提高吞吐量的轰击大麦糊粉层层中基因表达的测定

摘要

提出了一种改进的协议, 用于测量粒子轰击后大麦糊粉层细胞中的瞬时基因表达。采用全自动谷物研磨与96井板酶检测相结合, 为该过程提供了较高的吞吐量。

摘要

大麦籽粒糊粉层层是植物激素调控基因表达的重要模型体系。在糊粉层细胞中, 萌发或早期幼苗发育所需的基因由赤霉素 (GA) 激活, 而与应激反应相关的基因则由脱落酸 (ABA) 激活。通过粒子轰击引入糊粉层细胞的基因构造, 可以对 GA 和 ABA 信号的机制进行审问, 并利用酶法测定结果的瞬态表达。报告了一种改进的协议, 部分自动化和简化了谷物均匀化步骤和酶的测定, 使吞吐量大大超过现有方法。采用全自动组织均质器进行谷物样品的均匀化, 用96井板系统进行 GUS (β glucuronidase) 测定。使用该协议的代表性结果表明, 磷脂酶 D 活性可以发挥重要作用, 激活HVA1基因表达的 ABA, 通过转录因子 TaABF1。

引言

大麦糊粉层层是植物激素调控基因表达研究的一个成熟的模型^系统1。特别是, 一些需要发芽或早期幼苗发育的基因由赤霉素 (GA) 激活, 而与应激反应相关的基因则由脱落酸 (ABA) 激活。ga 和 aba 信号通路是交织在一起的, 因为一些 ga 激活基因的表达被 ABA 抑制, 反之亦然¹。

了解特定行为者在 GA/ABA 信号中的作用的一个有价值的策略是通过粒子轰击引入效应基因构造, 接着是记者构造的瞬态表达, 从而使结果影响下游基因表达的确定。使用报告基因, 如GUS (β-glucuronidase) 或荧光素酶允许对基因表达式的敏感和定量测量, 特别是在接收到效应器结构的细胞内。例如, 引入了一个对转录因子 TaABF1^5,6编码的效应器构造, 它建立了 ABA 诱导的基因, 如HVA1是由 TaABF1 诱导的, 而 GA 诱导的基因, 如Amy32b被压抑。粒子轰击作为一种实验策略已被多个实验室用来研究遗传/ABA 信号的不同方面。这项工作已导致识别启动子元素重要的激活两个 GA 诱导的²和 ABA 诱导的基因³, 并发现蛋白激酶⁴和转录因子⁵ , 调节这些基因的表达。

现有协议^2,3,4,5,6为粒子轰击和随后的瞬态基因表达测量是相当劳动密集型的, 因为每套轰炸在砂浆和杵中, 几乎没有谷物是均匀的, 酶的测定是单独进行的。这篇手稿报告了一个改进的协议, 部分自动化和优化均匀化步骤和 GUS 化验, 以允许大量的吞吐量, 允许更多的治疗在同一实验中测试, 和/或包含更多的复制, 每种治疗获得更有统计学意义的结果。代表的结果显示为HVA1和Amy32b报告器构造的表达式, 由转录因子 TaABF1 以及 GA、ABA 和其他调控分子调控。

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研究方案

1. 效应器和报告基因构造的制备

1. 构建使用本构启动子 (如玉米泛素, UBI) 的效应器构造, 以从所需的开放阅读框架中驱动表达式。例如, 构造一个包含UBI::TaABF1的质粒, 以驱动 TaABF1⁵的强本构表达式。
2. 生成包括要测量其活动的启动器的报告器结构, 放置在打开的阅读框架的上游, 如GUS。例如, 构造一个包含HVA1::GUS的质粒, 用于测量从HVA1启动子^2,5的表达式。
3. 生成内部控件构造 (例如UBI::荧光素酶)。
4. 使用硅胶绑定列协议 (参见材料表), 为每个必需的基因构造准备高质量的质粒。使用紫外光谱 (参见材料表), 仔细测量每种质粒制备的浓度。

