Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

Riepilogo

Un protocollo migliore è presentato per la misura dell'espressione genica transitoria da costruzioni del reporter in cellule di aleurone di orzo dopo il bombardamento di particelle. La combinazione di grano automatizzato rettifica con analisi dell'enzima piastra a 96 pozzetti fornisce throughput elevato per la procedura.

Abstract

Lo strato aleuronico di chicchi d'orzo è un importante sistema modello per l'espressione di gene ormone-regolato nelle piante. In cellule di aleurone, geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale attivati da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). I meccanismi di segnalazione GA e ABA possono essere interrogati dall'introduzione di costruzioni di gene del reporter in cellule di aleurone via bombardamento di particelle, con l'espressione transitoria risultante misurata mediante analisi dell'enzima. Un protocollo migliorato è segnalato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione di grano e l'analisi dell'enzima, che consente una velocità effettiva significativamente maggiore rispetto ai metodi esistenti. Omogeneizzazione dei campioni grano viene effettuata utilizzando un omogeneizzatore automatizzato del tessuto, e GUS (β-glucuronidasi) le analisi sono effettuate utilizzando un sistema di piastra a 96 pozzetti. Risultati rappresentativi utilizzando il protocollo suggeriscono che l'attività della fosfolipasi D può svolgere un ruolo importante nell'attivazione dell'espressione genica di HVA1 di ABA, attraverso il fattore di trascrizione TaABF1.

Introduzione

Lo strato aleuronico orzo è un sistema consolidato modello per lo studio dell'espressione di gene ormone-regolato in piante¹. In particolare, un numero di geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale è attivato da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). La GA e ABA vie di segnalazione sono intrecciate, come l'espressione di alcuni geni attivati dal GA è inibita da ABA e viceversa¹.

Una strategia importante per comprendere che il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA è stata l'introduzione di costrutti genici effettrici tramite bombardamento di particelle, seguita dall'espressione transitoria di costruzioni del reporter che consentono l'effetto risultante sul espressione genica a valle deve essere determinato. L'uso di geni reporter come GUS (β-glucuronidasi) o Luciferase permette la misura sensibile e quantitativa dell'espressione genica in particolare all'interno delle cellule che hanno ricevuto il costrutto dell'effettore. Ad esempio, l'introduzione di un costrutto di effettori che codifica per il fattore di trascrizione TaABF1^5,6 stabilito che geni indotti da ABA come HVA1 sono indotte da TaABF1, mentre GA-indotta di geni come Amy32b sono repressi. Bombardamento di particelle come una strategia sperimentale è stato utilizzato da più laboratori di approfondire diversi aspetti della GA/ABA segnalazione. Tale lavoro ha portato all'identificazione di elementi promotore importanti per l'attivazione indotta da GA² sia geni indotti da ABA³e alla scoperta della proteina chinasi⁴ e fattori di trascrizione⁵ che regolano la espressione di questi geni.

Gli esistenti protocolli^2,3,4,5,6 per bombardamento di particelle e successiva misura della espressione genica transitoria sono abbastanza laborioso, come ogni set di bombardato a malapena grani è omogeneizzato a mano in un mortaio e pestello e l'analisi dell'enzima sono effettuate individualmente. Questo manoscritto segnala un protocollo migliorato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione e GUS saggi per consentire una velocità effettiva significativamente maggiore, permettendo un maggior numero di trattamenti da sottoporre all'esperimento stesso, e/o la inclusione di ulteriori repliche per ogni trattamento ottenere altri risultati statisticamente robusti. Risultati rappresentativi sono indicati per l'espressione di HVA1 e Amy32b costruzioni del reporter, regolata dal fattore di trascrizione TaABF1 nonché da GA, ABA e altre molecole regolatrici.

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Protocollo

1. preparazione del Effector e Gene Reporter costruisce

1. Costruire costrutti effettrici che impiegano un promotore costitutivo (es. mais ubiquitina, UBI) all'espressione di unità da un telaio di lettura aperto desiderato. Ad esempio, costruire un plasmide contenente UBI::TaABF1 di forte espressione costitutiva unità di TaABF1⁵.
2. Costruire costruzioni del reporter che includono il promotore cui attività deve essere misurato, posto a Monte di un open reading frame, come GUS. Ad esempio, costruire un plasmide contenente HVA1::GUS per misurare l'espressione dal promotore HVA1 ^2,5.
3. Costruire un costrutto di controllo interno (ad es. UBI::luciferasi).
4. Utilizzando una colonna di silice associazione protocollo (Vedi Tabella materiali), preparare il plasmide di alta qualità per ciascuno dei costrutti gene richiesto. Usando la spettroscopia ultravioletta (Vedi Tabella materiali), accuratamente misurare la concentrazione di ogni preparazione del plasmide.

