אפיון של קרום התא הרחבות ולימוד תפקידיהם סרטן התא אדהזיה דינמיקה

Summary

מחקר זה מדגים את השירות ואת קלות מדידה הרחבה כמותית קרום התא שלה מתאם קיבולת דבק של תאים. בתור דוגמא מייצגת, אנחנו מראים כאן את הפרוטאין הקשורות Dickkopf 3 (DKK3) מעודד היווצרות מוגברת lobopodia תא adhesiveness ב adrenocortical קרצינומה של תאים במבחנה.

Abstract

הרחבת רפרטואר קרום התא של ממיקרו התנהגויות ממאירים שונים של תאים סרטניים, כולל פוטנציאל דבק, הנדידה שלהם. היכולת במדויק לסווג, לכמת תא הרחבות, למדוד את ההשפעה על קיבולת דבק של התא חיוני לקבוע איך איתות התא בהתנהגות התא סרטן ההשפעה של אירועים, תוקפנות. כאן, אנו מתארים את עיצוב במבחנה ואת השימוש תא סיומת כימות שיטה בשיתוף עם assay קיבולת אדהזיה במודל הוקמה במבחנה adrenocortical קרצינומה (ACC). באופן ספציפי, אנו לבחון את ההשפעות של DKK3, מדכאי בשם ולא גורם פרו-בידול, על פנוטיפ סיומת הממברנה של הקו הסלולרי ACC, SW-13. אנו מציעים מבחני אלה כדי לספק פשוטה יחסית, אמין, מדדים interpretable בקלות כדי מודד את המאפיינים הבאים בתנאים שונים ניסיוני.

Introduction

חגיגת Dysregulated איתות ממלא תפקיד קריטי ממאירות adrenocortical¹. בין השיטות במחקר זה לחקור אם להחרשת DKK3, מווסת שלילי של חגיגת איתות, מייצג אירוע dedifferentiation בקליפת יותרת הכליה ומעודדת היווצרות הגידול בהקשר של התא-הרחבת רפרטואר שינויים. DKK3 הוא kDa 38 מופרש גליקופרוטאין עם פפטיד האות N-מסוף מחקרים קודמים הדגימו כי ביטויה נאכפים, גרמו מחזור מעצר התא עכבות התנהגות תוקפנית ממאיר, הפוך אפיתל-mesenchymal מעבר².

ההתנהגות ממאיר של קרצינומה של adrenocortical (ACC) ואת סוגי סרטן אחרים, בחלק, מושפע את היכולת של תאים סרטניים ממשק עם המשטחים שמסביב, כולל של מטריצה חוץ-תאית, אשר בתורו מקלה על גידול התא הפלישה, הגירה³. תפקידו של קרום התא הספציפי של הרחבות בהתקדמות סרטן הוא להיות הפגינו יותר ויותר בהקשרים שונים, בעיקר דרך היווצרות של filopodia. לדוגמה, ביטוי של תעלות סידן מסוג L נמצאה זירוז היווצרות filopodia ולקדם גידול התא הפלישה⁴. באופן דומה, תמונה מרתקת, אקטין מחייב חלבון מינימלית לידי רקמה נורמלית, היא גם overexpressed בתאי סרטן בשיתוף עם היווצרות filopodia⁵. היווצרות Lobopodia מאפשרת fibroblasts שאינם ממאירים להעביר ביעילות דרך המטריקס הסלולר במיוחד, עם זאת, הוכח כי fibrosarcoma תאים להסתמך על פעילות מטאלופרוטאז במקום lobopodia כדי להקל על נדידת תאים ו הפלישה⁶. הראינו את הגידול הזה מדכאי, כולל ראס האגודה תחום המשפחה 1 isoform (RASSF1A), DKK3, יכול פונקציה כדי לשנות אלמנטים cytoskeletal, לקדם היווצרות lamellipodia ו stymie^7,מאפיינים פולשני⁸.