2. 为轰炸准备大麦谷物

1. 设置电子表格 (请参见图 1 ), 指出将被轰炸的质粒、适当的激素治疗以及将作为实验一部分的每种治疗的其他相关信息。
2. 使用切割板和无菌剃刀刀片, 从喜马拉雅大麦的谷物中切下胚胎 (试验中包括的每种治疗 40)。排除变色或大大小于平均值的谷物。
3. 将所有的 embryoless 颗粒放入50毫升管中。加入40毫升的水和岩石10分钟。
4. 仔细倒入水 (以避免失去谷物), 并添加40毫升10% 漂白剂。摇滚20分钟。
5. 倒出漂白剂, 加入40毫升的无菌水。摇滚5分钟。重复这种无菌水洗四次。
6. 添加40毫升的饮用溶液 (20 毫米琥珀酸钠, 20 毫米氯化钙, pH 5.0) 和 40 ul 的氯霉素库存溶液 (10 毫克/毫升)。
7. 将大部分的饮用溶液 (与氯霉素) 从管子转移到蛭石板 (参见材料表)。然后将谷物转移到蛭石板上湿滤纸的表面。均匀地分散谷物。倒入足够的饮用溶液, 使谷物部分 (但不完全) 淹没。把盖子放在蛭石板的顶部。
8. 用萤光灯孵化24摄氏度的 embryoless 颗粒, 大约48小时。必要时添加其他饮用解决方案。
9. 打开一个90毫米塑料培养皿和倒入20毫升的饮用溶液到盘子本身和20毫升进入倒盖。添加 20 ul 的氯霉素 (10 毫克/毫升)。用酒精浸泡两对细点钳。
10. 将一些 embryoless 谷物放入培养皿的盖子中。使用镊子, 轻轻地去除每粒谷物 (透明) 的种子大衣。从谷物的平滑面除去种子外衣时, 不要损害底层 (糊粉层) 细胞。将去皮的谷物转移到含有饮用溶液的培养皿中。
11. 剥去所有谷物的种子后, 把它们放回蛭石板上。将去皮的 embryoless 颗粒孵化24摄氏度, 16-20 小时。
12. 就在使用谷物进行轰炸之前, 通过在培养皿中的滤纸之间摇动来去除表面水分。

3. 用于轰击的质粒 DNA 的制备

1. 标记一个1.5 毫升管为每个治疗, 将包括在轰炸实验。对每个管添加2.5 µg 的UBI::荧光素酶内部控制质粒, 2.5 µg GUS报告质粒, 以及所需的量 (通常0.025 µg 到2.5 µg) 的效应质粒。加水, 使总容积达5µL。
2. 在发布的协议⁶之后, 准备1.6 µm 金载体 (参见材料目录)。
3. 对于每种治疗, 添加50µL 的悬浮载体到1.5 毫升管含有质粒 DNA。根据制造商的协议⁶, 将载体与质粒 DNA 一起涂上。
4. 在最后一步, 当质粒涂层的载体悬浮在48µL 100% 乙醇, 吸管 8 ul 悬浮载体到每五 macrocarriers 和允许他们空气干燥。

4. Embryoless 大麦颗粒的微粒轰击

1. 设置粒子轰击装置 (请参阅材料表)⁶。
2. 将 1550 psi 破裂盘放入固定帽, 并将其安装在仪器上。
3. 将含有所需质粒组合 (连同停止屏幕) 的 macrocarrier 放入载体发射组件中。将组件插入到轰击室的顶槽中。设置在标准距离 (6 毫米) 处的破裂盘护盖与 macrocarrier 盖盖之间的距离, 并将停止屏幕支持置于 (标准) 中间位置, 允许 macrocarrier 旅行距离为 11 mm (图 2A)。
4. 将 8 embryoless 颗粒排列在一个紧的径向模式下 (用较薄的一端指向内侧) 在滤纸圈上, 将其固定在一个 90 mm 培养皿的盖子上 (参见图 2B)。
5. 放置菜与五谷入炮击房间, 在距离从停止的屏幕 6 cm。
6. 将轰炸室疏散至95帕, 然后轰击样品。
7. 释放真空后, 将被轰击的谷物转移到一个标记为60毫米的培养皿中, 含有4毫升的饮用溶液, 含有氯霉素的1毫克/毫升。
8. 重复, 直到所有的轰炸已经完成。孵育 (在一个震动平台在 100 rpm) 在24°c 24 小时。

5. 从轰击颗粒中提取可溶性蛋白质

1. 使用镊子, 从60毫米的培养皿中取出8个被轰击的谷物, 并将它们涂抹在纸巾上晾干。将谷物分成两个标记为2.0 毫升的管子 (每管4粒), 每个含800个 ul 研磨缓冲器 (100 毫米 Na 磷酸盐 pH 值 7.2, 5 毫米, µg/毫升 leupeptin, 10 甘油) 和20% 毫米不锈钢珠。对所有被轰击的谷物重复这个过程。
2. 将 (最多 48) 2.0 毫升管放入珠均质机的两个机架上 (请参阅材料表)。将机架安装在均质机上。
3. 在30赫兹处摇动样品3分钟。
4. 从均质机卸下均质机架, 并将其放在冰上 (5 分钟) 以重新冷却样品。
5. 将机架重新安装在均质上-在相反的方向上。再次摇动样品在30赫兹3分钟。
6. 冷却在冰上的架子, 然后重复步骤5.3 到5.5。这将增加总共12分钟的震动。
7. 离心机的谷物提取物在 1.6万 x g 在4°c 10 分钟。
8. 立即离心后, 醒酒清除上清液成第二组离心管。给每个管子一个快速的漩涡。把管子储存在冰上。
9. 转移上清液后, 从小球中回收钢珠, 以便清洗和再利用。

