim...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin
Deulbeco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	1X solution, used directly
3.7% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute stock solution
0.05% crystal violet	Harleco	192-12	Dilute stock solution
De-ionized water	NA	NA	NA
Microscope with 400X magnification	NA	NA	NA
6-well plates	Corning	353046	NA
Cell dissociation solution non-enzymatic 1X	Sigma-Aldrich	C5914	1X solution, used directly