2. preparazione di chicchi d'orzo per il bombardamento

1. Impostare un foglio di calcolo (per un esempio, vedere Figura 1 ) che indica i plasmidi che saranno bombardati, i trattamenti ormonali appropriati e altre informazioni pertinenti per ogni trattamento che sarà parte dell'esperimento.
2. Utilizzando una lama di rasoio sterile e un tagliere, tagliare gli embrioni da chicchi di orzo Himalaya (40 per ogni trattamento incluso nell'esperimento). Escludere i grani che sono scolorite o sostanzialmente più piccole della media.
3. Posizionare tutti i grani embryoless in una provetta da 50 mL. Aggiungere 40 mL di acqua e roccia per 10 minuti.
4. Versare l'acqua con attenzione (per evitare di perdere i grani) e aggiungere 40 mL di candeggina al 10%. Roccia per 20 minuti.
5. Versare la candeggina e aggiungere 40 mL di acqua sterile. Roccia per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio di acqua sterile quattro volte di più.
6. Aggiungere 40 mL di soluzione di Imbibing (succinato del sodio di 20 mM, 20 mM di cloruro di calcio, pH 5.0) e 40 μL di soluzione di riserva di cloramfenicolo (10 mg/mL).
7. Trasferire la maggior parte della soluzione (con cloramfenicolo) assorbendo dal tubo in una piastra di Vermiculite (Vedi Tabella materiali). Quindi trasferire i grani sulla superficie della carta da filtro bagnata nella piastra di Vermiculite. Stendere in modo uniforme i grani. Versare in una soluzione abbastanza semplice per mantenere i grani parzialmente (ma non completamente) sommerso. Posizionare il coperchio sopra la piastra di Vermiculite.
8. Incubare i grani embryoless a 24 ° C per circa 48 h con illuminazione fluorescente. Aggiungi ulteriori Imbibing soluzione come necessario.
9. Aprire una capsula di Petri 90 mm plastica e versare 20 mL di soluzione di Imbibing nel piatto stesso e 20 mL nel coperchio rovesciato. Aggiungere 20 μL di cloramfenicolo (10 mg/mL) a ciascuno. Sterilizzare due paia di pinze a punta fine tuffandoli in alcool.
10. Posto alcuni dei grani embryoless nel coperchio della piastra di petri. Utilizzando le pinze, rimuovere delicatamente il cappotto di seme (trasparente) da ogni grano. Durante la rimozione il cappotto di seme dal lato liscio del grano, non danneggiare le celle sottostanti (aleuronico). Trasferire il grano pelato di Petri contenente soluzione assorbendo.
11. Dopo il cappotto di seme da tutti i grani di peeling, restituirli alla piastra di Vermiculite. Incubare i grani embryoless pelati a 24 ° C per 16-20 ore.
12. Appena prima di usare i grani per il bombardamento, togliere l'umidità superficiale agitando loro tra carta da filtro in una capsula di Petri.

3. preparazione del DNA del plasmide per bombardamento

1. Etichettare una provetta da 1,5 mL per ogni trattamento che verrà inclusi nell'esperimento bombardamento. A ciascuna provetta aggiungere 2,5 µ g di UBI:: plasmide controllo internoluciferasi , 2,5 µ g di un plasmide del reporter GUS e la quantità desiderata (in genere 0.025 µ g 2,5 µ g) di un plasmide dell'effettore. Aggiungere acqua per portare il volume totale a 5 µ l.
2. Preparare 1,6 µm oro microcarriers (Vedi Tabella materiali) pubblicati protocolli⁶.
3. Per ogni trattamento, aggiungere 50 µ l di sospensione microcarriers nella provetta da 1,5 mL contenente il DNA del plasmide. Cappotto microcarriers con DNA plasmidico secondo protocolli^{6 del produttore}.
4. Nella fase finale, quando il microcarriers rivestite con plasmide sono sospese in 48 µ l 100% di etanolo, dispensare 8 μL di sospensione microcarriers su ognuno dei cinque macrocarriers e consentire loro di aria secca.