6. 从谷物提取物中测定荧光素酶活性

1. 要测定每个谷物提取管, 准备一个12毫米 x 75 毫米玻璃试管, 其中含有 200 ul 的荧光素酶检测混合物 (45 毫米三硫酸酯 pH 值 7.7, 15 毫米氯化镁₂, 20 毫米, 1.5 毫米 EDTA, 1 毫米荧光素, 1 毫米 ATP)。
2. 将第一粒提取物的 100 ul 添加到第一检测管中。涡旋迅速搅拌良好。立即将管置于紫外线的管架中, 并关闭门。当测量完成后, 从紫外线中取下管子--让门打开, 以便放置下一管。
3. 重复此过程, 直到测量完所有样品。

7. 谷物提取物中 GUS 活性的测定

1. 添加 200 ul 的 GUS 化验缓冲器 (50 毫米 Na 磷酸盐 pH 7.2, 2.5 毫米 4-甲基伞形酮-葡糖苷酸, 10 毫米, 2 毫米 EDTA, 10 µg/毫升 leupeptin, 20% 甲醇, 0.02% 钠氮) 的每一个井的96个井板。
2. 将每个谷物提取物的 50 ul 放置到相应的井中。添加后与提示混合。用密封膜密封顶部。
3. 在37摄氏度在黑暗中孵化96井板20小时。
4. 离心机96井板在 4000 x g 在4°c 10 分钟并且安置它在冰。
5. 添加 250 ul 0.2 M Na₂CO₃到每个井的黑色96井板。
6. 将每离心 GUS 检测混合物的 6.25 ul 添加到相应的井中 (包含0.2 米 Na₂CO₃) 的黑色96井板。添加后与提示混合。包括水井与 6.25 ul 10 微米, 40 微米, 100 微米 4-甲基伞形酮作为标准。
7. 把黑盘子放进盘子荧光计, 读甲基伞形酮的荧光。以 360 nm 的激发波长和 460 nm 的发射波长进行读数。设置仪器的增益, 使含有 6.25 ul 的40微米 4-甲基伞形酮和 250 ul 的 0.2 M_Na2_CO 3 的油井读数为1000年荧光单位。

8. 数据分析

1. 在电子表格中输入荧光素酶和 GUS 化验的值。排除从考虑任何样本与荧光素酶读数低于2万相对发光单位 s^-1, 因为这表明, 基因构造没有成功地传递到糊粉层细胞。
2. 对于每个成功轰击的谷物萃取物 (代表一组四 embryoless 谷物), 从原始 gus 和荧光素酶数据中计算规范化的 gus 表达式如下: 规范化 gus = [(gus 表达式 gus 空白) x (200万)]/(荧光素酶表达-荧光素酶空白)。
   注意: 这将 GUS 活动的数量正常化为在一次轰炸中观察到的东西, 使荧光素酶读数为200万。
3. 报告一个特定的记者结构的相对水平在存在的效应构造或激素治疗正在测试通过比较的表现水平, 在没有效应或荷尔蒙。

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结果

本文所描述的技术可用于将任何试验基因结构引入大麦籽粒的糊粉层细胞中。然后可以方便地测量测试基因的表达水平 (图 2)。这里描述的高吞吐量协议大大提高了种子研磨和酶测定步骤的效率。该方法已用于评估转录因子 TaABF1^5、6的能力, 以激活 ABA 诱导的基因HVA1⁷的表达。在这里...

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讨论

通过粒子轰击引入效应基因构造, 其次是记者构造的瞬态表达, 是解剖特定行为者在 GA/ABA 信号中的作用以及由此产生的激素调控基因的宝贵策略。表达.
然而, 在大麦糊粉层单元格中进行此类实验的现有 ^协议2, 3, 4, 5, 6 是非常劳力密集.每组被轰击的颗粒必须在砂浆和杵中手...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Himalaya barley grains	/	/	A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate	Sigma	S2378	Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution	home made	/	20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol	Sigma	C0378	Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm)	Whatman	1001 090	Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates	home made	/	Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed)	Fisher	13-812-42	Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point)	Fisher	12-000-122	Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine	Sigma	S0266	Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi)	BioRad	1652331
stopping screens	BioRad	1652336
macrocarrier holders	BioRad	1652322
Biolistic particle delivery system	BioRad	PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic	Sigma	S9763	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2	home made	/	Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin	Sigma	L2884	Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol	Sigma	G5516	Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer	home made	/	Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL tubes	Eppendorf	22363352	This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75 mm glass test tubes	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid	Sigma	258105	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7	home made	/	Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride	Sigma	M9397	Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB)	home made	/	Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture	home made	/	Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide	Sigma	S8032	Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard)	Fisher	12565501
GUS assay buffer	home made	/	Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film	USA Scientific	2921-1000
96 well plates (black)	Costar	3916
sodium carbonate	Sigma	S7795	Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader	Bio-Tek	FLX-800