قياس التعبير الجيني في طبقات الارون الشعير قصفت مع زيادة الإنتاجية

Summary

ويرد بروتوكولا محسنة لقياس التعبير الجيني عابرة من ثوابت مراسل في الخلايا الارون الشعير بعد قصف الجسيمات. مزيج الحبوب الآلي طحن مع فحوصات إنزيم لوحة 96-جيدا يوفر إنتاجية عالية لهذا الإجراء.

Abstract

الطبقة الارون الحبوب الشعير نظام نموذجا هاما للتعبير الجيني ينظم هرمون في النباتات. في الخلايا الارون، الجينات المطلوبة للإنبات أو يتم تنشيط التنمية الشتلات في وقت مبكر من جبرلين (GA)، في حين يتم تنشيط الجينات المرتبطة باستجابات الإجهاد من حمض التسقيط (ABA). يمكن استجوابهم آليات GA وأبا إشارات بإدخال ثوابت الجينات مراسل الارون الخلايا عن طريق القصف الجسيمات، مع تعبير عابر الناتجة تقاس باستخدام فحوصات إنزيم. وضع بروتوكول تحسين يقال أن جزئيا بأتمتة ويبسط خطوة التجانس الحبوب وفحوصات إنزيم، السماح بإنتاجية أكبر بكثير من الأساليب القائمة. تجانس عينات الحبوب يجري استخدام الخالطون نسيج الآلي، وفحوصات غوس (β-جلوكورونيداسي) وتنفذ باستخدام نظام لوحة 96-جيدا. نتائج تمثيلية باستخدام البروتوكول تشير إلى أن النشاط phospholipase د قد تلعب دوراً مهما في تنشيط الجينات HVA1 برابطة المحامين الأمريكية، من خلال عامل النسخ TaABF1.

Introduction

طبقة الارون الشعير نظام نموذجي راسخة لدراسة التعبير الجيني ينظم هرمون في النباتات¹. على وجه الخصوص، يتم تنشيط عدد من الجينات المطلوبة للإنبات أو الشتلات المبكرة من جبرلين (GA)، في حين يتم تنشيط الجينات المرتبطة باستجابات الإجهاد من حمض التسقيط (ABA). تتشابك GA وأبا إشارات المسارات، كما تحول دون التعبير عن بعض الجينات تنشيط الجمعية العامة برابطة المحامين الأمريكية، والعكس بالعكس¹.

استراتيجية قيمة لفهم دور الأطراف الفاعلة خاصة في الإشارات GA/أبا قد تم الأخذ بنيات الجينات المستجيب عبر قصف الجسيمات، متبوعاً بالتعبير عابر للمراسل بنيات تسمح بذلك من الأثر على التعبير الجيني المتلقين للمعلومات تحديد. يسمح استخدام الجينات مراسل مثل غوس (β-جلوكورونيداسي) أو لوسيفراس قياس الكمية وحساسة للتعبير الجيني على وجه التحديد داخل الخلايا التي حصلت في بناء المستجيب. على سبيل المثال، أنشأت الأخذ ببناء المستجيب ترميز عامل النسخ^5،TaABF1⁶ أن الجينات التي يسببها أبا مثل HVA1 هي الناجمة عن TaABF1، بينما الجينات التي يسببها GA مثل Amy32b يتم قمعها. قد استخدمت القصف الجسيمات كاستراتيجية تجريبية بمختبرات متعددة للتحقيق في الجوانب المتنوعة لإشارات GA/أبا. مثل هذا العمل قد أدى إلى تحديد عناصر المروج هامة لتفعيل المستحثة ألجأ² والجينات التي يسببها أبا³، وإلى اكتشاف بروتين مؤنزم⁴ وعوامل النسخ⁵ التي تنظم التعبير عن هذه الجينات.