ככזה, חיוני כדי לאפיין את ההשפעות של גנים המעורבים carcinogenesis והקשר שלהן כדי שינויים סיומת קרום התא, במיוחד הערכת היווצרות filopodia, lobopodia ו- lamellipodia בתנאי מבחן. טכניקות המדינה-של-באמנות הנוכחי כוללים את השימוש שיטות מיקרוסקופ משוכללים, תיוג פלורסנט, ו/או מחשב מורכבת אלגוריתמים עבור רכישת נתונים ופרשנות. בעוד ששיטות אלה מספקים כלים אנליטיים חדש ורב עוצמה, המורכבות שלהם מגבילה את השימוש הנרחב שלהם והתאמה של ניסויים בביולוגיה של התא. יתר על כן, כימות מדויק של התבוננות לשינויים תא סיומת מורפולוגיה אינו נמדד בדרך כלל^9,10. לעומת זאת, אנחנו מציגים כאן טכניקה במדויק מכמתת תא סיומת שינויים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיים סטנדרטיים ושיטות בקלות להתאמה במבחנה . שיטות אלה גם לכמת כל סוג סיומת תא בו-זמנית עבור כל תא ניתח וקבע שינויים כוללים בהתאם לדרישה ברפרטואר סיומת קרום התא. אנו גם מראים כיצד שינויים אלו יכולים להתחבר מאפייני אדהזיה תא.

כדוגמה ניסיוני, אנו נשתמש קו תא שנוצרה בעבר של SW-13, איזור SW-DDK3, אשר יש stably transfected עם pCMV6-הכניסה/DKK3 פלסמיד וקטורים צורונים overexpresses DKK3, גורם המבדילים בלוטת יותרת הכליה. Non-transfected SW-13 תאים ותאים SW-13 stably transfected עם וקטור ריק (pCMV6-ערך), המיועד SW-ניאו, ישמש פקדים ניסיוני.

Protocol

1. מאפייני השלוחה תא

1. לשמור על SW-13, SW-Neo ותאים SW-DKK3 ב תקן humidified החממה ב 37.0 ° C ו- 5% CO₂ בינוני נשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% סרום שור בעובר ו 10,000 U/mL פניצילין סטרפטומיצין (יועד 'מדיום הגידול').
   1. לספור תאים באמצעות hemocytometer, צלחת תאים 5,000 לכל בשביל SW-13, SW-Neo וקווים SW-DKK3 לתוך צלחות נפרדות 6-ובכן, גדלים בין לילה במדיום הגידול על coverslips זכוכית סטריליים דקה.
2. לאחר צמיחה לילה, במשך כל, תשאף מדיום הגידול, לשטוף תאים עם 1 מ ל תמיסת מלח חמה באגירה פוספט (PBS) ולאחר מכן לתקן את התאים עם 1 מ"ל של 3.7% פורמלדהיד למשך 10 דקות.
3. פורמלדהיד וביופסיה ותאי כתם לכל היטב עם 1 מ"ל של 0.05% קריסטל סגול במשך 30 דקות לשטוף עודף לצבוע משם באמצעות שלושה שוטף של יונים 1 מ"ל מים.
   הערה: בהתאם לרמת צבע ספיגת, מספר שוטף נוספים עשוי להיות נחוץ כדי להסיר רקע מכתים לקדם ויזואליזציה תא.
   1. בעזרת מלקחיים משופעת בסדר, לאחזר coverslips ולמקם אותם הפנים למטה על משטח זכוכית שכותרתו עם טיפה של ריאגנט הרכבה ברורות.
4. תחת מיקרוסקופ אור, בחר באופן אקראי 20 צפיות של תאים שאינם חופפים כל coverslip עבור תא סיומת וזמינותו.
   1. קח photomicrographs-400 x הגדלה של כל שדה ראייה. ישירות לספור את המספר לכל סוג של סיומת עבור כל התאים נציג 20.
      הערה: ככזה, 20 תאים מבודדים צריך להיבדק עבור כל תנאי שנבדקו להבטיח תוצאות אמינות. Filopodia הוגדרו על ידי הרחבות הסלולר עם בסיס של 5 מיקרון או פחות, של איפקס יחיד. Lobopodia הוגדרו על ידי הרחבות הסלולר עם בסיס של 5 עד 20 מיקרון של הרחבות המכיל אורך עם apices מרובים. Lamellipodia הוגדרו על ידי הרחבות תא שגדולים מ 20 מיקרונים אורך, עם או בלי apices. בהתאם לסוג התא שנבדקו, הגדלים של הרחבות התא עשויים להיות שונים ועשויה עידון של זיהוי הפרמטרים.
5. לקבוע את המספר הממוצע של כל סיומת תא בכל סוג התא (קרי, SW-13, SW-Neo, SW-DDK) על פני הבארות 6 בחן.
6. באמצעות מבחן סטטיסטי חד-כיווני השונות (ANOVA), להשוות הבדלים האחוז הממוצע של קרום התא הרחבות בין סוגי תאים בדיקה שונים.