4. particelle bombardamento di chicchi d'orzo Embryoless

1. Impostare l'apparecchio di bombardamento di particelle (Vedi Tabella materiali)⁶.
2. Inserire un disco di rottura psi 1550 il tappo ritegno e montarla sullo strumento.
3. Posizionare un macrocarrier contenente la combinazione desiderata plasmide (insieme a una schermata di arresto) nel microcarrier lancio assieme. Inserire il gruppo nell'alloggiamento superiore della camera del bombardamento. Impostare la distanza tra il disco di rottura mantenendo il tappo e il coperchio di copertura macrocarrier alla distanza standard (6 mm) e inserire il supporto di schermo di arresto dalla posizione centrale (standard), che permette una distanza di viaggio di macrocarrier di 11 mm (Figura 2A).
4. Organizzare embryoless 8 grani a raggiera stretto (con l'estremità più sottile punta verso l'interno) su un cerchio di carta da filtro che è registrato giù piatta al coperchio di una piastra di petri di 90 mm (Vedi Figura 2B).
5. Posizionare il piatto con i grani nella camera di bombardamento, ad una distanza di 6 cm dalla schermata di arresto.
6. Evacuare la camera di bombardamento a 95 kPa e poi bombardare il campione.
7. Dopo aver rilasciato il vuoto, è possibile trasferire i grani hanno bombardati a una capsula di Petri con etichetta 60 mm contenente 4 mL di soluzione di Imbibing contenente 1 mg/ml di cloramfenicolo.
8. Ripetere fino a quando tutti i bombardamenti sono stati completati. Incubare (su una piattaforma d'agitazione a 100 giri/min) a 24 ° C per 24 ore.

5. estrazione della proteina solubile dai grani hanno bombardati

1. Usando il forcipe, rimuovere i 8 grani bombardati da una capsula di Petri 60mm e asciugare loro secco su un tovagliolo di carta. Dividere i grani in due tubi etichettati 2,0 mL (4 grani per tubo) ognuno dei quali contiene 800 μL rettifica Buffer (100 mM Na fosfato pH 7.2, 5 mM DTT, 10 µ g/mL leupeptina, 20% glicerolo) e una perlina di acciaio di 5 mm. Ripetere questo processo per tutti i cereali hanno bombardati.
2. Inserire due cesti dell'omogeneizzatore perlina (fino a 48) 2,0 mL provette (Vedi Tabella materiali). Montare i rack sull'omogeneizzatore.
3. Agitare i campioni a 30 Hz per 3 minuti.
4. Rimuovere il rack omogeneizzatore dall'omogeneizzatore e metterli su ghiaccio (5 min) per ri-raffreddare i campioni.
5. Montare i rack torna sull'omogeneizzatore - nell'orientamento opposto. Agitare nuovamente i campioni a 30 Hz per 3 minuti.
6. Raffreddare le cremagliere su ghiaccio, quindi ripetere i passaggi 5.3 a 5.5. Questo aggiungerà fino a un totale di 12 minuti di agitazione.
7. Centrifugare gli estratti di grano a 16.000 x g a 4 ° C per 10 minuti.
8. Decantare immediatamente dopo la centrifugazione, i sovranatante chiari in un secondo set di tubi per microcentrifuga. Dare ogni tubo un vortice veloce. Conservare i capillari sul ghiaccio.
9. Dopo aver trasferito il supernatante, recuperare le sfere d'acciaio dai pellet così possono essere lavati e riutilizzati.

6. misurazione di attività luciferasica da estratti di grano

1. Per ogni provetta di estrazione grana deve essere analizzato, preparare una provetta di vetro 12 mm x 75 mm contenente 200 μL di miscela di Luciferase Assay (45 mM Tris pH 7,7, 15 mM MgCl₂, 20mm DTT, 1,5 mM EDTA, luciferina di 1 mM, 1 mM ATP del solfato).
2. Aggiungere 100 μL del primo estratto di grano per il primo tubo di dosaggio. Vortice rapidamente per mescolare bene. Immediatamente inserire il tubo nel supporto del tubo del luminometro e chiudere la porta. Quando la misurazione è terminata, estrarre il tubo dal luminometro – lasciando la porta aperta per il posizionamento del tubo successivo.
3. Ripetere questo processo fino a quando tutti i campioni sono stati misurati.

