Caracterização de extensões da membrana celular e estudando seus papéis na dinâmica de adesão celular câncer

Resumo

Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.

Resumo

Repertório de extensão da membrana celular modula vários comportamentos malignos das células cancerosas, incluindo seus potenciais de adesivo e migratórias. A capacidade de precisão de classificar e quantificar as extensões de célula e medir o efeito sobre a capacidade adesiva da célula é fundamental para determinar como célula-sinalização de eventos impacto câncer célula comportamento e agressividade. Aqui, descrevemos em vitro concepção e utilização de um celular extensão quantificação método em conjunto com um ensaio de capacidade de aderência em um modelo estabelecido em vitro para carcinoma adrenocortical (ACC). Especificamente, nós testamos os efeitos da DKK3, um supressor de tumor putativo e um fator de pró-diferenciação, sobre o fenótipo de extensão de membrana da linha celular ACC, SW-13. Propomos estes ensaios para fornecer relativamente simples, confiável e facilmente interpretável métricas para as medidas estas características sob diferentes condições experimentais.

Introdução

Dysregulated WNT sinalização desempenha um papel crítico na malignidades adrenocortical¹. Os métodos utilizados neste estudo investigam se silenciar de DKK3, um regulador negativo de sinalização WNT, representa um evento de quê no córtex adrenal e promove a formação de tumor no contexto de alterações de repertório de célula-extensão. DKK3 é um 38 kDa secretado glicoproteína com um peptídeo sinal do N-terminal e estudos anteriores demonstraram que sua expressão forçada resultou na detenção do ciclo celular, inibiu o comportamento agressivo do maligno e invertida epitelial-mesenquimal transição².

O comportamento maligno do carcinoma adrenocortical (ACC) e outros tipos de câncer é, em parte, influenciada pela capacidade de células tumorais para fazer a interface com as superfícies circundantes, incluindo a matriz extracelular, que por sua vez facilita a invasão de células do tumor e migração de³. O papel das extensões específicas de membrana celular na progressão do câncer é cada vez mais sendo demonstrado em diversos contextos, principalmente através da formação de filopodia. Por exemplo, foi encontrado para induzir a formação de filopodia e promover de invasão de células de tumor⁴superexpressão dos canais de cálcio tipo L. Da mesma forma, Fascin, um ligação proteína minimamente o actínio expressa em tecido normal, é também Blumental em células cancerosas em associação com filopodia formação⁵. Lobopodia formação permite que não-malignas fibroblastos efetivamente migrar através da matriz extra-celular, no entanto, tem sido demonstrado que células de Fibrossarcoma dependem de metaloproteinase atividade substituem lobopodia para facilitar a migração celular e invasão de⁶. Mostramos esse tumor supressores, incluindo Ras Associação domínio família 1 isoform um (RASSF1A) e DKK3, pode funcionar para alterar elementos do citoesqueleto e promover a formação de lamellipodia e obste Propriedades invasivas^7,8.

Como tal, é fundamental para caracterizar os efeitos de genes envolvidos na carcinogênese e sua relação com alterações de extensão da membrana celular, avaliando especificamente a formação filopodia, lobopodia e lamellipodia sob condições de teste. Atual estado da arte técnicas incluem o uso de métodos cada vez mais sofisticados de microscopia, etiquetando fluorescente e/ou algoritmos de computador complexo para aquisição de dados e interpretação. Enquanto esses métodos fornecem novas e poderosas ferramentas analíticas, sua complexidade limita sua utilização generalizada e adaptabilidade em experimentos de biologia celular. Além disso, a quantificação precisa e observação de alterações na morfologia de extensão de célula não é normalmente medido^9,10. Em contrapartida, apresentamos aqui uma técnica que quantifica com precisão alterações de extensão de célula usando técnicas padrão microscópicas e facilmente adaptável em vitro métodos. Esses métodos também quantificar cada tipo de extensão de células simultaneamente para cada célula analisado e determinar mudanças gerais no repertório de extensão da membrana celular. Também mostramos como essas alterações podem se relacionar Propriedades de adesão celular.

Como um exemplo experimental, vamos usar uma linha de celular criado anteriormente de SW-13, designado SW-DDK3, que tem sido estàvel transfected com vetores de plasmídeo pCMV6-entrada/DKK3 e constitutivamente overexpresses DKK3, um factor diferenciador na glândula adrenal. Non-transfectadas SW-13 células e células SW-13 estàvel transfectadas com vetor vazio (pCMV6-entrada), designado SW-Neo, servirá como controles experimentais.