2. אדהזיה Assay

1. לשמור על SW-13, SW-Neo ותאים SW-DKK3 ב חממה humidified סטנדרטי-37.0 ° C ו- 5% CO₂ במדיום הגידול.
   1. משתמש של hemocytometer, נחשב צלחת 100,000 תאים של SW-13, SW-Neo SW-DKK3 לכל טוב לתוך צלחות נפרדות 6-ובכן, גדלים בין לילה מדיום הגידול.
   2. זרע צלחות. ובכן 6 עבור כל סוג התא בדקה, באמצעות לוח אחד לכל אחד הנקודות הייעודית 6 נבדק מתחת.
      הערה: הנקודות הזמן עשויים להשתנות עבור סוגי תאים שונים.
2. לאחר דגירה לילה, שטיפת תאים עם החמים PBS פעם לאחר מכן להוסיף 0.5 מ ל 1 x תא הלא-אנזימטי דיסוציאציה פתרון טוב לכל.
   1. מערבולת את הצלחת להפיץ את הפתרון דיסוציאציה התא. וארוקן את הצלחת המיועד בנקודות זמן מוגדר (קרי, 1, 2, 3, 5, 10 ו- 15 דקות) ולאחר מכן לשטוף עם פתרון PBS חמים 1 מ ל שלוש פעמים.
   2. בין שוטף, טפח בעדינות את הצלחות להתנתק תאים המחוברים באופן רופף.
3. תשאף כל PBS הנותרים, תיקון התאים הנותרים מחובר לצלחת עם 1 מ"ל של 3.7% פורמלדהיד למשך 10 דקות.
4. כתם תאים עם 1 מ"ל של 0.05% קריסטל סגול במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף את עודף צבע עם 1 מ ל מים יונים. Titrate השטיפה כדי לקדם את התא חזותי.
   הערה: בהתאם לרמת צבע ספיגת, מספר שוטף נוספים עשוי להיות נחוץ כדי לקדם את התא להדמיה.
5. באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה x 100, לספור תאים המצורפת כל היטב על כל צלחת.
   הערה: שימוש בסרגלים שקוף או סימון עט בסדר מדריכים בצד התחתון של הצלחת יסייע למנוע ספירת חוזרת ונשנית לאותם התאים.
6. לקבוע את המספר הממוצע של תאים המצורפת לכל טוב על כל צלחת.
7. להשוות את הקצב של ניתוק התא בין SW-13, SW-Neo ותאים SW-DDK3 על פני תקופת זמן נתון באמצעות מבחן סטטיסטי דו-כיווני ANOVA.

תוצאות

באמצעות את מבחני לעיל, ההשפעות של ביטוי DKK3 על מורפולוגיה השלוחה תא והמאפיינים תא אדהזיה נבדקו הקו תא ACC הוקמה SW-13, במבחנה. תאים overexpressing DKK3 נוצרו כתוצאה stably transfecting SW-13 תאים עם Myc-DDK מתויגות pCMV6-הכניסה/DKK3 פלסמיד המומנט ואת איזור בשם SW-DKK3. באופן דומה, תאים stably transfected עם וקטור ...

Discussion

כאן נתאר במבחנה כמותיים שיטה לאפיון תא הרחבות עם נוחות, כמה נפילות בור הפארמצבטית אמין זה יכול להיות מיושם בתנאים שונים. יתר על כן, מבחני אדהזיה ו/או תנועתיות פשוטות, הניתנות לכימות, ניתן לבצע בו זמנית לתאם פוטנציאליים תפקודית משמעות השינויים שנצפו בהרחבות קרום התא.

עם ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin
Deulbeco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	1X solution, used directly
3.7% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute stock solution
0.05% crystal violet	Harleco	192-12	Dilute stock solution
De-ionized water	NA	NA	NA
Microscope with 400X magnification	NA	NA	NA
6-well plates	Corning	353046	NA
Cell dissociation solution non-enzymatic 1X	Sigma-Aldrich	C5914	1X solution, used directly