القائمة بروتوكولات^{2،3،4،5،6} لقصف الجسيمات وقياس اللاحقة للتعبير الجيني عابرة هي تماما العمل المكثف، كما قصفت كل مجموعة هو تجانس بالكاد من الحبوب باليد بقذائف الهاون والمدقة وتجري فحوصات إنزيم على حدة. تقارير هذه المخطوطة هو بروتوكول تحسين جزئيا بأتمتة ويبسط خطوة التجانس وفحوصات جوس للسماح بإنتاجية أكبر بكثير، السماح لعدد أكبر من العلاجات لفحصها بالتجربة نفسها، و/أو إدراج replicates أكثر لكل معاملة للحصول على المزيد من النتائج إحصائيا قويا. وتظهر نتائج تمثيلية للتعبير عن نيات مراسل HVA1 و Amy32b ، وينظم على عامل النسخ TaABF1 وكذلك الجمعية العامة، وأبا، والجزيئات التنظيمية الأخرى.

Protocol

1-إعداد المستجيب والجينات مراسل بنيات

1. بناء المستجيب بنيات التي توظف مروج تأسيسي (مثل الذرة أوبيكويتين، يو بي أي) إلى التعبير بالسيارة من إطار المطلوب قراءة مفتوحة. على سبيل المثال، بناء بلازميد يحتوي على UBI::TaABF1 إلى محرك قوي التعبير التأسيسي من TaABF1⁵.
2. بناء بني مراسل التي تشمل المروج التي يتمثل نشاطها إلى قياس ووضع المراحل الأولى من إطار القراءة المفتوحة، مثل غوس. على سبيل المثال، بناء بلازميد يحتوي على HVA1::GUS لقياس التعبير من HVA1 المروج^2،5.
3. بناء بنية رقابة داخلية (مثل يو بي أي::لوسيفراس).
4. استخدام عمود ربط والسليكا البروتوكول (انظر الجدول للمواد)، وإعداد بلازميد عالية الجودة لكل من بنيات الجينات المطلوبة. استخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول للمواد)، بدقة قياس تركيز كل إعداد بلازميد.

2-إعداد الحبوب الشعير للقصف

1. قم بإعداد جدول بيانات (انظر الشكل 1 على سبيل مثال) تشير إلى البلازميدات التي سيتم قصف والعلاجات المناسبة هرمون، والمعلومات الأخرى ذات الصلة لكل من المعاملة التي ستكون جزءا من هذه التجربة.
2. استخدام قطع مجلس وشفرة حلاقة عقيمة، قطع الأجنة من الحبوب من الشعير هيمالايا (40 لكل معاملة المدرجة في هذه التجربة). استبعاد الحبوب التي أصغر بكثير من متوسط أو مشوه.
3. ضع جميع الحبوب امبريولس في أنبوب 50 مل. إضافة 40 مل من المياه والصخور لمدة 10 دقائق.
4. صب الماء بعناية (لتجنب فقدان الحبوب) وإضافة 40 مل التبييض 10%. روك لمدة 20 دقيقة.
5. من أجل الخروج التبييض وإضافة 40 مل الماء المعقم. روك لمدة 5 دقائق. كرر هذا يغسل الماء المعقم أربع مرات أكثر.
6. إضافة 40 مل من "محلول الشرب" (20 مم سوكسيناتي الصوديوم، وكلوريد الكالسيوم 20 مم، pH 5.0) و 40 ميكروليتر من الكلورامفينيكول الحل الأسهم (10 ملغ/مل).
7. نقل معظم "الحل الشرب" (مع الكلورامفينيكول) من الأنبوب إلى "لوحة الفيرميكوليت" (انظر الجدول للمواد). ثم نقل الحبوب على سطح الورق تصفية الرطب في "لوحة الفيرميكوليت". انتشرت الحبوب بشكل متساو. أغرقت صب في الحل إيمبيبينج ما يكفي للحفاظ الحبوب جزئيا (ولكن ليس تماما). ضع غطاء على رأس "لوحة الفيرميكوليت".
8. احتضان الحبوب امبريولس عند 24 درجة مئوية لحوالي 48 ساعة مع إضاءة الفلورسنت. إضافة "حل الشرب" إضافية حسب الضرورة.
9. فتح طبق بيتري بلاستيك 90 ملم وصب 20 مل من "حل الشرب" في الطبق نفسه و 20 مل في غطاء مقلوب. إضافة 20 ميكروليتر الكلورامفينيكول (10 مغ/مل) لكل منهما. تعقيم اثنين من أزواج من الملقط نقطة غرامة بغمس لهم في الكحول.
10. وضع عدد قليل من الحبوب امبريولس في غطاء طبق بيتري. بلطف باستخدام الملقط، إزالة المعطف البذور (شفاف) من كل الحبوب. أثناء إزالة المعطف البذور من الجانب السلس من الحبوب، لا تضر الخلايا (الارون) الأساسية. نقل الحبوب مقشرة على طبق بتري يحتوي على "الشرب الحل".
11. بعد تقشير البذور معطف من جميع الحبوب، إعادتها إلى "لوحة الفيرميكوليت". احتضان الحبوب امبريولس مقشرة عند 24 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة.
12. قبل استخدام الحبوب للقصف، إزالة الرطوبة السطحية التي تهتز لها بين أوراق التصفية في طبق بتري.