7. misurazione dell'attività GUS da estratti di grano

1. Aggiungere 200 μL di tampone del saggio GUS (50mm Na fosfato pH 7.2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µ g/mL leupeptina, 20% metanolo, 0,02% di sodio azide) in ciascun pozzetto di una piastra ben 96.
2. Mettere 50 μL di ogni estrazione grana nella corrispondente bene. Mescolare con la punta dopo l'aggiunta. Sigillare la parte superiore con pellicola sigillante.
3. Incubare la piastra ben 96 a 37 ° C al buio per 20 ore.
4. Centrifugare la piastra ben 96 a 4.000 x g a 4 ° C per 10 minuti e posizionarlo sul ghiaccio.
5. Aggiungere 250 μL di 0,2 M Na₂CO₃ in ciascun pozzetto di una piastra ben nero 96.
6. Aggiungere 6,25 μL di ogni miscela di analisi GUS centrifugato nella corrispondente bene (contenente 0,2 M Na₂CO₃) del nero 96 ben piatto. Mescolare con la punta dopo l'aggiunta. Includono i pozzetti con 6,25 μL di 10 μM, 40 μM e 100 μM 4-methylumbelliferone come standard.
7. Posizionare la piastra nera in un fluorometro di piastra e leggere la fluorescenza di methylumbelliferone. Prendere le letture ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 460 nm. Impostare il guadagno dello strumento tale che un contenente 6,25 μL di 40 μM 4-methylumbelliferone e 250 μL di 0,2 M Na₂CO₃ dà una lettura di 1000 unità di fluorescenza.

8. analisi dei dati

1. Immettere i valori per la luciferasi e dosaggi di GUS in un foglio di calcolo. Escludere dalla considerazione qualsiasi campione con una lettura di luciferasi inferiore a 20.000 luminescenza relativa unità s^-1, come questo indica che i costrutti genici non sono stati recapitati correttamente per le cellule di aleurone.
2. Per ogni granello con successo hanno bombardato l'Estratto (che rappresenta un gruppo di quattro grani embryoless), calcolare l'espressione di GUS normalizzato dai dati grezzi di GUS e luciferasi come segue: normalizzato GUS = [(espressione di GUS - GUS vuoto) x (2.000.000)] / (luciferase espressione – luciferasi in bianco).
   Nota: Questo normalizza la quantità di attività di GUS a quanto sarebbe stato osservato in un bombardamento che ha dato una lettura di luciferasi di 2.000.000.
3. Segnalare il livello relativo di espressione di un costrutto particolare reporter in presenza di costrutti effettrici o trattamenti ormonali in fase di test confrontando il livello di espressione in assenza di effettori o ormoni.

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Risultati

La tecnica qui descritta può essere utilizzata per introdurre qualsiasi costruzione di prova gene nelle cellule di aleurone di chicchi d'orzo. Il livello di espressione dal gene test quindi può essere convenientemente misurato (Figura 2). Il protocollo di throughput superiore descritto qui notevolmente aumenta l'efficienza del seme macinazione e la procedura di analisi enzima. Questo metodo è stato utilizzato per valutare la capacità del fattore di trascr...

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Discussione

L'introduzione del gene dell'effettore costrutti tramite bombardamento di particelle, seguita dall'espressione transitoria di costruzioni del reporter è una strategia importante per il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA e nel gene ormone-regolata risultante di dissezione espressione.
Tuttavia, i protocolli esistenti per lo svolgimento di tali esperimenti in orzo aleuronico cellule^2,3,4,

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Himalaya barley grains	/	/	A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate	Sigma	S2378	Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution	home made	/	20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol	Sigma	C0378	Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm)	Whatman	1001 090	Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates	home made	/	Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed)	Fisher	13-812-42	Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point)	Fisher	12-000-122	Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine	Sigma	S0266	Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi)	BioRad	1652331
stopping screens	BioRad	1652336
macrocarrier holders	BioRad	1652322
Biolistic particle delivery system	BioRad	PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic	Sigma	S9763	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2	home made	/	Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin	Sigma	L2884	Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol	Sigma	G5516	Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer	home made	/	Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL tubes	Eppendorf	22363352	This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75 mm glass test tubes	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid	Sigma	258105	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7	home made	/	Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride	Sigma	M9397	Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB)	home made	/	Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture	home made	/	Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide	Sigma	S8032	Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard)	Fisher	12565501
GUS assay buffer	home made	/	Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film	USA Scientific	2921-1000
96 well plates (black)	Costar	3916
sodium carbonate	Sigma	S7795	Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader	Bio-Tek	FLX-800