Protocolo

1. célula características de extensão

1. Manter SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 células em uma padrão incubadora umidificada 37,0 ° c e 5% de CO₂ em meio de águia de Dulbecco modificado suplementado com 10% de soro fetal bovino e 10.000 de U/mL penicilina e estreptomicina (designado como 'meio de crescimento').
   1. Contar as células usando um hemocytometer e placa de 5.000 células por poço para SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 linhas em chapas separadas 6-poços e cresce durante a noite no meio de crescimento as lamelas de vidro estéril.
2. Depois de crescimento durante a noite, para cada poço, Aspire o meio de crescimento, lavar as células com 1 mL de quente fosfato salino (PBS) e em seguida fixar as células com 1 mL de formaldeído de 3,7% por 10 min.
3. Aspirado de formaldeído e mancha de células em cada poço com 1 mL de violeta de cristal de 0.05% por 30 min. excesso de lavagem tingem usando três lavagens de 1 mL de água desionizada.
   Nota: Dependendo do nível de absorção de corante, várias lavagens adicionais podem ser necessários para remover a coloração para promover a visualização de célula de plano de fundo.
   1. Usando a pinça com ponta fina, recuperar as lamelas e colocá-los face para baixo sobre uma lâmina de vidro rotulado com uma gota de reagente de montagem clara.
4. Sob um microscópio de luz, escolha aleatoriamente 20 visualizações de células não-sobreposição de cada lamela para o ensaio de extensão de célula.
   1. Leve fotomicrografias ampliação de 400 x de cada campo de visão. Conte diretamente o número de cada tipo de extensão para cada uma das 20 células representativas.
      Nota: como tal, 20 células isoladas devem ser examinadas para cada condição testada garantir resultados confiáveis. Filopodia foram definidos por extensões celulares com uma base de 5 mícrons ou menos e um único vértice. Lobopodia foram definidos por extensões celulares com uma base de 5 a 20 microns de contendo extensões de comprimento com vários ápices. Lamellipodia foram definidos por extensões de célula que são superiores a 20 mícrons de comprimento e com ou sem ápices. Dependendo do tipo de célula testado, os tamanhos das extensões de célula podem ser diferentes e podem exigir o refinamento de identificar parâmetros.
5. Determine o número médio de cada extensão de célula em cada tipo de célula (i.e., SW-13, Neo-SW, SW-DDK) através dos 6 poços examinados.
6. Usando um teste estatístico unidirecional análise de variância (ANOVA), compare as diferenças no percentual médio de extensões da membrana celular entre os teste diferentes tipos de células.

2. adesão ensaio

1. Manter SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 células numa incubadora umidificado padrão no 37,0 ° C e 5% CO₂ em meio de crescimento.
   1. Usando um hemocytometer, contar e placa 100.000 células de SW-13 e Neo-SW SW-DKK3 por bem em chapas separadas 6-poços e crescer durante a noite, no meio de crescimento.
   2. Placas de 6 boas sementes para cada tipo de célula testaram, usando uma placa para cada um dos 6 pontos designados tempo testados abaixo.
      Nota: Os pontos de tempo podem variar para diferentes tipos de células.
2. Após a incubação durante a noite, lavar as células com PBS quente uma vez, em seguida, adicionar 0,5 mL de solução de dissociação de célula não-enzimática de 1x a cada poço.
   1. Agite a placa para espalhar a solução de dissociação de célula. Aspirar a placa designada em pontos de tempo definido (isto é, 1, 2, 3, 5, 10 e 15 min) e em seguida lavar com 1 mL de solução de PBS quente três vezes.
   2. Entre lavagens, bata levemente as placas para desanexar células frouxamente anexadas.
3. Aspire qualquer restantes PBS e fixar as células restantes anexadas à placa com 1 mL de formaldeído de 3,7% por 10 min.
4. Mancha de células com 1 mL de violeta de cristal de 0.05% por 30 min, em seguida, lave o corante em excesso com 1 mL de água desionizada. Titula-se lavagem para promover a visualização da célula.
   Nota: Dependendo do nível de absorção de corante, várias lavagens adicionais podem ser necessários para promover a visualização da célula.
5. Usando um microscópio de luz, ampliação de 100 x, conte as células restantes anexadas em cada poço para cada placa.
   Nota: Uso de réguas transparentes ou marcar guias caneta fina no lado inferior da placa irá ajudar a evitar a repetida contagem das mesmas células.
6. Determine o número médio de células anexados por bem para cada placa.
7. Compare a taxa de desprendimento de célula entre 13-SW, SW-Neo e SW-DDK3 células durante o período de tempo determinado usando um teste estatístico de ANOVA nos dois sentidos.

Resultados

Os efeitos da superexpressão de DKK3 na célula extensão morfologia e propriedades de aderência de célula usando os ensaios acima, foram testados na linha celular estabelecida ACC SW-13, em vitro. Células superexpressão DKK3 foram geradas por estàvel transfecting SW-13 células com Myc-DDK etiquetado plasmídeo pCMV6-entrada/DKK3 vectores e designado como SW-DKK3. Da mesma forma, células estàvel transfectadas com vetor vazio pCMV6-entrada foram criadas como um controle d...

Discussão

Aqui nós descrevemos um em vitro método quantitativo para caracterizar as extensões de células com facilidade, algumas armadilhas e reprodutibilidade confiável que pode ser aplicada para as várias condições de teste. Além disso, ensaios de aderência e/ou motilidade simples e quantificáveis podem ser executados simultaneamente para correlacionar o potencial significado funcional das alterações observadas nas extensões da membrana celular.

No entanto, estes métodos podem ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin
Deulbeco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	1X solution, used directly
3.7% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute stock solution
0.05% crystal violet	Harleco	192-12	Dilute stock solution
De-ionized water	NA	NA	NA
Microscope with 400X magnification	NA	NA	NA
6-well plates	Corning	353046	NA
Cell dissociation solution non-enzymatic 1X	Sigma-Aldrich	C5914	1X solution, used directly