3-إعداد بلازميد الحمض النووي للقصف

1. قم بتسمية أنبوب 1.5 مل لكل معاملة التي سيتم تضمينها في تجربة القصف. لكل أنبوبة إضافة 2.5 ميكروغرام من يو بي أي::لوسيفراس الرقابة الداخلية بلازميد، 2.5 ميكروغرام بلازميد مراسل غوس ، والمبلغ المطلوب (عادة 0.025 ميكروغرام إلى 2.5 ميكروغرام) من بلازميد المستجيب. إضافة المياه تحقيق الحجم الإجمالي إلى 5 ميليلتر.
2. إعداد 1.6 ميكرون الذهب ميكروكاريرس (انظر الجدول للمواد) التالية نشرت البروتوكولات⁶.
3. لكل معاملة، إضافة 50 ميليلتر من ميكروكاريرس مع وقف التنفيذ في أنبوب 1.5 مل تحتوي على الحمض النووي بلازميد. معطف ميكروكاريرس مع بلازميد الحمض النووي وفقا للشركة المصنعة للبروتوكولات⁶.
4. في الخطوة الأخيرة، عندما يتم تعليق في 48 100% ميليلتر الإيثانول، بيبيت 8 ميكروليتر من ميكروكاريرس مع وقف التنفيذ على كل من ماكروكاريرس خمسة ميكروكاريرس المغلفة بلازميد والسماح لهم بالهواء الجاف.

4-الجسيمات القصف من الحبوب الشعير امبريولس

1. قم بإعداد الجهاز القصف الجسيمات (انظر الجدول للمواد)⁶.
2. ضع قرص تمزق هذه المبادرة 1550 إلى الحد الأقصى الاحتفاظ وجبل على الصك.
3. ضع ماكروكارير التي تحتوي على تركيبة بلازميد المطلوب (جنبا إلى جنب مع شاشة توقف) إلى الجمعية العامة إطلاق ميكروكارير. إدراج الجمعية في الفتحة أعلى دائرة القصف. تعيين المسافة بين تمزق القرص الاحتفاظ بغطاء وغطاء غطاء ماكروكارير على مسافة قياسية (6 ملم)، ووضع دعم شاشة التوقف في الموقف الوسط (قياسي)، مما يسمح لمسافة سفر ماكروكارير 11 مم (الشكل 2A).
4. ترتيب الحبوب امبريولس 8 في نمط شعاعي ضيق (مع نهايات أرق مشيراً إلى الداخل) في دائرة تصفية ورق الذي يتم مسجلة أسفل مسطحة لغطاء طبق بيتري 90 مم (انظر الشكل 2).
5. ضع الطبق مع الحبوب إلى غرفة عمليات القصف، على مسافة 6 سم من شاشة التوقف.
6. إخلاء قاعة القصف إلى 95 كيلوباسكال وثم قصف العينة.
7. بعد الإفراج عن الفراغ، نقل الحبوب قصفت على طبق بيتري مسمى 60 ملم تحتوي على 4 مل من "محلول الشرب" يحتوي على 1 ملغ/مل كلورامفينيكول.
8. كرر حتى تم إكمال كافة عمليات القصف. احتضان (على منصة تهز 100 لفة في الدقيقة) عند 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

5-استخراج البروتين للذوبان من الحبوب قصفت

1. استخدام الملقط، إزالة الحبوب قصفت 8 من طبق بيتري 60 ملم ولطخة لهم الجافة على منشفة ورقية. تقسيم الحبوب إلى أنبوبين مل 2.0 المسمى (الحبوب 4 كل أنبوب) كل منها يحتوي على 800 ميكروليتر "طحن المخزن المؤقت" (100 مم نا فوسفات الهيدروجيني 7.2، 5 مم DTT، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، والغليسيرول 20 ٪) وحبه 5 مم من فولاذ المقاوم للصدأ. كرر هذه العملية لكل من الحبوب قصفت.
2. ضع (تصل إلى 48) 2.0 مل أنابيب إلى رفوف اثنين من الخالطون حبة (انظر الجدول للمواد). تحميل الرفوف على الخالطون.
3. هز العينات في 30 هرتز لمدة 3 دقائق.
4. إزالة الرفوف الخالطون من الخالطون ووضعها على الجليد (5 دقائق) لإعادة تبريد العينات.
5. جبل الرفوف مرة أخرى على الخالطون-في الاتجاه المعاكس. هز العينات مرة أخرى في 30 هرتز لمدة 3 دقائق.
6. بارد رفوف على الجليد، ثم كرر "الخطوات 5، 3" إلى 5.5. هذا وسوف تضيف ما يصل إلى ما مجموعة 12 دقيقة من الهز.
7. الطرد المركزي مقتطفات الحبوب في س 16,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
8. فورا بعد الطرد المركزي، صب supernatants واضحة في مجموعة ثانية من أنابيب ميكروسينتريفوجي. إعطاء كل أنبوب دوامة سريعة. تخزين الأنابيب على الجليد.
9. بعد نقل المادة طافية، استرداد الخرز الصلب من الكريات حيث يمكن غسلها وإعادة استخدامها.

6-قياس النشاط لوسيفراس من مقتطفات الحبوب

1. لكل أنبوبة من استخراج الحبوب تكون جزيئي، إعداد أنبوب اختبار زجاج 12 مم × 75 مم تحتوي على 200 ميكروليتر من "خليط الإنزيم لوسيفراس" (45 ملم تريس كبريتات الأس الهيدروجيني 7.7، 15 مم مجكل₂، 20 مم DTT، 1.5 مم يدتا، لوسيفرين 1 مم، ATP 1 مم).
2. إضافة 100 ميكروليتر من استخراج الحبوب أول أنبوب الفحص الأولى. الدوامة بسرعة مزيج جيد. فورا وضع الأنبوبة في حامل أنبوب لومينوميتير وأغلق الباب. عند الانتهاء من القياس، إزالة الأنبوب من لومينوميتير – ترك الباب مفتوحاً لموضع الأنبوب القادم.
3. كرر هذه العملية حتى تم قياس جميع العينات.

7-قياس النشاط جوس من مقتطفات الحبوب

1. إضافة 200 ميكروليتر من "المخزن المؤقت للمقايسة غوس" (50 مم نا الفوسفات الرقم الهيدروجيني 7.2، 2.5 ملم 4-ميثيلومبيليفيريل-د-بالجلوكويورونويد، 10 مم DTT، 2 مم يدتا، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، 20% ميثانول، أزيد الصوديوم 0.02 في المائة) لكل بئر من صفيحة جيدا 96.
2. استخراج مكان 50 ميكروليتر من كل الحبوب في المقابلة أيضا. مزيج مع التلميح بعد إضافة. ختم الجزء العلوي مع ختم الفيلم.
3. احتضان 96 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 20 ساعة.
4. الطرد المركزي 96 لوحة جيدا في س 4,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ووضعه على الجليد.
5. إضافة 250 ميكروليتر من 0.2 م Na₂CO₃ لكل بئر من لوحة سوداء 96 جيدا.
6. إضافة ميكروليتر 6.25 كل خليط المقايسة جوس سينتريفوجيد في المقابل جيدا (التي تحتوي على 0.2 م Na₂CO₃) الأسود 96 لوحة جيدا. مزيج مع التلميح بعد إضافة. وتشمل الآبار مع ميكروليتر 6.25 10 ميكرومترات و 40 ميكرومتر ميكرومترات 100 4-ميثيلومبيليفيروني كمعايير.
7. ضع اللوحة السوداء في فلوروميتير لوحة وقراءة الأسفار ميثيلومبيليفيروني. أخذ القراءات في الطول موجي إثارة 360 نيوتن متر، والطول موجي انبعاثات من 460 نانومتر. تعيين كسب الصك أن ميكروليتر 6.25 تتضمن أيضا من 40 ميكرومتر 4-ميثيلومبيليفيروني و 250 ميكروليتر من 0.2 م Na₂CO₃ يعطي قراءة 1000 وحدة الأسفار.

8-بيانات التحليل

1. أدخل القيم لوسيفراس وفحوصات غوس في جدول بيانات. استبعاد من النظر في أي نموذج بقراءة لوسيفراس لأقل من 20,000 التﻷلؤ النسبية وحدات s^-1، كما يشير هذا إلى أن بنيات الجينات لم تسلم بنجاح إلى الخلايا الارون.
2. لكل الحبوب قصفت بنجاح استخراج (الذين يمثلون مجموعة من الحبوب امبريولس أربعة)، حساب التعبير غوس مسواة من البيانات الخام غوس ولوسيفراس على النحو التالي: تطبيع غوس = [(غوس التعبير-غوس فارغة) x (2,000,000)]/(لوسيفراس التعبير – لوسيفراس فارغ).
   ملاحظة: هذا طبيعتها مقدار نشاط غوس إلى ما قد لوحظت في قصف الذي أعطى قراءة لوسيفراس 2,000,000.
3. تقرير المستوى النسبي للتعبير عن بناء مراسل خاص حضور المستجيب بنيات أو علاجات الهرمون يتم اختباره عن طريق مقارنة بمستوى التعبير في الغياب المستجيبة أو الهرمونات.

النتائج

يمكن استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لإدخال أي بناء اختبار الجينات في الخلايا الارون الحبوب الشعير. ثم قد يكون مستوى التعبير عن الجين اختبار قياس ملائم (الشكل 2). البروتوكول إنتاجية أعلى الموصوفة هنا إلى حد كبير يزيد من كفاءة طحن البذور والخطوات إنزيم المقاي...

Discussion

بنيات إدخال الجينات المستجيب عبر قصف الجسيمات، متبوعاً بالتعبير عابرة من بنيات مراسل استراتيجية قيمة لتشريح دور الأطراف الفاعلة خاصة في الإشارات GA/أبا والجين ينظم هرمون الناتجة التعبير.
ومع ذلك، هي البروتوكولات القائمة لإجراء مثل هذه التجارب في الشعير الارون الخلايا^2،<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Himalaya barley grains	/	/	A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate	Sigma	S2378	Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution	home made	/	20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol	Sigma	C0378	Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm)	Whatman	1001 090	Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates	home made	/	Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed)	Fisher	13-812-42	Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point)	Fisher	12-000-122	Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine	Sigma	S0266	Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi)	BioRad	1652331
stopping screens	BioRad	1652336
macrocarrier holders	BioRad	1652322
Biolistic particle delivery system	BioRad	PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic	Sigma	S9763	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2	home made	/	Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin	Sigma	L2884	Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol	Sigma	G5516	Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer	home made	/	Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL tubes	Eppendorf	22363352	This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75 mm glass test tubes	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid	Sigma	258105	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7	home made	/	Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride	Sigma	M9397	Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB)	home made	/	Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture	home made	/	Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide	Sigma	S8032	Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard)	Fisher	12565501
GUS assay buffer	home made	/	Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film	USA Scientific	2921-1000
96 well plates (black)	Costar	3916
sodium carbonate	Sigma	S7795	Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader	Bio-Tek	FLX-800